INAUGURAL DISSERTATION

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1 Aus dem Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Antimikrobielle Wirkung von Kiefernkernholz INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vorgelegt 2005 von Johannes Wirmer geboren in Frankfurt

2 Dekan Prof. Dr. med J. Zentner 1. Gutachter Prof. Dr. med F. D. Daschner 2. Gutachter PD Dr. med J. Hübner Jahr der Promotion 2005

3 Für meine Schwester Julia

4 Danksagung Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Daschner und Herrn Dr. Frank für die Überlassung des Themas, zur Verfügung Stellung der Materialien und des Labors. Beratung und Betreuung. Dank an Elke Schmidt-Eisenlohr für die sehr große Hilfe im Labor und beim Korrekturlesen, an alle MTAs des Institutes für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene, an die Firma Wilms für die zur Verfügung Stellung der Materialien, an Monika und Christine fürs Korrekturlesen, an Frau Lawrie-Blum für die ganze Koordination und dafür, dass sie dabei immer so nett ist, an Martin, ohne den gar nichts geht, an Eik für die gute Zeit im Labor (nicht nur), an die Sprösse der Rölz-Familie (einer war immer da), und natürlich an meine Familie für Alles.

5 1 Inhalt 1 Einleitung 2 2 Material und Methoden Versuchsbeschreibung Untersuchtes Material Testkeime Herstellung der Keimsuspension zur Kontamination der Materialien Probenahme Identifizierung der Keime Desinfektion Stellungnahme bezüglich statistischer Auswertungsverfahren Übersicht 9 3 Ergebnisse Mikrobielles Wachstum nach Inokulation Mikrobielles Wachstum nach Inokulation und anschließender Desinfektion Äthanol Glutaraldehyd (Buraton ) Glucoprotamin (Incidin Plus ) Quats + Biguanid (Sirafan ) Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse 26 4 Diskussion Diskussion der vohandenen Literatur über Holz Relevanz der eigenen Ergebnisse Grenzen und Fehlermöglichkeiten verwendeter Materialien Interpretation der Untersuchungsbefunde 34 5 Zusammenfassung 37 6 Anhang 38 7 Literaturhinweise 64

6 2 1 Einleitung Die folgende Arbeit untersucht die antimikrobiellen Eigenschaften von speziell behandeltem Kiefernkernholz im Vergleich zu Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten. Im Gegensatz zu Kunststoff, der für Modernität und Sauberkeit steht, wird Holz im Allgemeinen mit Natürlichkeit, aber eben auch Schmutz assoziiert. Dies führte dazu. dass die Verwendung von Holz im Zusammenhang mit der Verarbeitung von Lebensmitteln immer mehr von Kunststoff verdrängt wurde. In Krankenhäusern war Kunststoff von Anfang an verbreiteter, während Holz, wenn überhaupt, nur in lackierter Form oder mit Überzug aus Kunststoff (kunststoffbeschichtete Platten) vorkommt. Die hygienischen Vorbehalte gegen Holz wurden auch in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Publikationen bestätigt (Rödel et al., 1994, Borneff et al., 1988a und l988b; Gilbert und Watson, 1971; Kampelmacher et al., 1971). Es zeigte sich durch Untersuchungen der Keimgehalte auf den Oberflächen und in tiefer liegenden Holzschichten, dass sowohl ohne, als auch mit Reinigung das Keimvorkommen auf Holzflächen stets höher war als auf Metall- und Kunststoffflächen. Erklärt wurden die schlechten hygienischen Eigenschaften von Holz einmal mit dem fibrillären Aufbau der Zellwände und Zellhohlräumen, was zu einer sehr großen inneren Oberfläche führt. Die kapilläre Saugwirkung der Ring- und Tüpfelgefäße in der Holzoberfläche führt zu einer Absorption von Wasser mit Mikroorganismen ins Holzinnere, wo diese sich dann, vor Desinfektionsmitteln geschützt, vermehren können. Diese Studien berücksichtigten jedoch weder die Holzart, noch die Schnittrichtung, Holzfeuchtigkeit oder Vorbehandlung der untersuchten Holzmaterialien stellte das Food Research Institute in Wisconsin (USA) eine Studie vor, in der Brettchen aus Holz und Kunststoff verglichen wurden, und die zu dem Ergebnis kam, dass Holz wesentlich bessere hygienische Eigenschaften aufweist, und eine antimikrobielle Eigenschaft von Holz vermuten ließ (Ak et a a und 1994b). In der Studie von Rödel et al. (1994) wurden die Ergebnisse der amerikanischen Untersuchung nur teilweise bestätigt. Es zeigte sich jedoch, dass bestimmte Holzarten eine keimhemmende Wirkung besitzen. Die Untersuchungen von Schönwälder et al. (2000) zeigten, dass unverschmutztes Kiefernkernholz im Vergleich zu anderen Holzarten die besten antimikrobiellen Eigenschaften hat. Verantwortlich dafür ist die besondere Architektur des Materials Holz, das

7 3 durch seine hygroskope Wirkung den Bakterien Feuchtigkeit entzieht und sie dadurch abtötet, und der hohe Gehalt an sekundären Extraktstoffen in Kiefernholz, insbesondere von Tanninen (Polyphenole), die mikrobielle Enzyme inhibieren. Durch Verschmutzung der Holzoberflächen mit Fett nahm die antimikrobielle Eigenschaft jedoch ab; es konnten wieder mehr Keime nachgewiesen werden. Weiter wurde die Methode der destruktiven Keimzahlbestimmung durch Extraktion mit der Methode der Oberflächenkeimzahlbestimmung anhand des RODAC Abklatschverfahrens verglichen. Hier konnte bewiesen werden, dass, obgleich der Nachweis der Keime durch destruktive Extraktionsmethoden sensitiver ist, die Resultate von beiden Methoden korrelieren und deshalb Schlussfolgerungen von der Oberflächenkeimzahlbestimmung anhand der Abklatschmethode auf das Verhalten der Keimzahlen im Holzinnern zulassen. Auf Grundlage der oben genannten Erkenntnisse und noch immer existierenden Vorbehalte gegen Holz im Zusammenhang mit Hygiene, besonders im Krankenhaus, wurde in dieser Arbeit nun die Frage gestellt, ob die antimikrobielle Wirkung von Kiefernkernholz auch gegen typische nosokomiale Keime (Methicillin resistenter Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Mycobacterium terrae und Penicillium camembertii) nachweisbar ist. Außerdem wurde die antimikrobielle Wirkung in Verbindung mit im Krankenhaus eingesetzten Desinfektionsmitteln untersucht. Nach gegenwärtigen Richtlinien ist Holz im Krankenhaus, wenn überhaupt, nur in mit Kunststoff überzogener oder lackierter Form zu finden, um eine gute Desinfizierbarkeit zu gewährleisten. Naturbelassenes Holz wird generell abgelehnt (Pitten et al., 1999). Da jedoch gezeigt werden konnte, dass trotz regelmäßiger Flächendesinfektion die Infektionsrate im Krankenhaus nicht gesenkt werden konnte (Daschner, 2000; Dharan et al., 1999; Danforth et al., 1987), und zudem die Ausgangskeimzahl zwei Stunden nach Desinfektion wieder erreicht ist (Ayliffe et al., 1966), soll die vorliegende Studie Klarheit bringen, ob ein Einsatz von Holz im Krankenhaus nicht nur unbedenklich, sondern sogar empfehlenswerter gegenüber dem Gebrauch von Kunststoff ist.

8 4 2 Material und Methoden 2.1 Versuchsbeschreibung Die zu untersuchenden Oberflächen wurden vor den Versuchen mit 70%igem Alkohol desinfiziert (nur kunststoffbeschichtete Platten und Kunststoff). Durch Auftragen von je 0,02 ml der hergestellten Keimsuspension von 5x10 5 KBE/ml bzw. 5x10 5 KBE/ml auf die vorgezeichneten Quadrate von 10 cm 2 betrug die Kontamination der Materialien 10 3 KBE/cm 2 bzw KBE/cm 2. Nach einer Antrocknungszeit von 30 Minuten bei Zimmertemperatur wurde ein Teil der kontaminierten Flächen desinfiziert, der andere Teil blieb unbehandelt. Es folgte nun die erste Keimzahlbestimmung der Oberflächen mittels RODAC -Abklatschverfahren zum Zeitpunkt 0 min. Weitere Keimzahlbestimmung nach 30 min, 1 h, 4 h und 24 h schlossen die Probenahme ab. Die Untersuchungen wurden 3-fach wiederholt. 2.2 Untersuchtes Material Verglichen wurden das Keimwachstum auf Oberflächen aus Kiefernkernholz (Pinea silvestris), das von der Firma Wilms zwei unterschiedlichen Wasch- und Trocknungsverfahren, K3 und K3/7-02, unterzogen worden war (im folgenden Hygieneholz 1 und 2 genannt), Kunststoff und kunststoffbeschichtetes Sperrholz (die Materialien wurden bereitgestellt von der Fa. Wilms Holzprodukte, Bad Essen-Barkhausen). Die Ausmaße der Kiefer- und Sperrholzbretter betrugen 25cm x 10cm x 2cm; die Kunststoffbretter waren in Länge und Breite gleich, die Dicke betrug 0,5 cm. Auf jeder Platte waren 8 Quadrate zu je 10 cm 2 aufgetragen, auf die die Keime gegeben wurden. 2.3 Testkeime Mit folgenden Keimstämmen wurden die Oberflächen kontaminiert: Staphylococcus aureus (Methicillin-resistent)

9 5 Enterococcus faecium (Vancomycin-resistent) Escherichia coli (multiresistent) Pseudomonas aeruginosa (multiresistent) Candida albicans Mycobacterium terrae Penicillium camembertii Alle Keime stammen aus der Laborsammlung des Institutes für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene Freiburg. 2.4 Herstellung der Keimsuspension zur Kontamination der Materialien Die Keime wurden auf einer Blutagarplatte (Columbia. Fa. heipha, Heidelberg) als Übernachtkultur im Breitschrank bei 37 C angezüchtet. Von diesen Keimen wurde eine Keimsuspension mit 5 m1 Müller-Hinton-Boullion (Fa. Merck, Darmstadt) hergestellt und in mit Müller-Hinton-Boullion als Nullwert geeichten Micro-Scan-Turbiditymeter (Fa. Dade Behring, Liederbach) auf eine Keimkonzentration von 10 8 KBE/ml (KBE= Kolonien bildende Einheit) eingestellt. Die Extinktion sollte, gemessen bei λ = 430 nm, für Staphylococcus aureus 0,1, für Enterococcus faecium 0,12, für Escherichia coli 0,13, für Pseudomonas aeruginosa 0,15, für Candida albicans 0,5, für Mycobacterium terrae 0,13 und für Aspergillus camembertii 0,6 betragen. Anschließend erfolgte die Verdünnung der Bakteriensuspension mit 0,9%iger NaCl-Lösung auf 5 x 10 5 KBE/ml und 5 x 10 7 KBE/ml. Zur Verringerung der Oberflächenspannung wurde 5% steriles Pferdeblut (Fa. ACILA GmbH, Mörfelden - Walldorf) zugegeben. Verdünnung: 5 x 10 5 KBE/ml: 0. l ml (1 x 10 8 KBE/ml) + 9.9m1 NaCl -> 10 6 KBE/ml 1 ml (1 x 10 6 KBE/ml) + 0,9m1 NaCl + 0,1 ml Pferdeblut -> 5 x 10 5 KBE/ml

10 6 5 x 10 7 KBE/ml: 1 ml (1 x 10 8 KBE/ml) + 0,9m1 NaCl + 0,1 ml Pferdeblut -> 5 x 10 7 KBE/ml Zur Kontrolle der angesetzten Lösungen wurden diese mit NaC1 auf 5 x 10 3 verdünnt und 0,02 ml dieser Lösung auf einer Blutagarplatte ausgespatelt. KBE/ml 5 x 10 3 KBE/ml: 0,lml (5 x 10 5 KBE/ml) + 9,9ml NaC1 -> 5 x 10 3 KBE/ml 2.5 Probenahme Je 20 µl der hergestellten Keimsuspensionen wurden mittels Eppendorf -Pipette (Fa. brinkmann) auf die Oberflächen aufgetragen. Die Keimzahlbestimmung erfolgte mit dem RODAC -Abklatschverfahren (Columbia- Blutagar-Platten (Fa heipha. Heidelberg) und Caso-Platten mit Enthemmer (Fa heipha, Heidelberg)). Eine mit Nähragar ausgegossene Petrischale mit einer leicht nach oben gewölbten Kontaktfläche (ca.2,16 cm 2 ) wurde für zehn Sekunden auf die Probefläche angedrückt (mit einem Auflagegewicht von 500 g, entsprechend einer Kraft von ca. 4,9N). Der Abdruck der Oberflächen ohne Behandlung mit Desinfektionsmittel geschah abgesehen von den mit Penicillium camembertii vorbehandelten Materialien mit Columbia-Blut- Abklatschagar Nr. 380e (Fa. heipha, Heidelberg). Bei den Versuchen mit Penicillium camembertii erfolgte der Abdruck mit Sabouraud-Glucose (4%-)Abklatschagar mit Chloramphenicol (Fa. heipha, Heidelberg). Zur Untersuchung der vorher desinfizierten Oberflächen kam mit Ausnahme der mit Mycobacterium terrae kontaminierten Materialien CASO Abklatschagar mit Enthemmer Nr. 228e (mit 0,07% Lecithin, 0,1% Histidin, 0,5% Tween 80) (Fa. heipha, Heidelberg) zum Einsatz. Da Mycobacterium terrae auf dem Abklatschagar mit Enthemmer nicht wuchs, wurde hier auch bei den Versuchen mit Desinfektion Columbia-Blut-Abklatschagar Nr. 380e (Fa, heipha, Heidelberg) verwendet.

11 7 Für den Kontrollausstrich wurde Columbia Blutagar Nr. 109 (Fa. heipha, Heidelberg) verwendet. Untersucht wurde die Oberflächenkeimzahl nach 0 min, 30 min, 1 h, 4 h und 24 h. Die Abklatschplatten wurden bei 37 kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 24 bis 48 h konnten die gewachsenen Kolonien ausgezählt werden. Ab einer Koloniezahl von 350 auf einer Platte waren die Kolonien nicht mehr eindeutig voneinander abgrenzbar und so nicht mehr quantifizierbar. 2.6 Identifizierung der Keime Die gebildeten Kolonien der Keime auf den Blutagar- und den Caso-Platten (Fa. heipha, Heidelberg) konnten aufgrund ihrer typischen Morphologie, ihres typischen Geruches und durch Vergleich mit den bei Versuchsbeginn angelegten Kontrollplatten eindeutig identifiziert werden. 2.7 Desinfektion Zur Desinfektion kamen zur Verwendung: Alkohol Aldehyd: Quats + Biguanid: Glucoprotamin: Ethanol 70% (Fa. Allchen GmbH, Breisach) Buraton 0,5% (Fa. Schülke & Mayr, Norderstedt) Sirafan perfekt 1,5% (Fa. Henkel-Ecolab, Düsseldorf) Incidin Plus 0,5% (Fa. Henkel-Ecolab, Düsseldorf) Die kontaminierten Oberflächen wurden nach der Antrocknungszeit mit desinfektionsmittelgetränkten Lappen zweifach abgewischt. Für jeden Keim erfolgten in beiden Konzentrationen mit jedem der oben genannten Desinfektionsmittel drei Durchgänge.

12 8 Dazu wurden drei Durchgänge ohne Desinfektionsmittel ergänzt. 2.8 Stellungnahme bezüglich statistischer Auswertungsverfahren Da keine statistische Auswertung durchgeführt wurde, wird im folgenden Ergebnisteil trotz überwiegend klarer Unterschiede zwischen dem mikrobiellen Wachstum auf den verschiedenen Materialien nie von einem signifikanten Unterschied die Rede sein. Grund für den Verzicht auf eine statistische Auswertung ist die besondere Versuchskonstellation. Durch die Obergrenze von 350 KBE/cm 2 kommen häufig gleich große Keimzahlen vor, was die Unterscheidungsmöglichkeit einschränkt. Da vier verschiedene Oberflächen miteinander verglichen werden, ergäben sich pro Versuchskonstellation insgesamt sechs Paarvergleiche. Es kann bei den Ergebnissen jedoch nicht von einer Normalverteilung ausgegangen werden. womit die Anwendung eines t-tests für verbundene Stichproben nicht zulässig ist. Als einzige Möglichkeit bliebe der Wilcoxon- Rangsummentest für Paardifferenzen, der keine Aussage über die Größe der Keimzahlunterschiede auf den verschiedenen Materialien macht, sondern lediglich das Vorhandensein derselben feststellt. Um den Wilcoxon Test unter den oben genannten Bedingungen anzuwenden, müsste jeder Versuch mindestens fünfmal, statt wie in dieser Studie geschehen dreimal wiederholt werden. Aus den genannten Gründen wurde auf eine statistische Auswertung verzichtet. Stattdessen wurden im folgenden Ergebnisteil die drei Versuche pro Versuchskonstellation zur Veranschaulichung in je einem Graphen zusammengefasst.

13 9 2.9 Übersicht Kontamination verschiedener Materialien mit unterschiedlichen Keimen Inkubation Keine Desinfektion Desinfektion Abdruck mit RODAC Abklatschplatten nach 0 h 0,5 h 1h 4h 24 h Bebrütung für 24 h Auszählung der KBE

14 10 3 Ergebnisse Nachdem die Oberflächen mit den Altar-Abklatschplatten bearbeitet worden waren, wurden die Altarplatten für Stunden bei 37 C bebrütet und anschließend die auf den Oberflächen festgestellten Mikroorganismen quantifiziert. Im Folgenden werden die Ergebnisse mit Graphik dargestellt. Zusätzlich finden sich die Ergebnisse im Anhang in Tabellenform. In den Fällen, bei denen weder bei Kontamination mit 10 3 KBE/cm 2 noch mit 10 5 KBE/cm 2 ein deutliches Keimwachstum nachweisbar war, wurde auf die Darstellung mittels Graphik verzichtet und im Anhang lediglich eine tabellarische Aufführung der Ergebnisse nach Kontamination mit 10 5 KBE/cm 2 aufgeführt. 3.1 Nachgewiesenes Keimwachstum nach Inokulation ohne anschließende Desinfektion Die verschiedenen Oberflächen der Materialien Hygieneholz 1 und 2, Kunststoff und kunststoffbeschichtete Platten wurden je dreimal mit jedem Keim mit der Konzentration von 10 3 KBE/cm 2 und 10 5 KBE/cm 2 inokuliert. Abklatschproben zu festgelegten Zeitpunkten nach verstrichener Antrocknungszeit gestatteten es, die unterschiedliche Entwicklung der Bakterientiter auf den verschiedenen Oberflächen zu verfolgen, Jeder Versuch wurde dreimal durchgeführt. Die Abbildungen zeigen die Zusammenfassung aus den drei Durchführungen. Bei den Versuchen mit 10 5 KBE/cm 2 lag die Kolonienzahl oft über der Zählbarkeitsgrenze, so dass sich kein dokumentierbarer Unterschied zwischen den einzelnen Oberflächen feststellen ließ. Bei den Versuchen mit 10 3 KBE/cm 2 fanden sich jedoch auf dem Holz stets weniger, oder in einigen wenigen Fällen gleich viele Mikroorganismen wie auf den Kunststoffoberflächen oder kunststoffbeschichteten Oberflächen. Die Unterschiede zwischen den beiden Hygieneholzarten fielen gering und abhängig von den untersuchten Mikroorganismen aus. Die Versuche mit Staphylococcus aureus zeigten nach Inokulation mit 10 3 KBE/cm 2 für beide Hygieneholzarten von der ersten Keimbestimmung an ein deutlich geringeres Keimvorkommen als auf den Kunststoffoberflächen oder kunststoffbeschichteten Oberflächen. Dieser Unterschied bestand auch bei den nach 30 Minuten und einer Stunde

15 11 gemessenen Werten. Nach vier Stunden hat sich das Keimvorkommen auf den Kunststoffoberflächen auf eine ähnlich geringe Kolonienzahl gesenkt, wie sie bei den Holzoberflächen zu beobachten ist. Diese Tendenz setzt sich fort in den nach 24 Stunden erhobenen Werten, während die Keimzahl auf den kunststoffbeschichtete Plattenoberflächen über den gesamten Beobachtungszeitraum gegenüber den anderen drei Oberflächen deutlich höher blieb (siehe Abb. la). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Staphylococcus aureus (Methicillin resistent) 10 3 KBE1cm 2, ohne Wischdesinfektion Nach Inokulation mit 10 5 KBE/cm 2 fand sich erst nach 24 Stunden ein deutlich nachweisbarer Abfall des Keimvorkommens auf den beiden Hygieneholzarten auf Werte unter 100 KBE/l0cm 2, während die Werte für Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten über der Zählbarkeitsgrenze von 350 KBE/l0cm 2 blieben (Abb. lb). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Staphylococcus aureus (Methicillin resistent) 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion

16 12 Die Bakterientiter von Enterococcus faecium nahmen bei den Versuchen mit 10 3 KBE/cm 2 auf den beiden Holzoberflächen in der ersten Stunde auf Werte unter 100 KBE/10cm 2 ab und waren nach 24 Stunden in keiner Probenahme über 20 KBE/l0cm 2. Auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen ließ sich dagegen keine Abnahme der Mikroorganismen feststellen, da, mit Ausnahme des Vierstundenwertes von kunststoffbeschichteten Platten, die Keimzahl stets über 350 KBE/l0cm 2 lag (Abb. lc). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination Mit Enterococcus faecium 103 KBE/cm2, ohne Wischdesinfektion Die Ergebnisse der Versuche mit 10 5 KBE/cm 2 ermöglichten keine Unterscheidung der verschiedenen Oberflächen, da die Werte für eine Quantifizierung der Keimabnahme über den gesamten Untersuchungszeitraum zu hoch waren. Im Folgenden wurde das Verhalten von Escherichia coli auf den verschiedenen Oberflächen untersucht. Dabei wies Hygieneholz 1 eindeutig die besten hygienischen Eigenschaften auf. Hier lag bei den Experimenten mit 10 3 KBE/cm 2 die beweisbare Keimmenge bei der Bestimmung zum Zeitpunkt 0 Minuten bereits bei Werten um 200 KBE/l0cm 2, während auf den anderen drei Oberflächen noch nicht zählbares Rasenwachstum (>350 KBE/l0cm 2 ) festgestellt wurde. Nach 30 Minuten war die Keimzahl auf Hygieneholz 1 weiter auf Ergebnisse zwischen 17 und 60 KBE/l0cm 2 gesunken, aber auch auf Hygieneholz 2 fanden sich jetzt Werte zwischen 13 und 100 KBE/l0cm 2. Auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten fand sich dagegen immer noch Rasenwachstum.

17 13 Auch dreieinhalb Stunden später waren die Keimzahlen auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen noch immer über 350 KBE/10cm 2, indessen fanden sich bei Hygieneholz 1 nur zwischen 3 und 6 KBE/l0cm 2, und bei Hygieneholz 2 zwischen 1 und 23 KBE/l0cm Stunden nach den ersten Probenahmen war die nachweisbare mikrobielle Besiedlung auf Kunststoff auf 11 bis 84, und auf kunststoffbeschichtete Platten auf 59 bis 80 KBE/l0cm 2 gesunken. Auf den Holzoberflächen hatte sich im Vergleich zu den Messungen nach vier Stunden nichts Wesentliches verändert (Abb. ld). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Escherichia coli 10 3 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Die Untersuchungen mit einer Inokulationsmenge von 10 5 KBE/cm 2 ergaben wieder zunächst ein feststellbares Absinken der Keimzahlen auf Hygieneholz 1, das vier Stunden nach der ersten Erhebung bei 130 bis 250 KBE/10 cm 2 lag. Auf den anderen drei Oberflächen lagen die Keimzahlen zum Zeitpunkt dieser Messung noch über 350 KBE/l0cm 2. Nach 24 Stunden waren auf Hygieneholz 1 fast keine Mikroorganismen mehr nachweisbar, auf Hygieneholz 2 lagen die Keimzahlen im einstelligen Bereich und auf Kunststoff war die Zahl der KBE/l0cm 2 auf 38 bis 74, und auf kunststoffbeschichteten Platten auf 81 bis 91 gefallen (Abb. le).

18 14 Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Escherichia coli 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Bei Pseudomonas aeruginosa zeigte nach Inokulation mit 10 3 KBE/cm 2` wieder Hygieneholz 1 bereits bei der ersten Messung zum Zeitpunkt 0 Minuten Keimzahlen um 250 KBE/l0cm 2, im Gegensatz zu Rasenwachstum auf den drei weiteren Oberflächen. Auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten war auch nach einer Stunde noch Rasenwachstum nachweisbar, während auf Hygieneholz 2 schon eine halbe Stunde später Werte um 150, und auf Hygieneholz 1 Werte um 100 KBE/l0cm 2 festgestellt wurden. Die Keimbesiedelung auf den Holzoberflächen sank noch weiter und lag nach vier Stunden zwischen null und fünf KBE/10cm 2. Zu diesem Zeitpunkt waren auch die Mittelwerte der nachweisbaren KBE für Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten auf 170 bzw. 300/cm 2 gesunken. Nach 24 Stunden waren auf allen Oberflächen nur noch vereinzelt Mikroorganismen nachweisbar (Abb. 1 f).

19 15 Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Pseudomonas aeruginosa 10 3 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Die Inokulation mit 10 5 KBE/cm 2 führte auf allen Oberflächen zu einem derart hohen Keimvorkommen, dass auch nach vier Stunden kein Unterschied zwischen den verschiedenen Oberflächen festgestellt werden konnte, da die nachweisbare Keimzahl von 350 KBE/l0cm 2 auf allen Materialien überschritten war. 24 Stunden nach der ersten Messung waren dann aber auf den beiden Holzoberflächen nur noch vereinzelt Mikroorganismen zu finden, während die Keimzahlen auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten immer noch über 350 KBE/l0cm 2 lagen (Abb. Ig). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Pseudomonas aeruginosa 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Die Versuche mit Candida albicans ließen bei der Auftragung von 10 3 KBE/cm 2 wieder bei Hygieneholz 1 eine deutliche Abnahme der nachweisbaren Oberflächenkontamination bei der Messung zum Zeitpunkt 0 Minuten feststellen, diesmal auf einen Mittelwert. leicht über 100

20 16 KBE/l0cm 2. Auch auf Hygieneholz 2 war ein Absinken der Oberflächenkontamination auf Werte zwischen 250 und 300 KBE/l0cm 2 bereits feststellbar, während sich auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen noch über 350 KBE/l0cm 2 befanden. Nach einer Stunde lagen auch die von den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichtete Materialien gewonnenen Proben mit Werten zwischen 300 und 350 KBE/10cm 2 im messbaren Rahmen. Der Unterschied zwischen den beiden Holzarten hatte sich schon bei der zweiten Messung wieder stark verringert; auf beiden Oberflächen fanden sich bis vier Stunden nach der ersten Messung Keimzahlen im mittleren zweistelligem Bereich; der nach 24 Stunden erhobene Wert lag noch weiter darunter. Dagegen fanden sich auf der Kunststoffoberfläche auch nach 24 Stunden immer noch im Mittel fast 100, auf der kunststoffbeschichtete Oberfläche über 150 KBE/cm 2 (Abb. 1 h). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Candida albicans 10 3 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Die Untersuchungen mit 10 5 KBE/cm 2 konnten nur für Hygieneholz 1 ein Absinken der Zahl der Mikroorganismen auf der Oberfläche nachweisen. Nach 24 Stunden lag der mittlere Wert der KBE/l0cm 2 bei zählbaren 300. Auf allen anderen Oberflächen zeigten die genommenen Proben stets Rasenwachstum (Abb. li).

21 17 Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Candida albicans 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Das Verhalten von Mycobacterium terrae auf den verschiedenen Oberflächen nach Inokulation mit 10 3 KBE/cm 2 zeigte wieder zu allen gemessenen Zeitpunkten geringeres Wachstum auf den beiden Holzarten im Vergleich zu dem Wachstum auf den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichtete Materialien. Zwischen den beiden Hygieneholzoberflächen wurden keine Unterschiede deutlich (Abb. lj). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Mykobacterium terrae 10 3 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Nach Inokulation mit 10 5 KBE/cm 2 fand sich nach den ersten vier Probenahmen auf allen Abklatschplatten Rasenwachstum. Erst 24 Stunden nach der ersten Messung nahm die Zahl der Mikroorganismen auf Hygieneholz 1 und noch stärker auf Hygieneholz 2 ab. Auf

22 18 Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten blieb das Keimvorkommen dagegen auch nach 24 Stunden über der Zählbarkeitsgrenze (Abb. lk). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Mykobacterium terrae 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion Die Experimente mit 10 3 KBE Penicillium camembertii/cm 2 ergaben zu allen Messzeitpunkten ein Überwiegen der mittleren Keimzahlen auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichtete Oberflächen gegenüber den beiden Holzoberflächen. Die Unterschiede waren jedoch nicht sehr stark ausgeprägt (Abb. 11). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Penicillium camembertii 10 3 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion

23 19 Bei den Untersuchungen mit 10 5 KBE/cm 2 Auftragungsmenge führten die Messungen in den ersten vier Stunden wieder zu keinem vergleichbaren Ergebnis, da stets Rasenwachstum gefunden wurde. 24 Stunden nach der ersten Messung jedoch hatte die Zahl der nachgewiesenen Mikroorganismen auf den beiden Holzarten im Gegensatz zu den Kunststoff und kunststoffbeschichtete Oberflächen abgenommen (Abb. Im). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Penicillium camenbertii 10 5 KBE/cm 2, ohne Wischdesinfektion 3.2 Nachgewiesenes Keimwachstum nach Inokulation und anschließender Desinfektion Äthanol Nach Inokulation der verschiedenen Oberflächen mit jedem Keim wurden diese nach halbstündiger Antrocknungszeit mit 70%iger Äthanollösung desinfiziert. Anschließend wurde nach verstrichener Einwirkzeit zu den üblichen Zeitpunkten die Oberflächenkontamination untersucht. Jeder Versuch wurde dreimal durchgeführt. Sowohl bei den Versuchen mit 10 3 KBE/cm 2 Auftragungsmenge, als auch bei Versuchen mit 10 5 KBE/cm 2 fand sich auf allen Materialien zu keinem Zeitpunkt ein gewichtiges Keimwachstum. Vereinzelte Kolonien ließen sich bei zwei Versuchen mit Penicillium camembertii mit 10 5 KBE/cm 2 für den 0 Minuten Wert auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen nachweisen. Auch bei den Versuchen mit 10 5 KBE Escherichia coli/cm 2 fanden sich auf allen Oberflächen in einzelnen Fällen vereinzelte KBE (siehe Anhang).

24 Glutaraldehyd (Buraton ) Nach der Kontamination der Oberflächen und verstrichener Antrocknungszeit wurden die Oberflächen mit 0,5%iger Buraton -Lösung desinfiziert und sodann zu den festgelegten Zeitpunkten auf noch vorhandene Mikroorganismen untersucht. Wieder wurde jeder Versuch dreimal durchgeführt. Bei den Experimenten mit 10 3 KBE/cm 2 ließ sich mit Ausnahme von Penicillium camenbertii auf keiner der Materialien relevantes Wachstum nachweisen. Die Versuche mit 10 5 KBE/cm 2 zeigten in den unten beschriebenen Fällen bei den Sofortwerten vor allem auf Hygieneholz 1, aber auch auf Hygieneholz 2 nachweisbares Keimvorkommen, während auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen kein Wachstum dokumentierbar war. Für die Keime Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans und Mycobacterium terrae ließ sich zu keinem Zeitpunkt Wachstum nachweisen (siehe Anhang). Für Staphylococcus aureus fand sich bei einem Versuch mit 10 5 KBE/cm 2 für den Sofortwert ein Keimvorkommen auf Hygieneholz 1 mit vier bis 48 KBE/l0cm 2. Auf Hygieneholz 2 fanden sich zwischen drei und 16 KBE/l0cm 2 und auf den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichteten Materialien nur sehr vereinzelte Kolonien. Nach 30 Minuten waren auf keiner Oberfläche mehr Mikroorganismen nachweisbar (Abb. 2 a). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontaminaton mit Staphylococcus aureus (Methicillin resistent) 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit 0,5%iger Buraton -Lösung

25 21 Die Untersuchung von Enterococcus faecium mit Buraton wiesen bei der Inokulationsmenge von 10 5 KBE/cm 2 für die ersten beiden Messungen zwischen 19 und 29 KBE/ 10cm 2 auf Hygieneholz 1 nach. Auf Hygieneholz 2 fanden sich in einem Fall nach 30 Minuten vereinzelte Mikroorganismen, auf den anderen Materialien ließ sich keine Oberflächenkontamination nachweisen (siehe Anhang). Bei Penicillium camenbertii ließen sich auf Hygieneholz 1, Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten für beide untersuchte Konzentrationen vereinzelte Kolonien bei der ersten Messung feststellen. In den anderen Fällen waren keine Mikroorganismen nachweisbar (siehe Anhang) Glucoprotamin (lncidin Plus ) Unter Beachtung der Einwirkzeit von Incidin Plus wurde das Keimvorkommen auf den verschiedenen Oberflächen nach Inokulation mit den verschiedenen Mikroorganismen mit 10 3 KBE/cm 2 und 10 5 KBE/cm 2 und anschließender Desinfektion mit 0,5%iger Incidin Plus Lösung untersucht. Bei den Versuchen mit 10 3 KBE/cm 2 Auftragungsmenge fand sich auf allen Materialien zu keinem Zeitpunkt ein nachweisbares Keimvorkommen. Die Versuche mit 10 5 KBE/cm 2 ergaben für den Sofortwert von Staphylococcus aureus auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten leicht erhöhte Keimzahlen (im unteren zweistelligen Bereich), für die anderen Mikroorganismen vereinzeltes Keimvorkommen ohne deutliche Präferenz des Oberflächenmaterials. Eine halbe Stunde nach der ersten Probenahme ließen sich, mit Ausnahme von Staphylococcus aureus auf kunststoffbeschichteten Platten in einem Fall, keine weiteren Mikroorganismen nachweisen (siehe Anhang) Quats + Biguanid (Sirafan ) Vor der Probenahme von den kontaminierten Oberflächen wurden diese mit 1,5%iger Sirafan -Lösung desinfiziert.

26 22 Die nach Kontamination mit 10 3 KBE/cm 2 gewonnenen Ergebnisse zeigten nur geringe Keimvorkommen auf allen Oberflächen, die keine augenfälligen Unterschiede zwischen den Materialien beweisen konnten (siehe Anhang). Bei den Versuchen mit 10 5 KBE/cm 2 fand sich dagegen auf beiden Hygieneholzarten in fast allen Fällen ein größeres Keimvorkommen als auf den Untersuchungsmaterialien aus Kunststoff oder kunststoffbeschichtete Platten. In der ersten Messung bei den Versuchen mit Staphylococcus aureus wurden nach einer Auftragungsmenge von 10 5 KBE/cm 2 auf den beiden Holzoberflächen zwischen 120 und 200 KBE/l0cm 2 festgestellt. Auf Hygieneholz 2 nahm die Kontamination dann stärker auf Werte zwischen 4 und 17 KBE/l0cm 2 ab, während auf Hygieneholz 1 auch nach der letzten Messung im Mittel 84 KBE/l0cm 2 nachgewiesen wurden. Auf den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichteten Materialien fanden sich bei der ersten Messung zwischen 11 und 34 KBE/l0cm Minuten später wurden hier keine Mikroorganismen mehr festgestellt (Abb. 3 a). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Staphylococcus aureus (Methicillin resistent) 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit 1,5%iger Sirafan -Lösung Die Versuche mit Enterococcus faecium zeigten nach Inokulation von 10 3 KBE/cm 2 lediglich auf Hygieneholz 2 und auf kunststoffbeschichteten Platten vereinzelte Mikroorganismen bei den Messungen bis zu 1h (siehe Anhang). Die Auftragung von 10 5 KBE/cm 2 zeigte wieder ein deutlich erhöhtes Keimvorkommen auf Hygieneholz 2. Von einer nicht bestimmbaren Keimmenge (>350 KBE/l0cm 2 ) nach der

27 23 ersten Messung sank die Oberflächenkontamination auf noch immer 46 bis 52 KBE/l0cm 2 nach 24 Stunden. Auf Hygieneholz 1 schwankten die festgestellten Keimzahlen über den gesamten Untersuchungszeitraum im mittleren bis unteren zweistelligen Bereich, während auf kunststoffbeschichteten Platten nur zu Beginn der Messungen und auf Kunststoff zu keinem Zeitpunkt nennenswerte Oberflächenkontaminationen nachgewiesen werden konnten (Abb. 3 b). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Enterococcus faecium 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit 1,5%iger Sirafan -Lösung Die Untersuchung von Escherichia coli ergab nur für die Auftragungsmenge von 10 5 KBE/cm 2 vergleichbare Ergebnisse. Für 10 3 KBE/cm 2 konnte keine Keimbesiedelung auf den Oberflächen festgestellt werden. Mit Abstand am Meisten Mikroorganismen fanden sich auf Hygieneholz 2, obwohl der Bakterientiter bei der zweiten Messung nach einer halben Stunde schon stark von Werten zwischen 280 und 300 KBE/10cm 2 auf Werte im unteren zweistelligen Bereich gesunken war. Auf den kunststoffbeschichteten Oberflächen wurden nach der ersten Messung Keimzahlen im mittleren zweistelligen Bereich festgestellt, 30 Minuten später fanden sich hier jedoch keine Mikroorganismen mehr, während auf Hygieneholz 1 über die ersten vier Stunden nach der ersten Messung stetig geringes Keimwachstum nachweisbar war. Auch nach 24 Stunden fanden sich hier noch vereinzelte Mikroorganismen. Die Kunststoffoberfläche wies zu keinem Zeitpunkt deutliches Wachstum auf (Abb. 3 c).

28 24 Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Escherichia coli 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit 1,5%iger Sirafan Lösung Die 10 3 KBE/cm 2 Versuche mit Pseudomonas aeruginosa zeigten, abgesehen von einer Keimbesiedlung beim Sofortwert auf der kunststoffbeschichteten Oberfläche, wieder keine Unterschiede zwischen den Materialien. Nach Auftragung von 10 5 KBE/cm 2 zeigte sich jedoch erneut auf Hygieneholz 2 ein hohes, und auf Hygieneholz 1 ein im unteren zweistelligen Bereich liegendes Keimwachstum bei der ersten Messung, während auf den beiden anderen Materialien kein klarer Befund erhoben werden konnte (Abb. 3 d). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Pseudomonas aeruginosa 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit 1,5%iger Sirafan Lösung Auch mit Candida albicans ergab sich nach Inokulation mit 10 5 KBE/cm 2 nur auf den beiden Holzarten ein, wenn auch geringes, Keimvorkommen (Abb. 3 e).

29 25 Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Candida albicans 10 5 KBE/cm 2, Wischdesinfektion mit1,5%iger Sirafan -Lösung Deutliches Wachstum von Mycobacterium terrae ließ sich nach Desinfektion auf keiner der untersuchten Materialien feststellen (siehe Anhang). Penicillium camembertii zeigte bei den Versuchen mit 10 5 KBE/cm 2 in den früheren Messungen auf allen Materialien geringes Keimvorkommen, am meisten jedoch auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen (Abb. 3 f). Keimzahlen auf unterschiedlichen Oberflächen nach Kontamination mit Penicillium camenbertii 105 KBE/cm2, Wischdesinfektion mit 1,5%iger Sirafan -Lösung

30 Zusammenfassung der Ergebnisse Die Versuche ohne Desinfektion zeigten, mit Ausnahme der nicht quantifizierbaren Ergebnisse, immer eine deutlich geringere Keimbesiedlung auf den Hygieneholzmaterialien als auf den Kunststoffoberflächen und kunststoffbeschichteten Oberflächen. Dabei fanden sich auf Hygieneholz 1 bei den Versuchen mit Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans die geringste KBE Zahl, wogegen auf Hygieneholz 2 bei MRSA, Enterococcus faecium, Mycobacterium terrae und Penicillium camembertii vergleichsweise wenige Mikroorganismen nachweisbar waren. Nach Desinfektion mit Äthanol fanden sich auf keinem der Materialien mehr erhöhte Keimzahlen. Ähnlich verhielt es sich nach Desinfektion mit Incidin Plus. Nach Desinfektion mit Buraton ließen sich nur für den Sofortwert bei den Versuchen mit 10 5 KBE/cm 2 für MRSA und Enterococcus faecium vor allem auf Hygieneholz 1, aber auch auf Hygieneholz 2 Mikroorganismen feststellen, während auf den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichtete Materialien kein Wachstum nachweisbar war. Die Versuche mit Sirafan wiesen im Fall von MRSA, Enterococcus faecium, Escherichia coli und Candida albicans stets mehr mikrobielles Wachstum auf den beiden Hygieneholzarten im Vergleich zu den Kunststoffmaterialien und kunststoffbeschichteten Materialien auf. Die restlichen Mikroorganismen zeigten keine deutlichen Unterschiede in ihrem nachgewiesenen Wachstum auf den verschiedenen Materialien

31 27 4 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde die antimikrobielle Wirkung von zwei nach unterschiedlichen Verfahren gewaschenen und getrockneten Kiefernkernholzarten untersucht. Dazu wurde nach Kontamination der Oberfläche die Keimtiterentwicklung im Verlauf der Zeit anhand des RODAC -Abklatschverfahrens (Niskanen und Pohja, 1976) bestimmt und mit der Keimtiterentwicklung auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten verglichen. Die Versuche wurden sowohl ohne, als auch mit unterschiedlichen Desinfektionsmitteln durchgeführt. Die Ergebnisse sollen nun unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes miteinander verglichen und diskutiert werden. Der Übersichtlichkeit halber wurde die Diskussion in mehrere Unterpunkte gegliedert. 4.1 Diskussion der vorhandenen Literatur über Holz Die allgemeinen Vorbehalte gegen Holz im Zusammenhang mit Hygiene, sei es im Krankenhaus oder in der Verarbeitung von Lebensmitteln, sind sicherlich zum Teil unbewusste Assoziationen von Holz mit Natur und Schmutz. Seit der Einführung von Kunststoff in vielen Bereichen der Industrie wurden die schlechten hygienischen Eigenschaften von Holz auch in einer Anzahl von wissenschaftlichen Publikationen bewiesen (Kelch und Palm; 1958; Grossklaus und Levetzow, 1967; Gilbert und Watson, 1971; Kampelmacher et al., 1971; Borneff et al.; 1988a und b). Theoretisch erklärte man sich die schlechten hygienischen Eigenschaften von Holz mit dem fibrillären Aufbau der Zellwände und den vielen Zelthohlräumen, was zu einer großen inneren Oberfläche beitrage. Durch die kapillare Saugwirkung der Ring- und Tüpfelgefäße in der Holzoberfläche würde Oberflächenwasser mit darin gelösten Keimen ins Holzinnere transportiert. Es bestand die Vorstellung, diese könnten sich dort vor Reinigungs- und Desinfektionsmitteln geschützt vermehren. Die erste Studie 1958 von Kelch und Palm untersuchte die Oberflächenkeimgehalte von Holz- und Metalltischen in fleischverarbeitenden Betrieben. Hier lag der Keimgehalt der Holzflächen durchweg erheblich höher als auf den Metallflächen. Auch ließ sich durch

32 28 eine Reinigung mit heißer Sodalösung der Keimgehalt auf den Holzflächen nur unwesentlich beeinflussen. Grossklaus und Levetzow untersuchten 1967 gebrauchte Schneideunterlagen aus Holz, Gummi und Kunststoff. Nach Auftragung einer Keimsuspension und anschließender Reinigung mit warmem Wasser und Bürste ließen sich auch hier auf Holz die meisten Keime nachweisen. Gilbert und Watson untersuchten 1971 verschiedene bei der Fleischverarbeitung gebrauchte Oberflächen. Wieder zeigte Holz die schlechtesten hygienischen Eigenschaften. Kampelmacher et al. führten 1971 quantitative Untersuchungen über die Dekontamination von Holzflächen in der Fleischverarbeitung durch, die zu dem Ergebnis kamen, dass Holz schwerer zu desinfizieren und reinigen ist als Kunststoffmaterialien. Die genannten Studien bestätigten die Vorbehalte gegenüber Holz 1993 veröffentlichte das Food Research Institute in Wisconsin (USA) eine Studie, die zu dem überraschenden Ergebnis kam, dass Holz bessere hygienische Eigenschaften als Kunststoff besitzt. Untersucht wurden neun verschiedenen Holzarten (Ahorn, Schwarznuss, Esche, Linde, Buche, Birke, Kirsche, Kanadischer Nussbaum und Eiche) und Kunststoffe. Die Oberflächen wurden finit einer Bakteriensuspension getränkt und nach verschiedenen Zeiten mit einer Nährlösung abgespült. Anschließend wurden Abklatschproben genommen. Da das Holz die aufgetragenen Bakterien absorbierte, wurden hier, unabhängig von der Keimart, der Holzart und dem Gebrauchszustand der Brettchen, immer geringere Keimzahlen als auf den Kunststoffbrettern festgestellt. Waren die Holzoberflächen dagegen mit Fett verschmiert, wurden auch auf dem Holz zahlreiche Keime festgestellt (Ak et al., 1994a und 1994b). Um die Ergebnisse der amerikanischen Studie zu prüfen und gegebenenfalls zu relativieren führten Rödel et al Untersuchungen durch, in denen vier Schneideunterlagen aus Holz (Ahorn, Eiche, Esche, Buche) mit Schneideunterlagen aus Kunststoff verglichen wurden. Außer der Oberflächenkeimzahlbestimmung nach Inokulation mittels des RODAC - Abklatschverfahrens (Niskanen und Pohja, 1976) wurden die Holzoberflächen auch noch in einer Stärke von 0,25 mm abgehobelt und die Keime in diesen Spänen nachgewiesen. Wie bei der amerikanischen Studie ließen sich bei Versuchen ohne zusätzliche Verschmutzung der Oberflächen mit Fett auf den Holzoberflächen weniger Keime als auf den Kunststoffmaterialien feststellen. Auch die

33 29 Untersuchungen der tieferen Schichten zeigten eine Keimzahlreduktion im Holz. Die Unterschiede waren jedoch geringer als bei den Versuchen von Ak et al. (1994a und b). Weiterhin ließen sich die Kunststoffoberflächen bis zur völligen Keimfreiheit reinigen, wohingegen auf den Holzflächen noch zahlreiche Keime vorhanden waren (Rödel et al., 1994). Eine wachstumshemmende Wirkung von Holz auf Mikroorganismen konnte aufgrund dieser Ergebnisse nicht bestritten werden. Dennoch hielt man den hygienischen Status von Holz für nur schwer kalkulierbar und blieb aus diesem Grund weiter der Auffassung, dass Holz unhygienisch sei (Rödel et al., 1994). Die Untersuchungen ließen jedoch viele Fragen offen. Auf die Vorbehandlung des Holzes, die Aufbereitung und die Schnittführung und besonders auf die Holzart wurde nur unzureichend eingegangen. Dass gerade letztere eine große Rolle spielen könnte wird offensichtlich, bedenkt man die allgemein bekannte antimikrobielle Wirkung von Extraktstoffen und Ölen exotischer Hölzer wie Eukalyptus, Teebaum oder Taxus baccata (Barry et al., 2001; Erdemoglu und Sener, 2001; Harkenthal et al., 1999) veröffentlichte Schönwälder eine Studie, die die antibakterielle Wirkung von verschiedenen Hölzern (Kiefer, Fichte, Lärche, Ahorn, Buche, Eiche und Pappel) miteinander verglich. Die Untersuchungen zeigten, dass nicht alle Holzarten die gleichen antibakteriellen Eigenschaften besitzen. Eine besonders ausgeprägte keimhemmende Wirkung konnte für Kiefernholz festgestellt werden (Schönwälder, 1999). Schönwälder führte die Versuche weiter und stellte fest, dass die Keimreduktion an der Oberfläche mit der Absorption in tiefere Holzschichten zusammenhängt. Zusätzlich findet gleichermaßen an der Holzoberfläche als auch im Holzinneren eine korrelierende Keimabnahme statt. Die Keimreduktion auf der Oberfläche war abhängig von der Absorptionsfähigkeit des Holzes. Um diese zu verbessern und zu standardisieren, wurde von der Firma Gustav Wilms Holzverpackungen ein Wasch- und Trocknungsverfahren (K3) entwickelt, das zu einer Verbesserung der Keimreduktion auf der Holzoberfläche führte. Vor weiteren Untersuchungen wurde das so behandelte Kiefernholz nun mit Fleisch- und Fettgemischen beaufschlagt. Die Folge war eine deutliche Verlangsamung der Keimzahlreduktion, die jedoch immer noch schneller als auf einer Kunststoffoberfläche verlief.

34 30 Um eine eventuelle Ermüdung des antibakteriellen Effektes zu untersuchen, wurde das gleiche Ausgangsmaterial wiederholt beimpft. Auch nach zehnmaliger Auftragung von Testkeimen blieb die antibakterielle Aktivität des Kiefernholzes erhalten. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass bei höheren Keimbelastungen eine Verlangsamung der Abnahme der Keimzahl auf dem Holz eintritt (Schönwälder, 2000). Als Ursache für die mittlerweile bewiesene antibakterielle Wirkung bestimmter Holzarten wird zum einen der besondere Aufbau des Materials Holz aufgeführt. Entgegen vorheriger Studien, die in dem porösen Aufbau von Holz ein hygienisches Risiko sahen (Großklaus und Levetzow, 1967), konnte gezeigt werden, dass gerade die Porosität und die hygroskopen Eigenschaften zu einer Absenkung der Wasseraktivität im Holzinneren führen. Den Keimen wird die für ihre Lebensaktivität und Vermehrung unerlässliche Feuchtigkeit entzogen (Schulz, 1995). Zum anderen wird neben der hygroskopen Wirkung des Holzes auch Holzinhaltsstoffen eine antibakterielle Wirkung zugesprochen (Bayer 1997; Müller et al., 1995; Schrägle und Müller, 1990; Biswas et al., 1981). Für die antibakterielle Wirkung von Kiefernkernholz sind hauptsächlich Tannine (Polyphenole) verantwortlich (Schwager und Lange, 1998; Bayer, 1997; Müller et al., 1995; Scalbert, 1991; Schrägle und Müller, 1990; Field et al., 1989; Laks und McKaigh, 1988). Diese gehören zu den sekundären Extraktstoffen und sind somit nur in bestimmten Holzarten zu finden. Sie inhibieren über die Ausbildung von H-Brücken (Wasserstoffbrücken-Bindungen) mikrobielle Enzyme (Cellulase, Peroxidase, Pectinase). Darüber hinaus bilden sie Chelatkomplexe mit Metall-Ionen und reduzieren so deren lebenswichtige Verfügbarkeit für Mikroorganismen. Der überwiegende Teil der sekundären Extraktstoffe ist im Kernholz zu finden. Hier bleibt der Extraktstoffgehalt auch während einer Lagerung über längere Zeit unverändert (Schwager und Lange, 1998; Schäfer, 1996) Von Schönwälder durchgeführte Untersuchungen zeigten, dass gramnegative Bakterien empfindlicher auf Holzinhaltsstoffe reagieren als Gram-positive (Schönwälder, 2000). Andere Studien dokumentieren eine vorwiegend fungistatische Wirkung der Tannine (Schwager und Lange, 1998).

35 Relevanz der eigenen Ergebnisse Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die Studien von Schönwälder aus dem Jahr 2000 bezüglich der hygienischen Eigenschaften des von der Firma Gustav Wilms Holzprodukte nach speziellem Verfahren gewaschenen und getrockneten Kiefernkernholzes. Eine eindeutige antimikrobielle Wirkung gegen die hier getesteten Vertreter häufiger nosokomialer Infektionen konnte festgestellt werden. Bezüglich der untersuchten Keime ließen sich keine deutlichen Unterschiede der antimikrobiellen Wirkung feststellen. Grund dafür mag die Auftragungsmenge von maximal 10 5 KBEIcm 2 sein. Eine noch höhere Bakteriendichte bei verlängertem Untersuchungszeitraum von 48 oder mehr Stunden könnte Unterschiede der Empfindlichkeit der verschiedenen Keimen gegenüber dem Holz klären. Die Versuche ohne nachfolgende Desinfektion zeigten auf Holz deutlich weniger nachweisbares Keimvorkommen nach Inokulation als auf Kunststoff oder kunststoffbeschichteten Platten. Unter Berücksichtigung der vorhandenen Literatur über Kiefernkernholz (s.o.) ist das nicht unerwartet; nach Auftragung der Keime bleiben diese auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten an der Oberfläche, von den Materialien selbst geht keine Wirkung aus. Den hygienischen Vorteil dieser Materialien sah man bisher in der guten Desinfizierbarkeit (Rödel et al., 1994; Kampelmacher et al., 1971). Die Untersuchungen mit den verschiedenen Desinfektionsmitteln zeigten auch deutliche Unterschiede in der Desinfizierbarkeit des Kiefernholzes, abhängig von den verwendeten Substanzen. Die Desinfektion mit 70%'ciger Äthanol-Lösung, einem zu der Gruppe der Alkohole zählenden Desinfektionsmittel, dessen antibakterielle Wirkung auf der irreversiblen Denaturierung von Proteinen beruht, zeigte erwartungsgemäß eine sehr gute Wirkung gegen die aufgetragenen Keime auf Kunststoff und kunststoffbeschichteten Platten. Bemerkenswert war aber das ebenso gute Ergebnis auf den Holzmaterialien. Alkohol stellt also eine gute Möglichkeit dar, Kiefernholz zu desinfizieren. Die Wirkung des auf Aldehyd basierenden Buratons beruht ebenfalls hauptsächlich auf der Denaturierung von Proteinen. Ein Nachteil ist die Gefahr des Auftretens von Entzündungen oder Ekzemen allergischer Natur bei Hautkontakt. Auf Holz zeigt es wie Äthanol gute desinfizierende Wirkung, wenn auch teilweise einzelne KBE (Kolonien

36 32 bildende Einheiten) nachgewiesen wurden, während Kunststoff und kunststoffbeschichtete Platten immer vollständig desinfiziert waren. Glucoprotamin, der Wirkstoff von Incidin Plus entfaltet seine keimabtötende Wirkung über eine Störung der Struktur und Funktion mikrobieller Membranen. Auch hier zeigten sich, wie in den Versuchen mit Äthanol oder Buraton, keine Vorteile in der Desinfizierbarkeit von Kunststoff oder kunststoffbeschichteten Platten gegenüber den untersuchten Holzarten. Dem gegenüber fanden sich nach Anwendung von Sirafan erhöhte Keimzahlen auf dem Kiefernholz. Die Wirkung von Sirafan beruht auf der Kombination quarternärer Ammoniumverbindungen und Biguaniden, die kationische Eigenschaften besitzen und die Zytoplasmamenbran angreifen. Der kationische Charakter ist Vorraussetzung für die bakterizide Wirkung. Dass diese auf dem untersuchten Kiefernkernholz so schlecht ist, liegt an einer möglichen Wechselwirkung zwischen dem kationischen Desinfektionsmittel und den im Kiefernholz vorkommenden Polyphenolen. Die Polyphenole, die unter anderem für die antimikrobielle Wirkung von Kiefernkernholz verantwortlich sind, besitzen anionische Eigenschaften. Nach Anwendung von Sirafan auf Holz kommt es durch das Aufeinandertreffen von Anionen und Kationen zu einer, zumindest teilweisen, gegenseitigen Neutralisation der antimikrobiellen Wirkkomponenten. Sirafan eignet sich somit nicht für die Desinfektion von Holzmaterialien. Mit den anderen getesteten Substanzen (Alkohol, Buraton, Incidin) lässt sich das in dieser Studie untersuchte Kiefernkernholz dagegen zufrieden stellend desinfizieren. Das widerspricht nur auf den ersten Blick den oben erwähnten Studien von Rödel et al. und Kampelmacher et al., da augenscheinlich nicht nur das Wachstum von Keimen auf Holz, sondern auch die Desinfizierbarkeit desselben von der Holzart und deren Vorbehandlung abhängt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass - unter Berücksichtigung dieser beiden Faktoren- Holz gegenüber Kunststoff aus hygienischer Sicht überlegen ist. 4.3 Grenzen und Fehlermöglichkeiten verwendeter Methoden In der vorliegenden Studie wurden von der Firma Gustav Wilms Holzprodukte bereitgestellte Materialien verwendet. Den Erkenntnissen aus den beschriebenen, früheren Untersuchungen Rechnung tragend, wurde Kiefernkernholz untersucht, das