Einführung in diehplc

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1 Einführung in diehplc 1

2 Analytik - Abteilung Institut für Organische Chemie Prof. B. König 2

3 3 Kapitel I: Einführung Kapitel II: Grundprinzipien Kapitel III: Der chromatographische Prozeß Kapitel IV: Kapitel V: Literatur Das Chromatogramm

4 Kapitel I: Einführung 4

5 I Einführung I.1 Was heißt HPLC? 5 H P igh erformance-pressure L iquid C hromatography ( = Hochleistungs/Druck -Flüssig-Chromatographie)

6 I Einführung I.2 Was bedeutet HPLC? 6 Unterschied zwischen moderner HPLC und klassischer Säulen-Chromatographie? wesentlich höhere Auflösung bei Trennung (Trennung von bis zu 100 Komponenten und mehr) Drastische Verkürzung der Analysendauer (h Bereich von Minuten) Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit (ca g)

7 I Einführung I.3 Wann wird HPLC angewendet? 7 Notwendige Voraussetzung ist die Löslichkeit der zu analysierenden Substanz in einem geeignetem Solvens Die HPLC wird eingesetzt, wenn: Substanzen schwer flüchtig oder nicht flüchtig sind (sonst alternativ Einsatz von GC) Substanzen mit hohem Molekulargewicht vorliegen (MW > 500) es sich um thermisch instabile oder (leicht zersetzliche) Substanzen handelt.

8 I Einführung I.4 Wo wird HPLC eingesetzt? 8 Zur Reinheits- und Produktkontrolle chem. Substanzen Zur Analyse von Arzneistoffen Zur Bestimmung von Wirkstoffen in biolog. Matrices Zur Bestimmung von Schadstoffen (Umweltanalytik) Zur Trennung und Reinigung von Biopolymeren (Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden...) Standardmethode in fast allen chem. Laboratorien

9 I Einführung I.5 Wie wird die HPLC durchgeführt? 9 Injektor Pumpe Mobile Phasen Detektor Säule Computergesteuerte Auswertesoftware Abb. 1: Schematische Darstellung einer HPLC-Anlage

10 I Einführung I.5 Wie wird die HPLC durchgeführt? 10 Abb. 2: Moderner HPLC-Arbeitsplatz

11 Kapitel II: Grundprinzipien 11

12 II Grundprinzipien II.1 Grundbegriff: Chromatographie 12 Historie: Der Begriff Chromatographie wurde 1906 bei der Beobachtung geprägt, daß sich ein Gemisch aus Blattfarbstoffen auf einer mit Calciumphosphat gefüllten Säule in verschieden gefärbte Einzelfarbstoffe auftrennen läßt. Chroma = Farbe / Graphein = schreiben Definition: Chromatographie Mit dem Ausdruck Chromatographie bezeichnet man einen Trennprozess, bei welchem das Probengemisch zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen im sog. chromatographischen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine Hilfsphase (stationäre Phase) ruht dabei, während die andere Hilfsphase (mobile Phase) an ihr vorbei strömt.

13 II Grundprinzipien II.2 Grundbegriff: Hilfsphasen 13 Stationäre Phase: Meist ist in der Chromatographie die stationäre Phase fest (Chromatographiebett). Selten ist die stationäre Phase flüssig (dann aber als unbeweglicher stationärer, flüssiger Film auf der Oberfläche eines Feststoffes aufgebracht z.b. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie). Mobile Phase: Die mobile Phase kann sein: gasförmig flüssig Gaschromatographie Liquidchromatographie GC LC

14 II Grundprinzipien II.3 Grundbegriff: Verteilungskoeffizient K 14 beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärer Phase und mobiler Phase: K = c s (X) c m (X) (1) K = Verteilungskoeffizient c s (X) = Stoffmengenkonzenztration der Substanz X in der festen Phase c m (X) = Stoffmengenkonzentration der Substanz X in der mobilen Phase

15 II Grundprinzipien 15 II.4 Grundbegriff: Kapazitätsfaktor k beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärer Phase und mobiler Phase : k n s (X) n m (X) k = n n s(x) m (X) (2) = Kapazitäts- oder Retentionsfaktor = Stoffmenge der Substanz X in der festen Phase = Stoffmenge der Substanz X in der mobilen Phase

16 II Grundprinzipien II.4.1 Zusammenhang zwischen k und K 16 da n = c V Kapazitätsfaktor Verteilungskoeffizient k = V st V mob n n s m (X) (X) cs(x) Vst = = c (X) V m mob K = Volumen der stationären Phase = Volumen der mobilen Phase V V st mob (3) Diese unterschiedliche Verteilung von Substanzen in zwei nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl unterschiedlicher Chromatographiearten:

17 II Grundprinzipien II.5 Chromatographiearten (Auswahl) 17 untersch. Löslichkeit Verteilungs-Chromatographie flüssig / flüssig untersch. elektrostatische WW unterschdl. Größe od. Gestalt Adsorptions-Chromatographie flüssig / fest NP / RP-HPLC untersch. Adsorptionsverhalten Ionenaustausch- Chromatographie Gel-Chromatographie SEC, GPC

18 II Grundprinzipien II.6 Strategie der Trennung 18 Abb. 3: Schema zur Auswahl der passenden Chromatographieart

19 II Grundprinzipien II.7 Die Säulenauswahl 19 Abb. 4: Beispiel verschiedener HPLC-Säulen

20 Kapitel III: Der chromatographische Prozeß 20

21 III Der chromatographische Prozeß III.1 Der Trennvorgang 21 1 min 5 min A 10 min 15 min 20 min B C Abb. 5: Zeitlicher Verlauf einer chromatographischen Trennung

22 III Der chromatographische Prozeß III.2 Definitionen Definition: Chromatogramm Mit dem Ausdruck Chromatogramm bezeichnet man die graphische Auftragung der Größenwerte einer Größe (z.b. der Absorption), die am Ende der stationären Phase, also z.b. am Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen die Zeit oder das Volumen der mobilen Phase. 22 Definition: Retentionsvolumen / -Zeit Das Volumen der mobilen Phase, das die stationäre Phase vom Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz X als Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das Retentionsvolumen der Substanz X: V R (X) Die zugehörige Zeit nennt man die Retentionszeit: t R (X).

23 III Der chromatographische Prozeß III.3 Das Retentionsvolumen V R (X) 23 V R (X) = F t (X) R (4) Retentionsvolumen [ml] Retentionszeit [min] Volumenfließgeschwindigkeit [ml min -1 ]

24 III Der chromatographische Prozeß III.4 Die lineare Fließgeschwindigkeit U m 24 F F F um = A = = f A ε 2 π r ε (5) u m : lineare Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase [cm s -1 ] F : Volumenfließgeschwindigkeit [ml s -1 ] A f : freie Säulenquerschnittsfläche [cm 2 ] A : Säulenquerschnittsfläche [cm 2 ] r : Säulenradius [cm] ε : Interpartikel-Porosität der Säule ( Kieselgel 0.8)

25 III Der chromatographische Prozeß III.4.1 Die Interpartikelporosität ε 25 ε= V c V c V st = V V 0 c (6) ε : Interpartikelporosität V c : geometrisches Säulenvolumen [cm 3 ] V St : Volumen der stationären Phase [cm 3 ] V 0 : Interpartikelvolumen der Säule [cm 3 ]

26 III Der chromatographische Prozeß III.5 Zusammenhang zwischen Die lineare Wanderungsgeschwindigkeit u(x) der Substanz X muß der linearen Wanderungs-(Fließ)-Geschwindigkeit der mobilen Phase u m direkt proportional sein. u m und u(x) 26 d.h. u(x) wird immer kleiner u m oder höchstens gleich u m sein. u (X) u und u u m (X) m (7)

27 III Der chromatographische Prozeß III.5.1 Der Proportionalitätsfaktor χ m (X) 27 Der Proportionalitätsfaktor χ m (X) muß also zwischen 0 und 1 liegen. u (X) = χ m (X) u m (8) Es kann sich bei χ m (X) nur um den Stoffmengenanteil der Substanz X in der mobilen Phase handeln, weil ja die Substanz X nur dann überhaupt mit der Geschwindigkeit u m transportiert werden kann. Dieser Stoffmengenanteil ist wie folgt definiert:

28 III Der chromatographische Prozeß III.6 Zusammenhang χ m (X) und k 28 n m χ m (X) = (X) 1 = = ns (X) + nm (X) ns (X) 1 n m (X) + 1 k + 1 (9) u(x) = χ m (X) k = Retentionsfaktor u m = u u m (X) 1 k + 1 u m = k + 1 (10) (11)

29 III Der chromatographische Prozeß III.6.1 Grenzfälle u(x) = χ m (X) u m = 1 k + 1 u m (10) 29 Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: Erhält man zwei Grenzfälle: 1.) Für χ m(x) = 0 u (X) = 0 d.h. es befindet sich keine Substanz X in der mobilen Phase - alles ist an die stationäre Phase gebunden, d.h. keine Wanderung der Substanz u (X) = m 2.) Für χ m (X) = 1 u 0 χ (X) 1 d.h. es befindet sich die gesamte Substanz X in der mobilen Phase X hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre Phase, d.h. Wanderungsgeschwindigkeit von X gleich der der mobilen Phase. m

30 III Der chromatographische Prozeß III.7 Die Totzeit t 0 30 Die Zeit, die im 2. Fall verstreicht, wenn also keine Wechselwirkung der Substanz X mit der stationären Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. Totzeit der Säule t 0. Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog. Totvolumen V 0 der Säule bezeichnet. Der Gebrauch dieser Bezeichnungen V 0, t 0 wird von der IUPAC jedoch wegen vieler Verwechslungsmöglichkeiten heute nicht mehr empfohlen.

31 III Der chromatographische Prozeß III.8 Die Durchbruchszeit t m 31 So ist mit dem sog. Totvolumen V 0 oft nicht nur das eigentliche Totvolumen der Säule gemeint, sondern zusätzlich das Totvolumen das durch das jeweilige Chromatographiesystem verursacht wird (z.b. durch die Volumina der Verbindungskapillaren, der Anschlüsse, der Konnektoren etc.) Dies wird berücksichtigt in den Ausdrücken: Durchbruchsvolumen bzw. Durchbruchszeit Als Symbole von der IUPAC empfohlen: V m und t m

32 III Der chromatographische Prozeß III.8.1 Durchbruchsvolumen V m und -zeit t m 32 Definition: Durchbruchsvolumen / -zeit Als Durchbruchsvolumen V m bzw. -zeit t m wird dasjenige Volumen (bzw. die dazu korrespondierende Zeit) bezeichnet, das benötigt wird, um eine nicht-retardierende Substanz von der Eingabe bis zur Detektionsstelle zu befördern. Dieses Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen der mobilen Phase im Säulenbett V mob die Totvolumina des Gerätes z.b. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im Detektor etc.. t m Ist für alle Substanzen gleich Die Auftrennung der Substanzen kommt ausschließlich dadurch zustande, daß sich die Substanzen unterschiedlich lange in der stationären Phase aufhalten und somit zu unterschiedlichen Retentionszeiten eluieren.

33 III Der chromatographische Prozeß III.8.1 Durchbruchsvolumen V m und -zeit t m 33 Anmerkung! Da bei modernen HPLC-Anlagen diese eigentlichen Totvolumina des Systems auf ein Minimum reduziert sind (durch minimale Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), können diese Parameter zur Vereinfachung der Problematik im Folgenden vernachlässigt werden, und es wird künftig davon ausgegangen, daß es sich bei t m ausschließlich um die Durchbruchszeit der Säule handelt, und sich die Wanderungsgeschwindigkeiten u(x) um u m alleine auf die Säule beziehen.

34 III Der chromatographische Prozeß III.8.2 Zusammenhang t m, t R (X) und t S 34 Absorption [mau] t m t R (X 1 ) t R (X 2 ) t S (X 1 ) t S (X 2 ) tr (X) = ts (X) + tm Zeit [s] Abb. 6: Musterchromatogramm mit t S (X) als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phase

35 III Der chromatographische Prozeß III.8.3 Bestimmung von t m und t R (X) 35 Wovon sind Retentionszeit t R (X) und Durchbruchszeit t m abhängig? von den Abmessungen der Säule (Länge: L) von den Wanderungsgeschwindigkeiten u m (X), u(x) Durchbruchsvolumen Retentionsvolumen t m V m L = = um F t R (X) L = = u(x) (12) (13) V R (X) F

36 III Der chromatographische Prozeß III.8.3 Bestimmung von t m und t R (X) 36 t R (X) t m VR = (X) = V m u m u(x) (14) berücksichtigt man die bekannte Beziehung u(x) = χ m (X) u m = 1 k + 1 u m (10) ergibt sich:

37 III Der chromatographische Prozeß III.8.4 Zusammenhang t m, t R (X) und k 37 t R (X) t m VR = (X) = k +1 V m (15) V = V ( k + 1) R (X) t = t ( k + 1) R (X) m m (16) (17)

38 III Der chromatographische Prozeß III.9 Berechnung des Kapazitätsfaktors k Ausgehend von Gleichung (17) ergibt sich für den Kapazitätsfaktor k : 38 k = t t S R t R (X) (X) t m t m ts tr = = t t (X) (X) (X) = k t m k t + m m t m m k = k (18) (19)

39 III Der chromatographische Prozeß III.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors k 39 k = t R t m t m ts tr = = t t (X) (X) (X) m m 1 (18) Definition: Kapazitäts-(Retentions)faktor Um Chromatogramme, die an verschieden langen und unterschiedlich dicken Säulen bei unterschiedlicher Flußgeschwindigkeit gemessen wurden, vergleichen zu können, bedient man sich einer dimensionslosen Größe, dem Kapazitäts-(Retentions)faktor k. Der Kapazitäts-(Retentions)faktor k einer Substanz X ist somit eine auf die Durchbruchszeit normierte Elutionsgröße.

40 III Der chromatographische Prozeß III.9.2 Beispiele 40 t = t ( k + 1) R (X) m (17) Substanz eluiert unverzögert t R = t m k =0 Literaturangabe k = 5 mit eigener Säule t m = 2.5 min zu erwarten t R = 15 min

41 III Der chromatographische Prozeß III.10 Zusammenhang K und V R (X) Ausgehend von Gleichung (16) V = V ( k + 1 ) (16) R (X) m 41 und der Beziehung (3) zwischen Retentionsfaktor k Verteilungskoeffizienten K k = n n s m (X) (X) cs(x) Vst = = c (X) V m mob K erhält man bei Annahme daß V m = V mob VR(X) = K Vst + Vm V V st mob (3) (20)

42 III. Der chromatographische Prozeß III.10 Zusammenhang K und V R (X) 42 VR(X) = K Vst + Vm (20) Diese Beziehung (20) beschreibt den Transport eines Analyten durch die Säule. Gleichung (20) stellt eine Verknüpfung zwischen dem Elutionsvolumen einer Substanz V R (X) mit der thermodynamischen Größe K (Verteilungskoeffizient) dar.

43 III. Der chromatographische Prozeß III.11 Die Theorie der Böden 43 Es gibt mehere Möglichkeiten, den chromatographischen Trennprozess genauer zu beschreiben. A B C Zeit Ziel: Die Position jeder einzelnen Komponente im chromatographischen Trennsystem und ihre dortige Konzentrationsverteilung in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt zu können.

44 III. Der chromatographische Prozeß III.11 Die Theorie der Böden 44 Ein möglicher Ansatz: Theorie der Böden (theoretisches Trennstufenmodell) Übertragung der Theorie der fraktionierten Destillation auf die Säulenchromatographie Übernimmt Begriffe von Bodenhöhe und Bodenzahl Anschaulich, aber natürlich nur näherungsweise richtig, da die Annahme einer wiederholten Einstellung separater Gleichgewichte beim Vorliegen einer bewegten mobilen Phase eher unrealistisch ist

45 III Der chromatographische Prozeß III.11 Die Theorie der Böden 45 Bodenzahl Abb. 7: Beispiel eines Destillationsturms Bodenhöhe Boden

46 III Der chromatographische Prozeß III.11.1 Trennstufenhöhe und Trennstufenzahl Bodenhöhe = Trennstufenhöhe H Bodenzahl = Trennstufenzahl N z 46 Definition: Trennstufenhöhe Die Trennstufenhöhe H (die Höhe eines Theoretischen Bodens), oder HETP (height equivalent to one theoretical plate) ist die Strecke, auf der sich beim Fließen der mobilen Phase das Gleichgewicht einmal einstellt. Wovon sind Trennstufenhöhe H und Trennstufenzahl N z abhängig?

47 III Der chromatographische Prozeß III Beeinflussung von H und N Z Trennstufenhöhe und Trennstufenzahl werden beeinflußt von: Länge der Säule 47 H = L N z (21) N z = (22) L H

48 III Der chromatographische Prozeß III Bedeutung von H und N Z 48 H Bedeutung: L = N N z H minimal z = (21) (22) N Z maximal L H Trennung optimal N Z charakterisiert somit die Leistungsfähigkeit einer Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die Trennstufenzahl und somit die Trennleistung.

49 III Der chromatographische Prozeß III Einfluß von u m auf H und N Z vorgegebene Länge vorgegebene Porenweite vorgegebener Partikeldurchmesser 49 Für den Experimentator einzig variierbar soll der Fluß sein, bzw. die Fließgewschwindigkeit u m der mobilen Phase durch die Säule. Je größer der Fluß, desto weniger oft kann sich das Gleichgewicht einstellen -> Trennung schlechter!!! Je niedriger der Fluß, desto mehr kommen z.b. Diffusionsvorgänge ins Spiel -> Trennung schlechter!!!

50 III Der chromatographische Prozeß III Das H/u-Diagramm 50 Trennstufenhöhe H [µm] H/u-Kurve Minimum bei LC ca cm/s (GC: 1-3 cm/s) 0,5 1,0 1,5 Fließgeschwindigkeit u [ cm/s ] Abb. 8: H/u-Diagramm zur Bestimmung des optimalen Flusses

51 III Der chromatographische Prozeß III.12 Die van Deemter-Gleichung Hierbei handelt es sich um eine empirische Gleichung mit folgenden Größen: 51 H Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) A-Term B = A + + C u u m Longitudinal- Diffusion B-Term m (23) Stoffaustausch -Anteil C-Term

52 III Der chromatographische Prozeß III.12 Die van Deemter-Gleichung 52 Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) A-Term beschreibt die Bandenverbreiterung, die von der Geometrie der Festphasenteilchen und von der Packung dieser Teilchen in der Säule herrührt. Statistisch gesehen haben einige Probenmoleküle einen relativ kurzen Weg, während andere gezwungen sind, einen Umweg zu machen.

53 III Der chromatographische Prozeß III.12 Die van Deemter-Gleichung 53 Longitudinal- Diffusion B-Term berücksichtigt: Strömungsverteilung! Laminare Strömung (Molekültransport) ist in der Mitte zwischen zwei Partikeln größer als in der Nähe der Packungspartikel. berücksichtigt: Diffusion der Moleküle! beschreibt im H/u-Diagramm eine Hyperbel und ist in der LC zu vernachlässigen.

54 III Der chromatographische Prozeß III.12 Die van Deemter-Gleichung 54 Stoffaustausch -Anteil C-Term berücksichtigt: Kinetische Beiträge! Geschwindigkeit des Stoffaustausches zwischen stationärer und mobiler Phase. Geschwindigkeit des Massentransportes der Probenmoleküle in die Poren der stat. Phase und aus ihnen heraus.

55 III Der chromatographische Prozeß III.12 Die van Deemter-Gleichung Die H/u-Kurve erhält man nach Addition aller drei Terme der van-deemter- Gleichung: 55 Trennstufenhöhe H [µm] H/u-Kurve B-Term 10 0,5 1,0 1,5 C-Term A-Term Fließgeschwindigkeit u [cm/s] Abb. 9: H/u-Diagramm mit den Termen der Van-Deemter-Gleichung

56 III Der chromatographische Prozeß III.13 Zusammenfassung 56 In der Chromatographie ist man bestrebt, gute Trennungen in relativ kurzen Analysenzeiten durchzuführen. D.h. man versucht eine minimale Trennstufenhöhe bei möglichst flacher H/u Kurve zu erzielen. Dies läßt sich erreichen durch: Geringe Korngrößen (Einfluß auf A-Term und C-Term) Enge Korngrößenverteilung bzw. dichte Packung (Einfluß auf B-Term) Geringer Säulendurchmesser (Einfluß auf A-Term und B-Term)

57 III Der chromatographische Prozeß III.14 Bedeutung in der Praxis 57 Bei gut gepackten HPLC-Säulen liegt H beim Doppelten bis Fünffachen des mittleren Teilchendurchmessers d p. Beispiel: Bei einer 100 mm-säule, gepackt mit 5µm-Material Trennstufenhöhe: µm Trennstufenzahl:

58 Kapitel IV: Das Chromatogramm 58

59 IV Das Chromatogramm IV.1 Qualitative Aussagen 59 z.b. Zuordnung von Substanzen über identische Retentionszeit t R (x). Ggf. Injektion von Referenzsubstanzen. z.b. Identifizierung von Substanzen über UV-APEX-Spektren (Diodenarray), siehe Seminar und Praktikum. z.b. Identifizierung von Substanzen über Isoplot und 3-D-Plot.

60 IV Das Chromatogramm IV.1.1 Der Isoplot 60 Absorption 0 mau 100 mau Wellenlänge [nm] Abb. 10: Isoplot einer chromatographischen Trennung Zeit [min]

61 IV Das Chromatogramm IV.1.2 Der 3D-Plot 61 Zeit [min] Wellenlänge [nm] Abb. 11: 3D-Plot einer chromatographischen Trennung Absorption [mau]

62 IV Das Chromatogramm IV.2 Quantitative Aussagen 62 Die Fläche eines Peaks ist der eingespritzten Stoffmenge proportional Dadurch hat jede Substanz für jede Chromatographiebedingung ihren eigenen Proportionalitätsfaktor. Diese Proportionalitätsfaktoren können durch Injektion von Kalibriergemischen, die die zu bestimmenden Substanzen in bekannter Konzentration enthalten, ermittelt werden (Methode des Internen Standards - siehe Seminar und Praktikum)

63 IV Das Chromatogramm IV.3 Kenngrößen des Chromatogramms 63 Absorption [mau] Abb. 12: t m t R (X 1 ) t R (X 2 ) t S (X 1 ) t S (X 2 ) tr (X) = ts (X) + tm Zeit [s] Musterchromatogramm mit t S (X) als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phase

64 IV Das Chromatogramm IV.4 Das Gaußprofil 64 Absorption [mau] t m Abb. 13: t R (X 1 ) 2σ τ (X 1 ) t S (X 1 ) 4σ τ (X 1 ) = t w (x 1 ) h 1 p t S (X 2 ) t R (X 2 ) 2σ τ (X 2 ) 0.61 h 1 p 4σ τ (X2) = t w (x 2 ) h 2 p 0.61 h 2 p Musterchromatogramm mit σ τ (X) als Diffuse Bandenverbreiterung und t w als Basisbreite Zeit [s]

65 IV Das Chromatogramm IV.5 Berechnungsbeispiele 65 Beispiel: t m = 2 min 120 s t R (X1) = 5 min 300 s t R (X2) = 10 min 600 s k k 1 2 = = t t R R (X ) 1 tm 300 s 120 s = t 120 s m (X ) 2 tm 600 s 120 s = t 120 s m 15, 40,

66 IV Das Chromatogramm IV.6 Bewertung der Retentionsfaktoren 66 Optimale Trennung bei 1,5 < k < 5 k < 1,5 k > 5 Zu wenig Wechselwirkung zwischen Substanz und stationärer Phase Zu lange Analysenzeiten Zu breite Peaks

67 IV Das Chromatogramm IV.7 Das Problem schlecht getrennter Peaks 67 Absorption [mau] Abb. 14: t R (X1) t R (X2) Zeit [min] Chromatogramm mit schlecht aufgelöstem Peakpaar

68 IV Das Chromatogramm IV.8 Die Selektivität (Trennfaktor) α 68 beschreibt die Güte der Trennung zweier benachbarter Peaks Wird gebildet aus dem Quotienten der beiden Retentionsfaktoren k 1 und k 2 k2 ts α= = (X 2 ) mit k k k t α = 1 1 s (X 1 ) Keine Trennung 2 1 1< α < 5 optimale Trennung

69 IV Das Chromatogramm 69 IV.9 Die Auflösung R S Die geometrische Definition lautet: R S = Basisbreite vom Peak der Komponente X1 ( t t ) R (X 2 ) R (X 1 ) 05, ( t + t ) w (X 1 ) w (X 2 ) Basisbreite vom Peak der Komponente X2

70 IV Das Chromatogramm 70 IV.10 Bewertung der Auflösung R S R S = 1 Peaks liegen um ihre mittlere Basisbreite auseinander d.h. Überlappung 3% 1< R S < < R S < 1.5 R S > 1.5 fast vollständige (meist ausreichende) Trennung vollständige, gute Trennung meist unnötig gute Trennung d.h. zu lange Retentionszeit

71 Kapitel V: Literatur 71

72 V Literatur 72 Snyder L.R., Kirkland J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley. Meyer V.R., Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie, Salle+Sauerländer. Unger K.K., Handbuch der HPLC, GIT Verlag. Scott R.P.W., Chromatographic Detectors, Jack Cazes, Cherry Hill, New Jersey Huber L., George,S.A., Diode Array Detection in HPLC, Jack Cazes, Cherry Hill, NewJersey