Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis und andere Nagetiermodelle für Multiple Sklerose

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1 Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis und andere Nagetiermodelle für Multiple Sklerose Ingo Kleiter St. Josef-Hospital, Klinik für Neurologie, Ruhr-Universität Bochum (RUB) Berlin,

2 Übersicht Multiple Sklerose und andere demyelinierende Erkr. des ZNS Geschichte der EAE Tiermodelle der MS Praktische Durchführung der EAE Belastungen durch EAE Erfolge und Misserfolge des experimentellen Modells Zusammenfassung 2

3 Multiple Sklerose (MS) Häufigste autoimmun-entzündliche Erkrankung des Menschen Neurodegenerative Komponente Weltweit 2.5 Mio., in D ca Patienten Erkrankungsbeginn meist LJ Frauen > Männer Häufigste Ursache für frühe und dauerhafte Behinderung Risikofaktoren: genet. Disposition, virale Infekte, Vit. D, Nikotin, Ernährung/Mikrobiom? 3 Compston, Lancet 2002

4 Messung der Behinderung bei MS EDSS (Expanded Disability Status Scale): Krankheitsskala von 0 10 zeigt Ausmaß der neurologischen Defizite (= Ausfälle ) 4 Kurztke, Neurology 1983

5 Histopathologie der Multiplen Sklerose Mikrogliaaktivierung Entzündungsinfiltrate 5 Demyelinisierung + Remyelinisierung Oligodendrozytenuntergang Axonale Schädigung

6 Immunpathologie der MS Erkennung Prägung Immunsystem MS-spez. verändert - MHC II - IL2R - IL7R DEGENERATION Wanderung Patrouille Immunzellen (Lymphozyten)? Antigen (Myelineiweiß) Gliose Entzündung Lokale Reaktivierung Periphere Aktivierung?? Einwanderung Infektion 6 Freisetzung Gehirn und Rückenmark

7 Spektrum autoimmun-entzündlicher Erkr. Zentrales Nervensystem Peripheres Nervensystem 7 MS und Varianten ADEM NMO Synaptische Autoimmunität (z.b. NMDAR) CIDP Paraneoplastisch GBS und Varianten Para-/post-infektiös Post-Vakzinierung MAG-PNP POEMS-Syndr. u.v.a Myasthenie LEMS

8 Geschichte der EAE 1885 Louis Pasteur gewinnt Tollwut- Impfstoff aus dem getrockneten Gehirn von infizierten Kaninchen 1925 Koritschoner und Schweinburg beobachten Paralyse von Kaninchen nach wiederholter Injektion von menschlichem Rückenmarkshomogenat Erste Berichte von Fällen von Paralyse nach Tollwut-Impfung Folie adaptiert von F. Lüder 1933 Thomas Rivers injiziert Affen mit Extrakten aus Kaninchenhirn (bis zu 85 mal) und beobachtet Paralyse und histologisch Infiltration sowie Demyelinisierung Rivers, JEM 1933

9 Tiermodelle der MS 1. Autoimmun-entzündliche Demyelinisierung (Marmoset-Affen) EAE: experimentelle allergische (autoimmune) Enzephalomyelitis nur in genetisch suszeptiblen Stämmen (z.b. C57B6, SJL, Biozzi) 2. Virus-induzierte Demyelinisierung Theiler-Virus (TMEV) Nagetiere u.v.a. Säugetiere 3. Chemische Demyelinisierung Cuprizone, Lysolecithin, u.a. Mausmodelle 9 4. Genetische Demyelinisierung Shiverer-Maus Knockout-Modelle für Myelinproteine (PLP, MOG, u.a.) Oligodendrozytendepletion durch Diphteriatoxin MS ist sehr heterogen, jedes Tiermodell deckt nur Teilaspekte der menschlichen Erkrankung ab

10 Heterogenität der EAE-Modelle aktive EAE (Immunisierung mit Myelinantigenen) passive EAE (Transfer Myelin-spezifischer T-Zellen) Myelin-Antigen-spezifischer T-Zell-Rezeptor (transgener TZR) Myelin-Antigen-spezifischer B-Zell-Rezeptor (transgener BZR) Transfer Myelin-spezifischer Antikörper, z.b. MOG-AK (zu aktiver EAE oder mit Myelin-spez. T-Zellen oder intrazerebral + LPS) Stereotaktische Injektion von TNFα/IFNγ in Corpus callosum in subklinisch immunisierten C57B6-Mäusen ( targeted EAE ) Humanisierte Modelle (humaner TZR, Übertragung humaner T-Zellen oder von KM auf RAG1-/-) klinischer Verlauf und Histopathologie abhängig von verwendetem Antigen/T-Zelllinie/TCR-Spezifität und Mausstamm 10

11 Praktische Durchführung der EAE Aktive EAE: aktive Immunisierung mit Myelin-Antigen: MOG (35-55) Peptid PLP ( ) Peptid MOG Protein u.v.a. Adoptive-transfer EAE: Immunisierung von Maus A (s.o.) Restimulation und Transfer von Myelin-spezifischen T-Zellen auf Maus B Mouse A Mouse B 11

12 Ablauf der aktiven Immunisierung Beispiel: EAE in C57/BL6 Mäusen 8-12 Wochen alte Tiere, wenn möglich nur weibl µg MOG (35-55) -Peptid in 200 µl einer 1:1 Emulsion aus Peptid (in PBS) und Komplettem Freund schen Adjuvans (KFA) + abgetötete Mykobakterien 2x 100 µl subcutan an den Flanken injiziert Immunisierung unter Anästhesie mit % Isofluran Am Tag der Immunisierung und nach 48h: ng Pertussistoxin intraperitoneal 12

13 Rolle der Adjuvantien 1. Freund sches Adjuvanz Aktivierung des angeborenen Immunsystems Lokaler Entzündungsreiz (Gefahr der Entstehung von Entzündung, Indurationen, Schmerzen und ulzerierende Nekrosen) 2. Inaktivierte Mykobakterien (=komplettes Freund sches Adjuvanz) Aktivierung des angeborenen Immunsystems Th1-Immunantwort (Voraussetzung für Induktion der EAE) 3. Pertussistoxin T-Zell-Aktivierung Öffnung der Blut-Hirn-Schranke Erhöht Inzidenz und Schweregrad der EAE 13

14 EAE Beispiel 14 Kleiter, JNI 2007

15 Transgene EAE-Modelle (ohne Immunisierung) 15 Ben-Nun, J Autoimmun 2014

16 Optikospinale Enzephalomyelitis (OSE) TZR und BZR für MOG spezifisch T Zelle: Vβ11 Kette B Zelle: IgH Kette - Keine Erkrankung bei Eradikation des Darm-Mikrobioms - Untersuchung autoimmuner Pathogenese im Darm? 16 Krishnomoorthy, JCI 2006 Berer, Nature 2011

17 Bewertung des Krankheitsverlaufs Tägliche Beurteilung von: 1. Gewicht 2. Allgemeinzustand (Fell, Körperhaltung, Körperöffnungen, u.a.) 3. Spontanverhalten (Schlafen, Reaktion auf Reize, Motorik, Koordination) 4. EAE Score bei klassischem EAE-Modell aufsteigende Paresen andere Modelle (z.b. at-eae mit Th17-Zellen, TCR MOG in SJL) zeigen u.a. cerebelläre Symptome 17

18 EAE Scoringsysteme 0 keine Symptome 1 schlaffe Schwanzlähmung 2 teilweise Lähmung der Hinterpfoten oder Ataxie 3 vollständige Lähmung (Plegie) der Hinterpfoten 4 zusätzlich Lähmung der Vorderpfoten 4.5 moribund 5 tot 0 Keine Symptome 1 reduzierter Schwanztonus 2 schlaffe Schwanzlähmung 3 Fehlen refelektorische Ausgleichbewegungen beim Gehen 4 Gangataxie, Hinterbeine nicht mehr ganz gestreckt 5 leichte Lähmung der Hinterbeine 6 Plegie eines Beines oder mittelgradige Lähmung beider Beine 7 Hinterbeine vollständig gelähmt (Plegie) 8 Beginnende Parese der Vorderbeine (Tetraparese) 9 Moribund 10 Wegen des Zustandes getötet; gestorben 18

19 Versorgung der Tiere Tiere werden täglich gewogen und beurteilt Die erkrankten Tiere werden in geeigneter Weise am Käfigboden mit Nahrung und Flüssigkeit versorgt, wenn die normale Futterbzw. Wasseraufnahme aufgrund der Lähmungen erschwert ist Bei der täglichen Beobachtung wird die Blasenentleerung bei Tieren mit Blasenentleerungsstörungen ggf. durch manuelles Ausmassieren unterstützt Abbruchkriterien werden beachtet und Tiere ggf. euthanasiert 19

20 Durch Immunisierung: KFA abgetötete Mycobakterien PTX Belastungen durch EAE Durch Erkrankung an sich: Lähmungen gestörte Nahrungsaufnahme gestörte Darm-/Blasenfunktion Bewegungsstörung (Ataxie) Beurteilung Belastungsintensität: mäßig, 1x, Dauer Minuten gering bis erheblich, Tage Durch Behandlung (medikamentös, o.a.): Injektionen (i.p., i.v.) Orale Gabe (schlundieren) meist gering, 1-2x tägl, Minuten mögliche NW der Therapie abhängig von Therapie 20

21 Definition von Abbruchkriterien Alle Parameter (Gewicht, AZ, Verhalten, EAE-Score) werden berücksichtigt Tiere mit kompletter Lähmung der Hinterpfoten (EAE-Score 3 bzw. 7), bzw. mit >20% Gewichtsabnahme zum Ausgangsgewicht bzw. mit sonstiger hochgradiger Belastung werden euthanasiert Auch das Vorhandensein mehrerer geringer bzw. mittelgradiger Belastungen kann zum Abbruch führen Während die Tiere am Gipfel der Erkrankung (Dauer bis mehrere Tage) mittel- bis hochgradiger Belastung ausgesetzt sind, ist das Ausmaß der ggf. nach dem ersten Schub dauernd bestehenden Symptomatik im allgemeinen deutlich geringer 21

22 Ziel: Vermeidung von Belastungen Fallzahlplanung und Verwendung ausreichender Gruppengröße um valide Aussagen zu erreichen und Wiederholungsversuche zu vermeiden Problem: Zucht transgener Tiere, Inzidenz EAE Sachgemäße Immunisierung zur Vermeidung Ulzerationen nur 1x immunisieren, weit auseinanderliegende Stellen an Flanken, Alkoholreinigung, Antigen sterilfiltrieren, Inokulum klein halten (< 100 µl) Erhöhung Inzidenz der Erkrankung durch Pertussistoxin Verwendung genetischer Modelle (z.b. OSE) ggf. aktiver Komparator statt Placeboarm 22

23 23 Bochum EAE Score Sheet

24 24 Bochum EAE Score Sheet

25 Erfolge und Misserfolge des Modells Beiträge zum Verständnis der Immunpathologie der MS (u.a. Th1, Th17, MHC, Blut-Hirn-Schranke) Entwicklung der meisten MS-Medikamente im EAE-Modell Table. The Long and Winding Road from Proof of Concept in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis to US Food and Drug Administration Approval: Ranging from a Quarter of a Century to More Than a Decade Therapeutic Year of Publication of Proof of Concept in EAE Year of FDA Approval Approved Indication Glatiramer Acetate Approved for RR-MS Mitoxantrone Approved for secondary progressive MS, worsening RR-MS Natalizumab withdrawn 2006 reinstated Approved for RR-MS EAE experimental autoimmune encephalomyelitis; FDA US Food and Drug Administration; RR-MS relapsing-remitting multiple sclerosis; MS multiple sclerosis. Nicht alle Ansätze ließen sich auf Menschen übertragen (IFN-gamma, TNF-alpha-Antag., anti-cd3, u.a.) lications have demonstrated the virtues of TNF itself, thus highlighting the pitfalls of blockade. 65 One reason for this confusion is that a molecule such as TNF may have janus-like effects, giving benefit in some aspects 25 Unterschiedliche Pharmakokinetik, u.a. für einige MS-Subtypen keine Modelle verfügbar for these drugs when used alone. 69,70 Other combinations of therapies might be tried in the EAE model, to search for synergies or unexpected adverse interactions. Drug development is not only costly, it is remark- Steinman, Ann Neurol 2006 Farooqi, J Neurochem 2010

26 Erkennung Prägung Immuntherapien der MS Immunsystem KM-Transplantation Antigen-basierte Therapie T-Zell-Rezeptor-Vakzinierung globale Immunsuppress. bzw. Immunmodulation:! IFN, GA! Mitoxantron! Fumarat! Laquinimod, Teriflunomid Antigen (Myelineiweiß) Fingolimod selektive Immunintervention:! Rituximab! Alemtuzumab! Daclizumab Lokale Reaktivierung Wanderung Patrouille Immunzellen (Lymphozyten) Periphere Aktivierung Infektion 26 Impfung? Freisetzung α4-integrin-antagonisten Einwanderung Gehirn und Rückenmark

27 Zusamenfassung Die EAE ist ein wichtiges Modell zur Erforschung entzündlicher und degenerativer Erkrankungen des ZNS Die EAE hat bereits einen wesentlichen Beitrag zur Klärung von Immunpathologie und Therapie der MS geleistet Sowohl MS wie EAE sind bezüglich ihrer Immunpathologie heterogen Unterschiedliche Modelle bilden jeweils Teilaspekte der MS ab Klassisches Modell ist die Immunisierung mit Myelinantigenen Belastungen durch EAE lassen sich reduzieren 27

28 Gerne beantworte ich ihre Fragen 28 Kleiter, St.Josef-Hospital Bochum

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