QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA Packungsbeilage 2 x 96 (Katalog-Nr )

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1 QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA Packungsbeilage 2 x 96 (Katalog-Nr ) 20 x 96 (Katalog-Nr ) IFN-γ-Test für Vollblut zur Messung der Reaktion auf die Peptidantigene ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) In-vitro-Diagnostikum , Cellestis, a QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Australien Telefon: (Australien) QIAGEN GmbH, QIAGEN-Straße Hilden, DEUTSCHLAND Rev. 01

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3 Inhalt 1. Verwendungszweck 4 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests 4 Testprinzip 5 Zeitbedarf für den Test 6 3. Komponenten und Aufbewahrung 6 Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien 7 Lagerung und Handhabung 8 4. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 9 In-vitro-Diagnostikum 9 Warnhinweise 9 Vorsichtsmaßnahmen Probennahme und -handhabung Gebrauchsanweisung 14 Teil 1 Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas 14 Teil 2 ELISA für humanes IFN-γ Berechnungen und Auswertung des Tests 20 Erstellung der Standardkurve 20 Qualitätskontrolle des Tests Grenzen des Verfahrens Leistungsmerkmale 23 Klinische Studien Technische Informationen 27 Uneindeutige Ergebnisse 27 Geronnene Plasmaproben 27 Hilfe zur Fehlerbehebung Literatur Technischer Service Kurzanleitung 34 Teil 1 Inkubation der Blutproben 34 Teil 2 IFN-γ-ELISA 34 Wesentliche Veränderungen 36 QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 3

4 1. Verwendungszweck QuantiFERON-TB Gold (QFT ) ist ein In-vitro-Diagnostikum zur Stimulation von Zellen in heparinisiertem Vollblut. Hierzu wird ein Peptid-Cocktail verwendet, der die Proteine ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) simuliert. Die In-vitro-Reaktion auf diese Peptid-Antigene, die in Zusammenhang mit einer Infektion durch Mycobacterium tuberculosis steht, wird durch Nachweis von Interferon γ (IFN-γ) mittels ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) festgestellt. QFT ist ein indirekter Test auf Infektionen mit M. tuberculosis (einschließlich der aktiven Erkrankung) und ist zur Verwendung in Kombination mit der Risikoabschätzung, Röntgenuntersuchungen und anderen medizinischen und diagnostischen Verfahren vorgesehen. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Tuberkulose ist eine übertragbare Krankheit, die durch eine Infektion mit Organismen des M.- tuberculosis-komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) verursacht wird. Die Ansteckung durch Personen, die an Tuberkulose der Atemwege leiden, erfolgt in der Regel über eine Tröpfcheninfektion. Bei neu infizierten Personen kann Wochen oder Monate später eine Tuberkulose-Erkrankung auftreten, bei den meisten Infizierten treten jedoch keine Beschwerden auf. Bei einigen persistiert eine latente Tuberkulose-Infektion (LTBI), eine nicht übertragbare, asymptomatische Erkrankung, die erst Monate oder Jahre später zum Ausbruch kommen kann. Der Hauptzweck der Erkennung der LTBI besteht darin, eine Behandlung zur Prävention des Ausbruchs der Tuberkulose-Erkrankung in Betracht zu ziehen. Bis vor kurzem war der Tuberkulin-Hauttest (THT) die einzige verfügbare Methode zur Diagnose der LTBI. Die kutane Sensitivität für Tuberkulin entsteht 2 bis 10 Wochen nach der Infektion. Jedoch reagieren einige Infizierte nicht auf Tuberkulin, darunter z. B. Patienten mit einer gestörten Immunreaktion infolge anderer Erkrankungen, aber auch Patienten ohne solche Erkrankungen. Umgekehrt weisen jedoch einige Personen, bei denen eine Infektion mit M. tuberculosis unwahrscheinlich ist, eine Tuberkulin-Sensitivität auf und erzielen ein positives Testergebnis im Tuberkulin-Hauttest, beispielsweise nach der BCG-Impfung, nach Infektion mit anderen, nicht dem M.-tuberculosis-Komplex zugehörigen, Mykobakterien oder aufgrund unbekannter anderer Faktoren. Die LTBI muss von der meldepflichtigen Tuberkulose-Erkrankung abgegrenzt werden, bei der in der Regel die Lunge und die unteren Atemwege betroffen sind, jedoch auch andere Organsysteme betroffen sein können. Die Diagnose der Tuberkulose-Erkrankung erfolgt aufgrund der Ergebnisse von Anamnese und ärztlicher Untersuchung sowie aufgrund radiologischer, histologischer und mykobakteriologischer Untersuchungsergebnisse. Mit dem QFT-Test wird die zellvermittelte Immunreaktion auf Peptidantigene, welche Mykobakterienproteine simulieren, gemessen. Diese Proteine (ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4)) fehlen in allen BCG-Stämmen und den meisten nicht-tuberkulösen Mykobakterien mit Ausnahme von M. kansasii, M. szulgai und M. marinum.(1) Bei Personen, die mit Organismen des M.-tuberculosis-Komplexes infiziert sind, liegen im Allgemeinen Lymphozyten im Blut vor, die diese und andere mykobakterielle Antigene erkennen. Bei diesem Erkennungsprozess wird das Zytokin IFN-γ von den Zellen produziert und sezerniert. Der Nachweis und die anschließende Quantifizierung von IFN-γ bilden die Grundlage dieses Tests. 4 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

5 Die im QFT-Test verwendeten Antigene sind ein Peptidcocktail, der die Proteine ESAT-6, CFP- 10 und TB7.7(p4) simuliert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass diese Peptidantigene die IFN-γ-Reaktion in den T-Zellen von mit M. tuberculosis infizierten Personen stimulieren, jedoch in der Regel nicht die T-Zellen von nicht infizierten oder BCG-geimpften Personen ohne Tuberkulose-Erkrankung oder LTBI-Risiko.(1-32) Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die IFN-γ-Reaktion durch medizinische Behandlungen oder Erkrankungen, die die Immunfunktion beeinträchtigen, verringert wird. Patienten mit bestimmten anderen Mykobakterieninfektionen können ebenfalls auf ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) reagieren, da die Gene, die diese Proteine kodieren, auch bei M. kansasii, M. szulgai und M. marinum vorhanden sind.(1, 23) Der QFT-Test ist zum einen zum Nachweis einer LTBI geeignet und zum anderen eine wertvolle Hilfe bei der Diagnose einer Infektion mit dem M.-tuberculosis-Komplex bei erkrankten Patienten. Ein positives Testergebnis unterstützt die Diagnose einer Tuberkulose- Erkrankung; jedoch kann es auch durch Infektionen mit anderen Mykobakterien (z. B. M. kansasii) hervorgerufen werden. Für die Bestätigung bzw. den Ausschluss einer Tuberkulose- Erkrankung sind weitere medizinische und diagnostische Untersuchungen erforderlich. Testprinzip Das QFT-System beinhaltet spezielle Blutentnahmeröhrchen, in die die Vollblutproben entnommen werden. Die anschließende Inkubation der Blutproben im Röhrchen dauert 16 bis 24 Stunden. Danach wird das Plasma entnommen und auf das Vorliegen von IFN-γ untersucht, das gegebenenfalls in Reaktion auf die Peptidantigene gebildet wurde. Der QFT-Test wird in zwei Teilen durchgeführt. Zunächst wird Vollblut in jedes der drei QFT- Blutentnahmeröhrchen abgenommen. Dabei handelt es sich um ein Negativkontrolle- Röhrchen (Nil Control), ein TB-Antigen-Röhrchen und ein Mitogen-Röhrchen. Das Mitogen-Röhrchen kann im QFT-Test als Positivkontrolle verwendet werden. Dies kann insbesondere in Fällen wichtig sein, in denen der Immunstatus des Patienten fraglich ist. Das Mitogen-Röhrchen kann auch als Kontrolle für den korrekten Umgang mit der Blutprobe und für die korrekte Inkubation eingesetzt werden. Die Röhrchen sollten so schnell wie möglich, jedoch spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, bei 37 C inkubiert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 bis 24 Stunden werden die Röhrchen dann zentrifugiert, das Plasma wird abgenommen und die Menge an IFN-γ (IU/ml) wird mittels ELISA gemessen. Der Test gilt als positiv für die IFN-γ-Reaktion, wenn der Messwert des TB-Antigen-Röhrchens (IFN-γ in IU/ml) signifikant über dem Wert der Negativkontrolle (Nil) liegt. Bei Verwendung des Mitogen-Röhrchens dient die mitogenstimulierte Plasmaprobe als IFN-γ-Positivkontrolle für die jeweils getestete Probe. Wenn eine Blutprobe eine negative Reaktion auf die TB- Antigene zeigt, weist eine ebenfalls nur geringe Reaktion auf das Mitogen (< 0,5 IU/ml) auf ein uneindeutiges Ergebnis hin. Ein solches Muster kann auftreten bei ungenügender Lymphozytenzahl, verringerter Lymphozytenaktivität infolge unsachgemäßer Probenbehandlung, unsachgemäßem Befüllen oder Mischen des Mitogen-Röhrchens oder dann, wenn die Lymphozyten des Patienten nicht in der Lage sind, IFN-γ zu produzieren. Die Negativkontrolle dient der Hintergrundkorrektur, der Korrektur für Effekte etwaiger heterophiler Antikörper sowie der Korrektur für unspezifisches IFN-γ in der Blutprobe. Der QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 5

6 IFN-γ-Wert des Negativkontrolle-Röhrchens wird vom IFN-γ-Wert des TB-Antigen-Röhrchens und vom IFN-γ-Wert des Mitogen-Röhrchens (sofern verwendet) abgezogen. Zeitbedarf für den Test Nachstehend finden Sie Angaben zur geschätzten Dauer des QFT-Tests sowie zur erforderlichen Zeit bei der gleichzeitigen Untersuchung mehrerer Proben. Inkubation der Blutröhrchen bei 37 C: ELISA: 16 bis 24 Stunden Etwa 3 Stunden für eine ELISA-Platte (28 bis 44 Patienten) < 1 Stunde Arbeitszeit Plus 10 bis 15 Minuten pro zusätzliche Platte 3. Komponenten und Aufbewahrung Blood Collection Tubes (Blutentnahmeröhrchen)* 300 Röhrchen 200 Röhrchen 100 Röhrchen Katalog-Nr. T T Anzahl Präparationen QuantiFERON Nil Tube (Negativkontrolle-Röhrchen, grauer Deckel, weißer Ring) 100 Röhrchen 100 Röhrchen QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-Antigen-Röhrchen, roter Deckel, weißer Ring) QuantiFERON Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen, lila Deckel, weißer Ring) 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen Packungsbeilage für QFT-Blutentnahmeröhrchen High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (Blutentnahmeröhrchen für Höhen zwischen 1020 und 1875 m)* 300 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen Katalog-Nr. T T QuantiFERON HA Nil Tube (Negativkontrolle-Röhrchen für große Höhen, grauer Deckel, gelber Ring) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (TB-Antigen- Röhrchen für große Höhen, roter Deckel, gelber Ring) QuantiFERON HA Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen für große Höhen, lila Deckel, gelber Ring) 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen Packungsbeilage für QFT-Blutentnahmeröhrchen * Nicht alle Produktkonfigurationen sind in allen Ländern erhältlich. Wenden Sie sich bitte an den Kundenservice von QIAGEN (Details im Internet unter um zu erfahren, welche Konfigurationen für Sie bestellbar sind. 6 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

7 Komponenten des ELISA 2 Plate Kit ELISA (Kit mit 2 ELISA-Platten) Reference Lab Pack (Packung für Referenzlabore) Katalog-Nr Microplate Strips (Mikrotiterstreifen [12 x 8 Wells], beschichtet mit murinen monoklonalen Antikörpern gegen humanes IFN-γ) Human IFN-γ Standard, lyophilized (Humaner IFN-γ Standard, lyophilisiert, enthält rekombinant hergestelltes humanes IFN-γ, Rindercasein, 0,01 % w/v Thimerosal) 2 Sätze von je 12 8-Well- Mikrotiterstreifen 1 Fläschchen (8 IU/ml nach Rekonstitution) 20 Sätze von je 12 8-Well- Mikrotiterstreifen 10 Fläschchen (8 IU/ml nach Rekonstitution) Green Diluent (grüne Verdünnungslösung, enthält Rindercasein, normales Mausserum, 0,01 % w/v Thimerosal) 1 x 30 ml 10 x 30 ml Conjugate 100X Concentrate, lyophilized (Konjugatkonzentrat, 100-fach konzentriert, lyophilisiert, murines Antikörper-HRP-Konjugat gegen humanes IFN-γ, enthält 0,01 % w/v Thimerosal) 1 x 0,3 ml (nach Rekonstitution) 10 x 0,3 ml (nach Rekonstitution) Wash Buffer 20X Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 20-fach konzentriert, ph 7,2, enthält 0,05 % v/v ProClin 300) Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung, enthält H 2O 2, 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin) Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung, enthält 0,5 M H 2SO 4) 1 x 100 ml 10 x 100 ml 1 x 30 ml 10 x 30 ml 1 x 15 ml 10 x 15 ml Packungsbeilage für QFT-ELISA 1 1 Enthält Schwefelsäure. Siehe die Sicherheitshinweise auf Seite 10. Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien 37 C-Inkubator. CO 2 nicht erforderlich Kalibrierte Pipetten mit variablem Volumen für Volumina von 10 µl bis 1000 µl, mit Einwegspitzen Kalibrierte Mehrkanalpipette zur Abgabe von 50 µl und 100 µl, mit Einwegspitzen Schüttler für Mikrotiterplatten Entionisiertes oder destilliertes Wasser (2 Liter) Waschgerät für Mikrotiterplatten (vorzugsweise automatisiert) Mikrotiterplatten-Photometer mit 450-nm-Filter und Referenzfilter bei 620 bis 650 nm QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 7

8 Lagerung und Handhabung Blutentnahmeröhrchen Blutentnahmeröhrchen bei 4 C bis 25 C lagern. Reagenzien des Kits Reagenzien des Kits im Kühlschrank bei 2 C bis 8 C lagern. Die Enzymsubstratlösung stets vor direkter Sonneneinstrahlung schützen. Rekonstituierte und nicht verbrauchte Reagenzien Anweisungen zur Rekonstitution der Reagenzien finden Sie in Kapitel 6 (Seite 14). Der rekonstituierte Kitstandard ist bei Lagerung bei 2 C bis 8 C 3 Monate lang haltbar. Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Kitstandards. Das 100x Konjugatkonzentrat muss nach Rekonstitution bei 2 C bis 8 C gelagert und innerhalb von drei Monaten aufgebraucht werden. Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Konjugats. Gebrauchsfertig verdünntes Konjugat muss innerhalb von 6 Stunden nach Zubereitung verwendet werden. Gebrauchsfertig verdünnter Waschpuffer ist bei Raumtemperatur bis zu 2 Wochen lang haltbar. 8 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

9 4. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen In-vitro-Diagnostikum Warnhinweise Ein negatives Ergebnis im QFT-Test schließt die Möglichkeit einer Infektion mit M. tuberculosis und einer Tuberkulose-Erkrankung nicht aus; falsch-negative Ergebnisse können bedingt sein durch die Infektionsphase (z. B. wenn die Blutprobe vor der Entwicklung der zellulären Immunreaktion entnommen wurde), Störungen der Immunfunktion durch andere Erkrankungen, unsachgemäße Handhabung der Röhrchen nach der Blutentnahme, unrichtige Testdurchführung oder andere immunologische Variablen. Ein positives Ergebnis im QFT-Test sollte nicht als alleinige Grundlage für die Diagnose einer Infektion mit M. tuberculosis dienen; durch unrichtige Testdurchführung kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen. Ein positives Ergebnis im QFT-Test sollte durch weitere medizinische und diagnostische Untersuchungen abgeklärt werden, um zu bestimmen, ob eine aktive Tuberkulose-Erkrankung vorliegt (z. B. durch Abstrich und Kultur, Röntgen-Thorax). Zwar kommen ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) in den BCG-Stämmen und in den meisten bekannten nicht-tuberkulösen Mykobakterien nicht vor, ein positives Ergebnis im QFT-Test kann aber auch auf eine Infektion mit M. kansasii, M. szulgai oder M. marinum zurückzuführen sein. Werden solche Infektionen vermutet, sind alternative Testmethoden einzusetzen. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 9

10 Vorsichtsmaßnahmen Nur zum diagnostischen Gebrauch in vitro. Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Einmal- Laborhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den entsprechenden Sicherheitsdatenblättern entnehmen (safety data sheets, SDS). In unserer Online-Sammlung der Sicherheitsdatenblätter unter finden Sie zu jedem QIAGEN-Kit und zu jeder Kit-Komponente das jeweilige SDS als PDF-Datei, die Sie einsehen und ausdrucken können. VORSICHT: Behandeln Sie Humanblutproben stets als potenziell infektiös. Beachten Sie die einschlägigen Richtlinien zum Umgang mit Blut. Die folgenden Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge (R- und S-Sätze) gelten für einzelne Komponenten des QuantiFERON-TB Gold ELISA: QuantiFERON Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung) Xi Enthält Schwefelsäure: Reizend. R- und S-Sätze:* R36/38, S26, S36/37/39 Green Diluent (grüne Verdünnungslösung) enthält normales Mausserum und Casein; diese Substanzen können unter Umständen allergische Reaktionen auslösen; Berührung mit der Haut vermeiden. Bei chemischen Notfällen Verschütten, Leckagen, Exposition und Unfällen rufen Sie rund um die Uhr CHEMTREC an In den USA und Kanada: Außerhalb von USA und Kanada: (R-Gespräche werden angenommen) Weitere Informationen Sicherheitsdatenblätter: Abweichungen von den Instruktionen der Packungsbeilage des QuantiFERON- TB Gold (QFT) ELISA können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Bitte lesen Sie die Anweisungen vor Gebrauch sorgfältig durch. Verwenden Sie den Kit nicht, wenn Reagenzienflaschen vor Gebrauch beschädigt oder undicht erscheinen. * R36/38: Reizt die Augen und die Haut; S26: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren; S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. 10 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

11 Die folgenden Reagenzien und Komponenten dürfen nicht aus unterschiedlichen Chargen des QFT-Kits verwendet oder gemischt werden: Mikrotiterstreifen, humaner IFN-γ-Standard, grüne Verdünnungslösung und 100x Konjugatkonzentrat. Die anderen Reagenzien (20x Waschpufferkonzentrat, Enzymsubstratlösung und Enzymstopplösung) können zwischen verschiedenen Kits ausgetauscht werden, solange das Verfallsdatum der einzelnen Reagenzien nicht abgelaufen ist und die Angaben zu den jeweiligen Chargen dokumentiert werden. Nicht benötigte Reagenzien und biologische Proben sind gemäß den örtlichen und nationalen Vorschriften zu entsorgen. Nach Ablauf des Verfallsdatums dürfen die Blutentnahmeröhrchen und der ELISA-Kit nicht mehr verwendet werden. Stellen Sie vor Gebrauch sicher, dass alle Laborgeräte wie Plattenwaschgerät und Mikrotiterplatten-Photometer kalibriert/validiert wurden. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/

12 5. Probennahme und -handhabung Im QFT-Test werden die folgenden Blutentnahmeröhrchen verwendet: 1. QuantiFERON Nil (Negativkontrolle-Röhrchen, grauer Deckel mit weißem Ring, für Höhenlagen von 0 bis 810 m) 2. TB Antigen (TB-Antigen-Röhrchen, roter Deckel mit weißem Ring, für Höhenlagen von 0 bis 810 m) 3. QuantiFERON Mitogen (Mitogen-Röhrchen, lila Deckel mit weißem Ring, für Höhenlagen von 0 bis 810 m) Röhrchen für große Höhen (HA Tubes) 4. QuantiFERON HA Nil (Negativkontrolle-Röhrchen für große Höhen, grauer Deckel mit gelbem Ring, für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m) 5. HA TB Antigen (TB-Antigen-Röhrchen für große Höhen, roter Deckel mit gelbem Ring, für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m) 6. QuantiFERON HA Mitogen (Mitogen-Röhrchen für große Höhen, lila Deckel mit gelbem Ring, für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m) Die Antigene befinden sich in getrockneter Form in der Beschichtung der Innenwand der Blutentnahmeröhrchen. Daher müssen die Blutproben sorgfältig mit dem Inhalt des Röhrchens vermischt werden. Die Röhrchen müssen so schnell wie möglich, jedoch spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen 37 C-Inkubator überführt werden. Für optimale Ergebnisse sollte das folgende Verfahren befolgt werden: 1. Nehmen Sie von jedem Patienten per Venenpunktion je 1 ml Blut direkt in jedes der QFT-Blutentnahmeröhrchen ab. Diese Prozedur darf nur von einer entsprechend ausgebildeten Fachkraft durchgeführt werden. Bis zu einer Höhe von 810 m sollten die Standard-QFT-Blutentnahmeröhrchen benutzt werden. In Höhenlagen zwischen 1020 m und 1875 m sollten die speziellen HA-QFT-Blutentnahmeröhrchen für große Höhen verwendet werden. Bei Verwendung der QFT-Blutentnahmeröhrchen außerhalb dieser Höhenbereiche oder falls zu wenig Blut in ein Röhrchen aufgenommen wird, kann das Blut beim Patienten mit einer Spritze abgenommen und dann sofort je 1 ml in jedes der 3 Röhrchen überführt werden. Aus Sicherheitsgründen nimmt man hierzu am besten unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen die Nadel von der Spritze, nimmt dann die Deckel von den 3 QFT-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut (bis zur seitlichen schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett). Anschließend werden die Röhrchen wieder sorgfältig mit den Deckeln verschlossen und wie nachstehend beschrieben gemischt. Da die 1-ml-Röhrchen das Blut relativ langsam aufnehmen, belassen Sie das Röhrchen nach dem scheinbaren Erreichen des Füllstands bitte noch 2-3 Sekunden auf der Nadel, um zu gewährleisten, dass die erforderliche Blutmenge entnommen wurde. Die schwarze Markierung seitlich am Röhrchen ist die 1-ml-Fülllinie. Die QFT- Blutentnahmeröhrchen wurden für Volumina von 0,8 bis 1,2 ml validiert. Falls sich 12 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

13 der Füllspiegel des Bluts nicht nahe an dieser Indikatorlinie befindet, empfiehlt es sich, eine neue Blutprobe zu entnehmen. Bei Verwendung einer Butterfly-Nadel zur Blutentnahme ist mit Hilfe eines Leerröhrchens sicherzustellen, dass die Schlauchverbindung mit Blut gefüllt ist, bevor die QFT-Röhrchen verwendet werden. Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahmeröhrchen, das Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und anschließend in die QFT- Röhrchen überführt werden. Verwenden Sie ausschließlich Lithium-Heparin als Blut- Antikoagulans, da andere Antikoagulantien den Test beeinträchtigen. Füllen Sie ein Blutentnahmeröhrchen (Mindestvolumen 5 ml) und durchmischen Sie den Inhalt behutsam, indem Sie das Röhrchen mehrere Male über Kopf schwenken, um das Heparin zu lösen. Das Blut sollte bei Raumtemperatur gelagert werden (22 C ± 5 C), bis es zur Inkubation in die QFT-Röhrchen überführt wird. Das Überführen in die QFT-Röhrchen zur Inkubation muss innerhalb von 16 Stunden nach der Blutentnahme erfolgen. 2. Schütteln Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Befüllung zehnmal (10x) gerade so stark, dass die gesamte Innenwand des Röhrchens mit Blut bedeckt ist, um die Antigene an der Röhrchenwand zu lösen. Die Röhrchen sollten bei der Befüllung mit Blut eine Temperatur zwischen 17 C und 25 C aufweisen. Zu heftiges Schütteln kann das Gel zerstören und so zu falschen Ergebnissen führen. Wurde das Blut mit Heparin-Röhrchen entnommen, müssen die Proben vor dem Überführen in die QFT-Röhrchen gleichmäßig gemischt sein. Um dies sicherzustellen, müssen die Röhrchen direkt vor dem Transfer behutsam über Kopf geschwenkt werden. Geben Sie 1,0-ml-Aliquots (eines pro QFT-Röhrchen) in geeignete Negativkontrolle-, TB-Antigen- und Mitogen-Röhrchen. Aus Sicherheitsgründen nimmt man hierzu am besten unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen und aseptischer Techniken die Nadel von der Spritze, nimmt dann die Deckel von den drei QFT-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut (bis zur seitlichen schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett). Anschließend werden die Röhrchen wieder sorgfältig mit den Deckeln verschlossen und wie oben beschrieben gemischt. 3. Beschriften Sie die Röhrchen in geeigneter Weise. Stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen (Negativkontrolle, TB-Antigen, Mitogen) nach dem Entfernen des Deckels anhand des Etiketts oder auf andere Weise identifiziert werden kann. 4. Nach dem Befüllen, Schütteln und Beschriften müssen die Röhrchen so schnell wie möglich, und spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37 C ± 1 C überführt werden. Lagern Sie die Röhrchen bis zur Inkubation bei Raumtemperatur (22 C ± 5 C). Bewahren Sie die Blutproben nicht im Kühlschrank oder Gefrierschrank auf. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/

14 6. Gebrauchsanweisung Teil 1 Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas Im Lieferumfang enthaltene Materialien QFT-Blutentnahmeröhrchen (siehe Kapitel 3) Vom Anwender bereitzustellende Materialien Siehe Kapitel 3. Durchführung 1. Wenn die Inkubation der Blutproben nicht sofort anschließend an die Blutentnahme durchgeführt wird, müssen die Röhrchen unmittelbar vor der Inkubation erneut durch 10-maliges Über-Kopf-Schwenken gemischt werden. 2. Röhrchen STEHEND 16 bis 24 Stunden bei 37 C ± 1 C inkubieren. CO 2 und Befeuchtung sind im Inkubator nicht erforderlich. 3. Nach der Inkubation bei 37 C können die Blutentnahmeröhrchen bis zur Zentrifugation bei 4 C bis 27 C bis zu 3 Tage lang aufbewahrt werden. 4. Nach der Inkubation der Röhrchen bei 37 C werden diese zur leichteren Entnahme des Plasmas für 15 Minuten bei 2000 bis 3000 xg (RCF) zentrifugiert. Die Gelbarriere trennt dabei die Zellen vom Plasma. Geschieht dies nicht, sollten die Röhrchen bei einer höheren Geschwindigkeit erneut zentrifugiert werden. Das Plasma kann auch ohne Zentrifugieren entnommen werden, jedoch muss hierbei sehr vorsichtig vorgegangen werden, um keine Zellen aufzuwirbeln. 5. Die Plasmaproben sollten nur mit einer Pipette entnommen werden. Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches Auf- und Abpipettieren oder Mischen vor Abnahme des Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das Material an der Oberfläche des Gels nicht aufgewirbelt wird. Die Plasmaproben können direkt aus den zentrifugierten Blutentnahmeröhrchen in die QFT-ELISA-Platte pipettiert werden, auch bei Verwendung eines ELISA-Automaten. Die Plasmaproben können bei 2 C bis 8 C bis zu 28 Tage lang gelagert werden. Nach Entnahme des Plasmas kann dieses auch für längere Zeit bei unter 20 C gelagert werden. Für eine einwandfreie Testdurchführung sollten mindestens 150 µl Plasma entnommen werden. 14 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

15 Teil 2 ELISA für humanes IFN-γ Im Lieferumfang enthaltene Materialien QFT-ELISA-Kit (siehe Kapitel 3) Vom Anwender bereitzustellende Materialien Siehe Kapitel 3. Durchführung 1. Alle Plasmaproben und Reagenzien, mit Ausnahme des 100x Konjugatkonzentrats, müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22 C ± 5 C) gebracht werden. Planen Sie für die Temperaturäquilibrierung mindestens 60 Minuten ein. 2. Nehmen Sie nicht benötigte Streifen aus dem Rahmen, geben Sie sie in die Folienverpackung zurück und lagern Sie sie bis zum Gebrauch im Kühlschrank. Sehen Sie mindestens einen Streifen für die QFT-Standards und eine ausreichende Anzahl von Streifen für die zu testenden Patienten vor (siehe Abbildungen 2A und 2B für die Verwendung von 3 bzw. 2 Röhrchen). Bewahren Sie nach Gebrauch den Rahmen und den Deckel für die verbleibenden Streifen auf. 3. Rekonstituieren Sie den gefriergetrockneten Kitstandard mit der auf dem Etikett des Standardfläschchens angegebenen Menge an entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie vorsichtig, um die Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass der Inhalt vollständig aufgelöst wurde. Durch Rekonstitution des Standards auf das angegebene Volumen erhält man eine Lösung mit einer Konzentration von 8,0 IU/ml. Hinweis: Das Rekonstitutionsvolumen des Kitstandards ist je nach Charge unterschiedlich. Verwenden Sie den rekonstituierten Kitstandard zur Herstellung einer 1:4- Verdünnungsreihe von IFN-γ in grüner Verdünnungslösung (Green Diluent, GD) (siehe Abbildung 1). S1 (Standard 1) enthält 4 IU/ml, S2 (Standard 2) enthält 1 IU/ml, S3 (Standard 3) enthält 0,25 IU/ml und S4 (Standard 4) enthält 0 IU/ml (nur GD). Die Standards sollten mindestens als Doppelbestimmung getestet werden. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/

16 Empfohlenes Verfahren für Doppelbestimmung der Standards a. 4 Röhrchen mit S1, S2, S3 bzw. S4 beschriften. b. Je 150 µl GD in S1, S2, S3 und S4 geben. c. 150 µl des Kitstandards in S1 geben und gründlich mischen. d. 50 µl von S1 in S2 überführen und gründlich mischen. e. 50 µl von S2 in S3 überführen und gründlich mischen. Empfohlenes Verfahren für Dreifachbestimmung der Standards a. 4 Röhrchen mit S1, S2, S3 bzw. S4 beschriften. b. 150 µl GD in S1 geben. c. Je 210 µl GD in S2, S3 und S4 geben. d. 150 µl des Kitstandards in S1 geben und gründlich mischen. e. 70 µl von S1 in S2 überführen und gründlich mischen. f. GD allein dient als Nullstandard (S4). f. 70 µl von S2 in S3 überführen und gründlich mischen. g. GD allein dient als Nullstandard (S4). Rekonstituierter Kitstandard Standard 1 4,0 IU/ml Standard 2 1,0 IU/ml Standard 3 0,25 IU/ml Standard 4 0 IU/ml (Grüne Verdünnungslösung) Abbildung 1. Herstellung der Standardkurve. Stellen Sie die Verdünnungen des Kitstandards für jeden ELISA-Durchgang frisch her. 4. Rekonstituieren Sie das gefriergetrocknete 100x Konjugatkonzentrat mit 0,3 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie das Fläschchen vorsichtig, um die Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass das Konjugat vollständig gelöst wurde. Das gebrauchsfertig verdünnte Konjugat wird hergestellt, indem Sie die erforderliche Menge des rekonstituierten 100x Konjugatkonzentrats wie in Tabelle 1 (Vorbereitung des Konjugats) angegeben in grüner Verdünnungslösung verdünnen. 16 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

17 Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats Anzahl der Streifen Menge an 100x Konjugatkonzentrat Menge an grüner Verdünnungslösung 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml µl 5,0 ml µl 5,5 ml µl 6,0 ml Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden. Nicht verbrauchtes 100x Konjugatkonzentrat sofort nach Gebrauch wieder bei 2 C bis 8 C lagern. Nur die grüne Verdünnungslösung verwenden. 5. Plasmaproben, die den Blutentnahmeröhrchen entnommen wurden und vor dem Test tiefgekühlt oder länger als 24 Stunden gelagert wurden, müssen vor dem Einbringen in die ELISA-Wells sorgfältig gemischt werden. Wenn die Plasmaproben direkt aus den zentrifugierten QFT-Röhrchen zugegeben werden, ist jedes Mischen des Plasmas zu vermeiden. 6. Geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette je 50 µl des frisch zubereiteten gebrauchsfertig verdünnten Konjugats in alle benötigten Wells der ELISA-Platte. 7. Geben Sie je 50 µl der Plasmaproben mit einer Mehrkanalpipette in die entsprechenden Wells (siehe empfohlener Plattenbelegungsplan auf Seite 18, Abbildungen 2A und 2B). Geben Sie schließlich je 50 µl der Standards 1 bis 4 in die entsprechenden Wells. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/

18 A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M Abbildung 2A. Empfohlene Plattenbelegung bei Verwendung von Negativkontrolle-, TB-Antigen- und Mitogen-Röhrchen (28 Tests pro Platte). S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4) 1N (Probe 1. Negativkontrolle-Plasma), 1A (Probe 1. TB-Antigen-Plasma), 1M (Probe 1. Mitogen-Plasma) A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A Abbildung 2B. Empfohlene Plattenbelegung bei Verwendung von Negativkontrolle- und TB- Antigen-Röhrchen (44 Tests pro Platte). S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4) 1N (Probe 1. Negativkontrolle-Plasma), 1A (Probe 1. TB-Antigen-Plasma) 8. Mischen Sie Konjugat und Plasmaproben/Standards 1 Minute lang gründlich auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten. 9. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten 120 ± 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 C ± 5 C). Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt sein. 10. Verdünnen Sie während der Inkubationszeit 1 Teil 20x Waschpufferkonzentrat mit 19 Teilen entionisiertem oder destilliertem Wasser und mischen Sie sorgfältig. Im 18 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

19 Lieferumfang ist ausreichend 20x Waschpufferkonzentrat zur Herstellung von 2 Litern gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer vorhanden. Waschen Sie die Wells mindestens 6-mal mit je 400 µl gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer. Wir empfehlen die Verwendung eines Waschautomaten für Mikrotiterplatten. Sorgfältiges Waschen ist für die Leistung des Tests sehr wichtig. Achten Sie bei jedem Waschzyklus darauf, dass alle Wells vollständig bis oben mit Waschpuffer gefüllt sind. Es empfiehlt sich, den Waschpuffer bei jedem Zyklus mindestens 5 Sekunden einwirken zu lassen. In den Auffangbehälter für Abfallflüssigkeit sollte ein laborübliches Desinfektionsmittel gegeben werden. Befolgen Sie zudem die in Ihrem Labor geltenden Anweisungen zur Dekontamination potenziell infektiösen Materials. 11. Klopfen Sie die Platten umgekehrt auf einem fusselfreien Papierhandtuch aus, um noch vorhandenen Waschpuffer zu entfernen. Geben Sie 100 µl der Enzymsubstratlösung in jedes Well und mischen Sie gründlich auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten. 12. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 C ± 5 C). Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt sein. 13. Geben Sie nach der 30-minütigen Inkubation 50 µl Enzymstopplösung in jedes Well und mischen Sie anschließend. Die Enzymstopplösung sollte in der gleichen Reihenfolge und etwa im gleichen Tempo in die Wells gegeben werden wie das Substrat in Schritt Messen Sie innerhalb von 5 Minuten nach Stoppen der Reaktion die optische Dichte (OD) jedes Wells mit einem Mikrotiterplatten-Photometer unter Verwendung eines 450-nm-Filters und eines Referenzfilters zwischen 620 und 650 nm. Die OD-Werte werden für die Berechnung der Ergebnisse benötigt. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/

20 7. Berechnungen und Auswertung des Tests Für die Analyse der Rohdaten und die Berechnung der Ergebnisse wird die QFT- Analysesoftware verwendet. Sie kann im Internet unter heruntergeladen werden. Bitte achten Sie darauf, immer mit der neuesten Version der Software zu arbeiten. Die Software führt eine Qualitätskontrolle des Tests durch, erstellt eine Standardkurve und liefert für jeden Patienten ein Testergebnis nach der im Abschnitt Interpretation der Ergebnisse beschriebenen Methode. Alternativ zur Verwendung der QFT-Analysesoftware können die Ergebnisse auch wie im Folgenden beschrieben ermittelt werden. Erstellung der Standardkurve (bei Nichtverwendung der QFT-Analysesoftware) Ermitteln Sie für jede Platte die mittleren OD-Werte der Kitstandard-Mehrfachbestimmungen. Erstellen Sie eine log(e)-log(e)-standardkurve durch Auftragen des log(e) des OD-Mittelwerts (y-achse) gegen den log(e) der IFN-γ-Konzentration der Standards in IU/ml (x-achse), unter Nichtberücksichtigung des Nullstandards. Berechnen Sie dann die Regressionsgerade für diese Punkte. Ermitteln Sie anhand der Standardkurve die IFN-γ-Konzentration (IU/ml) der einzelnen Plasmaproben anhand ihrer OD-Werte. Für diese Berechnungen können Software-Pakete für Mikrotiterplatten-Photometer verwendet werden oder gängige Tabellenkalkulations- und Statistik-Programme (wie beispielsweise Microsoft Excel ). Wir empfehlen die Verwendung solcher Software-Pakete zur Durchführung der Regressionsanalyse und zur Berechnung des Variationskoeffizienten (%CV) der Standards sowie des Korrelationskoeffizienten (r) der Standardkurve. Qualitätskontrolle des Tests Die Genauigkeit der Testergebnisse hängt von der Erstellung einer korrekten Standardkurve ab. Daher müssen die Ergebnisse der Standards vor Auswertung der Testergebnisse geprüft werden. Der ELISA liefert gültige Ergebnisse, wenn alle nachstehenden Kriterien erfüllt sind: Der Mittelwert der OD von Standard 1 muss 0,600 sein. Der prozentuale Variationskoeffizient (%CV) der OD-Werte der Mehrfachbestimmungen von Standard 1 und Standard 2 muss 15 % sein. Die OD-Werte der Mehrfachbestimmungen von Standard 3 und Standard 4 dürfen höchstens um 0,040 OD-Einheiten vom jeweiligen Mittelwert abweichen. Der aus den mittleren Absorptionswerten der Standards berechnete Korrelationskoeffizient (r) muss 0,98 sein. 20 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013

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