Phänotyp-Analyse der CHIF knock-out Maus

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1 Aus dem Physiologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Phänotyp-Analyse der CHIF knock-out Maus INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt von Imeke Goldschmidt geboren in Münster

2 Dekan: Prof. Dr. Elmar Hellwig Erstgutachter: PD Dr. med. M. Bleich Zweitgutachter: Prof. Dr. M: Brandis Jahr der Promotion: 2002

3 Meinen Eltern

4 Inhalt INHALT 1 EINLEITUNG Die Rolle und Wirkung von Aldosteron Der kanalinduzierende Faktor CHIF Expression von CHIF in verschiedenen Geweben Die Regulation der Expression von CHIF Die Funktion von CHIF Die CHIF knock-out Maus Ziel der Arbeit METHODEN Versuchstiere und Standardbedingungen Die Genotypisierung Die Versuchsprotokolle Amiloridexperiment Vorbehandlung mit Glukokortikoiden Natriumarme Diät Kaliumreiche Diät Wasserentzug Die Messung der Na + -, K + - und Kreatininkonzentration in Plasma und Urin Blutentnahme, Uringewinnung und Probenvorbereitung Die Flammenphotometrie Die Kreatininmessung Die Fraktionelle Ausscheidung von Natrium und Kalium Die Messung der Urin-Osmolalität Die Messungen in der perfundierten Ussingkammer Die elektrische Meßanordnung in der Ussingkammer Der Aufbau der Kammer Die Präparation des Darmes Der Versuchsablauf Lösungen und Substanzen Statistik ERGEBNISSE Die Nierenfunktion der CHIF knock-out Maus unter Standardbedingungen Die Plasmawerte Die fraktionellen Ausscheidungen Die Nierenfunktion der CHIF knock-out Maus unter Stimulationsbedingungen Glukokortikoide Die Plasmawerte unter Glukokortikoiden Die fraktionelle Na + - und K + -Ausscheidung unter Glukokortikoiden Die Wirkung von Amilorid auf FE Na + und FE K + unter Glukokortikoiden Natriumarme Diät Die Plasmawerte unter natriumarmer Diät Die fraktionelle Na + - und K + -Ausscheidung unter natriumarmer Diät Die Wirkung von Amilorid auf FE Na + und FE K + unter natriumarmer Diät

5 Inhalt Kaliumreiche Diät Die Plasmawerte unter kaliumreicher Diät Die fraktionelle Na + - und K + -Ausscheidung unter kaliumreicher Diät Die Wirkung von Amilorid auf FE Na + und FE K + unter kaliumreicher Diät Die Anpassung der CHIF knock-out Maus an Wasserentzug Die Funktion des distalen Kolons der CHIF knock-out Maus V te und I' sc der CHIF knock-out Maus unter Standardbedingungen V te und I' sc in Ruhe sowie nach Gabe von Amilorid Die Wirkung von Forskolin und Carbachol auf V te und I' sc unter Standardbedingungen V te und I' sc nach Glukokortikoiden, natriumarmer und kaliumreicher Diät Die Wirkung von Amilorid auf V te und I' sc nach Glukokortikoiden, natriumarmer und kaliumreicher Diät Die Wirkung von Forskolin auf V te und I' sc nach Glukokortikoiden, natriumarmer und kaliumreicher Diät DISKUSSION Methoden Die Versuchstiere und die Versuchsprotokolle Die PCR zur Genotypisierung Die fraktionellen Ausscheidungen Die Messungen an der perfundierten Ussingkammer Osmolalitäten Der Salz- und Wasserhaushalt der CHIF knock-out Maus Der Verlust von CHIF wird unter Standardbedingungen voll kompensiert Glukokortikoide legen keinen Defekt in der Nierenfunktion der CHIF KO-Maus offen CHIF hat keinen Einfluß auf die Natriumbilanz unter Natriumrestriktion Der CHIF knock-out reduziert die Kaliumsekretion unter Natriumrestriktion Der CHIF knock-out hat keine Auswirkungen auf die Anpassung an eine kaliumreiche Diät CHIF hat keine Funktion in der Urinkonzentrierung Die Auswirkungen des CHIF knock-outs auf den Elektrolyttransport im distalen Kolon Der CHIF knock-out vermindert die elektrogene Na + -Resorption Der CHIF knock-out senkt die camp-aktivierte Chloridsekretion Der CHIF knock-out reduziert die Veränderung des I' sc durch CCH Die elektrogene Na + -Resorption unter Stimulationsbedingungen Die camp-aktivierte Chloridsekretion unter Stimulationsbedingungen Bedeutung der Ergebnisse: Annäherung an die Funktion von CHIF ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR DANKSAGUNG LEBENSLAUF VERÖFFENLICHUNGEN

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. ACTH AI AII AIP ATPase bp camp cdna CHIF DNS dntps EDTA ENaC FE g GFR HCl HEPES HPLC Abbildung Adrenocorticotropes Hormon Angiotensin I Angiotensin II Aldosteron-induziertes Protein Adenosin-Triphosphatase Basenpaare cyclisches Adenosin-Monophosphat komplementäre DNS, für englisch complementary deoxyribonucleic acid kanalinduzierender Faktor, für englisch channel inducing factor auch: Kortikosteroid-induzierter Faktor, für englisch corticosteroid hormone induced factor Deoxy-Ribonukleinsäure Deoxy-Nucleosid-Triphosphat Ethylendiamintetraacetat Epithelialer Natriumkanal, für englisch epithelial Na + -channel fraktionelle Ausscheidung osmotischer Koeffizient Glomeruläre Filtrationsrate Hydrochlorid N-[2-Hydroxyethyl]piperazino-N -2-ethansulfonsäure Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, für englisch high performance liquid chromatography 11 β-hsd 11 β-hydroxysteorid-dehydrogenase IMCD I sc I' sc kb KG KO Krea min MR 6 inneres medulläres Sammelrohr, für englisch inner medullary collecting duct Kurzschlußstrom äquivalenter Kurzschlußstrom Kilobasen Körpergewicht knock-out Kreatinin Minuten Mineralokortikoid-Rezeptor

7 Abkürzungsverzeichnis mrna NaCl OMCD PCR PLM RAAS RNA RNS R te s.c. SEM Taq TBHB TE U/min UV V te Wt Boten-Ribonukleinsäure, für englisch messenger ribonucleic acid Natriumchlorid äußeres medulläres Sammelrohr, für englisch outer medullary collecting duct Polymerase-Kettenreaktion, für englisch polymerase chain reaction Phospholemman Renin-Angiotensin-Aldosteron-System Ribonukleinsäure, für englisch ribonucleic acid Ribonukleinsäure transepithelialer Widerstand subcutan Standardabweichung des Mittelwertes, für englisch standard error of the mean Thermus aquaticus 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure Tris-HCl Ethylendiamintetraacetat Umdrehungen pro Minute Ultraviolett transepitheliales Potential Wildtyp 7

8 Einleitung Kapitel 1 1 EINLEITUNG Die Regulation des Salz- und Wasserhaushaltes ist für den Körper von essentieller Bedeutung. Der Mensch besteht zum größten Teil aus Wasser, dessen ca. 60% Anteil am Gesamtkörpervolumen sich auf Blutplasma, Interstitium, transzellulären und intrazellulären Raum verteilen. Die Ionenkonzentrationen in diesen Flüssigkeits-Kompartimenten beeinflussen das Plasmavolumen und damit den Blutdruck, das Zellvolumen und den ph-wert, das Membranpotential und die elektrische Erregbarkeit von Zellen (42,43). Um dieses wichtige Innere Milieu konstant zu halten, besitzt der Körper mehrere fein abgestimmte Regulationssysteme, die sich gegenseitig beeinflussen und ergänzen. Wichtigstes Zielorgan dieser Regulationsprozesse ist die Niere. 1.1 Die Rolle und Wirkung von Aldosteron Das Nebennierenrindenhormon Aldosteron spielt eine herausragende Rolle in der Regulation des Natrium- und Kaliumhaushaltes (72). Es stimuliert die Natriumchlorid- (NaCl) Resorption im distalen Nephron und Kolon sowie in Speichel- und Schweißdrüsen und erhöht die Ausscheidung von K + und H +. Aldosteron wird in der Zona Glomerulosa der Nebennierenrinde gebildet. Hauptstimulus für die Freisetzung von Aldosteron aus der Nebennierenrinde ist Angiotensin II (AII), das in das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eingebunden ist (Abbildung 1). Neben AII steigern auch Hyperkaliämie und Hyponatriämie sowie in geringerem Maße das adrenocorticotrope Hormon ACTH die Aldosteronsekretion (31,35). Die Wirkung von Aldosteron wird über den sogenannten Mineralokortikoid-Rezeptor (MR) vermittelt. MR ist ein intrazellulärer Transkriptionsfaktor, der durch die Bindung an Aldosteron aktiviert wird. Glukokortikoide binden mit gleicher Affinität an den MR, werden jedoch in Aldosteronzielgeweben durch das Enzym 11β Hydroxysteroid-Dehydrogenase (11β- HSD) inaktiviert und somit für die Bindung am MR untauglich (4,56,72). Dimerisierte Aldosteron-MR-Komplexe binden im Zellkern an regulative Deoxyribonucleinsäure (DNS) - Abschnitte und beeinflussen so die Transkriptionsrate von Genen, die für die sogenannten Aldosteron-induzierten Proteine (AIP) kodieren (21,90). Zu diesen AIPs zählen unter anderem am transepithelialen Natriumtransport beteiligte Proteine wie der epitheliale Na + -Kanal (englisch ENaC für Epithelial Na + Channel) (2,4,59) und die Na + -K + -Adenosintriphosphatase (Na + /K + -ATPase) (19,103), sowie an der Energiegewinnung beteiligte mitochondriale Enzyme (40,90). ENaC wird in distalen Nephronabschnitten, im distalen Kolon sowie in den 8

9 Kapitel 1 Einleitung Ausführungsgängen von Speichel- und Schweißdrüsen exprimiert (20). Er ist in diesen Geweben der Hauptträger der Na + -Resorption und gilt als wichtigstes Zielprotein der Aldosteronwirkung. - Blutdruckabfall - [NaCl] im Macula densa Segment des distalen Nierentubulus - Sympathikusaktivierung - Prostaglandine und Kinine _ Renin _ atriales natriuretisches Peptid (ANP) Angiotensinogen Angiotensin I (AI) Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) Angiotensin II (AII) - antidiuretisches Hormon (ADH) - Durst, Salzhunger - periphere Vasokonstriktion - NaCl-Absorption im Nierentubulus Aldosteron - Hyperkaliämie - Hyponatriämie - Blutdruckabfall - adrenocorticotropes Hormon (ACTH) Abb. 1: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). Renin wird in den Wandzellen der afferenten Arteriole der Glomerula produziert. Freigesetztes Renin spaltet das in der Leber synthetisierte und frei zirkulierende α 2 - Globulin Angiotensinogen in Angiotensin I. Dieses wiederum wird durch das Angiotensin-Konversions-Enzym in Angiotensin II (AII) gespalten. Die Steigerung der Transkription von ENaC und Na + /K + -ATPase führt erst nach ca. drei Stunden zu einer Vermehrung der Transporter auf Proteinebene (72,93). Trotzdem wird unter Aldosteron-Stimulation bereits nach weniger als einer Stunde eine Steigerung des Natriumtransports beobachtet (91). Daher nimmt man die Aktivierung bereits vorhandener Kanäle und Pumpen durch Aldosteron an, möglicherweise vermittelt durch die Transkription anderer, bislang unbekannter AIPs (90,92). In den letzten Jahren wurde für zwei Proteine eine Regulation durch Aldosteron innerhalb der sogenannten Frühphase der Aldosteronwirkung (1-2h) nachgewiesen (85,86,91,94). Es handelt sich zum einen um das G-Protein K-Ras 2, das offenbar nach Induktion durch Aldosteron die Aktivität von vorhandenen ENaC-Kanälen 9

10 Einleitung Kapitel 1 erhöht (46), und zum anderen um die Aldosteron-induzierte Kinase sg, die ebenfalls die ENaC Aktivität steigert (16,66,81). Ein weiterer Kandidat für eine Rolle innerhalb der Vermittlung der akuten wie der späten Aldosteronwirkung ist das 1995 entdeckte Peptid CHIF (3). 1.2 Der kanalinduzierende Faktor CHIF Die Abkürzung CHIF steht für channel inducing factor (Kanal induzierender Faktor, später corticosteroid hormone induced factor Kortikosteroid-induzierter Faktor). Es handelt sich dabei um ein kurzes Polypeptid (87 Aminosäuren, 6,5 kda) mit zwei membranspannenden Domänen (79), dessen mrna 1995 aus dem distalen Kolon von mit Dexamethason vorbehandelten Ratten isoliert wurde (3) Expression von CHIF in verschiedenen Geweben CHIF mrna ist in Untersuchungen an Ratten-Gewebe bisher fast ausschließlich im distalen Kolon sowie im Sammelrohr der Niere nachgewiesen worden (3,13,10,96,97). Geringe Expression fand sich auch im proximalen Kolon (10), nicht aber in anderen Nephronabschnitten oder anderen Organen wie Gehirn, Herz- oder Skelettmuskel, Uterus, Brustdrüsen, Lunge, Plexus choroideus, Schweißdrüsen oder Haut (3,14,96). Im Epithel des Dickdarms wird CHIF an der Oberfläche der Kolonkrypten exprimiert, während es an der Kryptbasis nicht zu finden ist. Im Sammelrohr der Niere wird CHIF sowohl in den Hauptzellen des kortikalen Abschnitts wie auch in den Zellen des medullären Sammelrohrs exprimiert, wobei die Expression im kortikalen Sammelrohr schwach ist und im weiteren Verlauf des Sammelrohrs zunimmt (13,3,96). Mittels Immunolokalisation wurde gezeigt, daß CHIF sowohl im distalen Kolon wie auch im Sammelrohr in der basolateralen Membran der Epithelzellen sowie zu einem sehr geringen Teil im Zytoplasma zu finden ist, nicht jedoch in der luminalen Membran (79). 10

11 Kapitel 1 Einleitung Die Regulation der Expression von CHIF Die Expression von CHIF wird in Kolon und Niere über unterschiedliche Mechanismen reguliert. In der Niere wird CHIF konstitutiv exprimiert. Die Gabe von Kortikosteroiden führt nicht zu einer weiteren Steigerung der Expression. Hyperkaliämie sowie eine metabolische Azidose erhöhen die Expression von CHIF, Hypokaliämie senkt sie. Die Reaktion auf den Kaliumspiegel ist abhängig von einer intakten Nebenniere (10,13,14,96,97). Erst kürzlich konnte auf Proteinebene gezeigt werden, daß auch Natriumrestriktion die Expression von CHIF in der Niere erhöht (79). Die Expression von CHIF im distalen Kolon ist unter Standardbedingungen schwach und steigt erst nach Gabe von Kortikosteroiden deutlich an (96). Interessant ist hier, daß CHIF bereits ein bis vier Stunden nach Steroidgabe vermehrt transkribiert wird (10). Die Wirkung von Kortikosteroiden wird offenbar hauptsächlich über den Mineralokortikoid-Rezeptor vermittelt (96). Neben Kortikosteroiden führen auch eine natriumarme Diät, Hyperkaliämie sowie eine metabolische Azidose zu einer Steigerung der Expression von CHIF im Kolon, während Hypokaliämie die Expression senkt. Dabei scheint die Wirkung der natriumarmen Diät über eine Erhöhung des Aldosteronspiegels vermittelt zu werden, während der Einfluß der Plasma- Kaliumkonzentration vermutlich über Aldosteron-unabhängige Mechanismen erfolgt (10,13,14, 96,97) Die Funktion von CHIF Die genaue Funktion von CHIF ist bisher unklar. Die organspezifische Expression sowie die Regulation von CHIF durch Aldosteron, Dexamethason sowie die Plasma-Konzentrationen von Natrium und Kalium legen nahe, daß es als Regulator oder Modulator in den epithelialen Ionentransport und in die Regulation des Wasser- und Salzhaushalts eingebunden ist. Die antinatriuretische Wirkung von Aldosteron tritt bereits innerhalb von Minuten nach Applikation auf (72). CHIF ist neben K-Ras und sgk eines der wenigen Peptide, für die tatsächlich eine Regulation (primäre Steigerung der Transkription) durch Aldosteron in diesem Zeitrahmen nachgewiesen wurde (10). Der große Einfluß des Kaliumhaushaltes auf die Expression von CHIF läßt wiederum an eine Rolle in der Erhaltung der Kalium-Homöostase denken. 11

12 Einleitung Kapitel 1 Zusätzlich zeigt CHIF starke Homologien zu anderen Peptiden, denen eine regulatorische Funktion an bestehenden Kanälen zugeschrieben wird. Dies sind die γ-untereinheit der Na + /K + -ATPase (6,49,52), Phospholemman (PLM) (60), das in Xenopus Oozyten Chloridströme induziert (53,54), und Mat-8, ein Tumormarker, der in Brustdrüsentumoren exprimiert wird und ebenfalls Chloridströme induziert (57). Angesichts der Lokalisation von CHIF in der basolateralen Zellmembran wäre eine regulatorische Interaktion mit basolateralen Transportproteinen wie der Na + /K + -ATPase oder mit basolateralen Kaliumkanälen denkbar Die CHIF knock-out Maus Die CHIF knock-out Maus (CHIF KO-Maus) wurde mittels homologer Rekombination im Labor von Haim Garty (Weizman Institute of Science, Rehovoth, Israel) hergestellt und uns für unsere Untersuchungen freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Homozygote CHIF KO-Mäuse sind rein äußerlich nicht von ihren (heterozygoten oder homozygot normalen) Geschwistern zu unterscheiden. Sie zeigen eine normale Entwicklung und Gewichtszunahme nach der Geburt und sind unter Standardbedingungen ohne Einschränkung lebensfähig und fruchtbar. 1.3 Ziel der Arbeit Ziel der Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob CHIF eine Rolle in der Regulation des Salz- und Wasserhaushaltes spielt (10,14,96,97). Wir untersuchten den Phänotyp von CHIF knock-out Mäusen im Vergleich zu genetisch unveränderten Mäusen. Dies erfolgte unter Standard- sowie unter verschiedenen Stimulationsbedingungen (hohe Kaliumaufnahme, Natrium-Restriktion, Vorbehandlung mit Glukokortikoiden), für die eine vermehrte Expression von CHIF beschrieben worden war (10,13,14,96,97). Im Einzelnen untersuchten wir die fraktionelle Kalium- und Natriumausscheidung in der Niere sowie den Ionentransport im distalen Kolon. 12

13 Kapitel 2 Methoden 2 METHODEN 2.1 Versuchstiere und Standardbedingungen Als Versuchstiere dienten Mäuse, deren CHIF-Gen durch Einsatz eines Targetingvektors inaktiviert worden war. Für den ursprünglichen knock-out waren 129/J Mäuse mit Mäusen vom Stamm 129/Sv-CP gekreuzt worden, die im Laufe der Zeit mit weißen MF1 Mäusen zurückgekreuzt wurden. Da sich die KO-Mäuse als lebensfähig und fruchtbar erwiesen, konnten in Freiburg sowohl Kontroll- wie auch KO-Mäuse durch Verpaarung homozygoter Eltern weitergezüchtet werden. Zur Ergänzung der Kontrollpopulation wurden Wildtyp-Tiere des verwandten Stammes 129/Sv PAS Ico (Institut Pasteur, Paris, Frankreich) hinzugekauft. Diese Tiere zeigten mit Ausnahme der Plasma-Natriumkonzentration keinen Unterschied zu den Wildtyp-Tieren aus eigener Zucht. Soweit nicht anders vermerkt, bestehen die Kontrollgruppen sowohl aus den Wildtyp-Mäusen aus eigener Züchtung als auch aus hinzugekauften 129/Sv PAS Ico Mäusen. Alle Versuchstiere wurden in keimarmer Umgebung gehalten und hatten, soweit nicht anders beschrieben, freien Zugang zu Trinkwasser und Standardfutter (Standardbedingungen). Im Alter von fünf Tagen wurden die Mäuse durch Kupierung der Endphalangen individualisiert und anhand der Gewebeproben der Genotyp bestimmt (s.u.). Für die Experimente wurden Mäuse im Alter von sechs bis zehn Wochen verwendet. 2.2 Die Genotypisierung Zur Genotypisierung wurde DNS aus dem bei der Kupierung gewonnenen Zehengewebe aufgereinigt (Nucleon DNA extraction kit, Amersham Life Science, Little Chalfot, Großbritannien). Im Einzelnen wurden hierzu die zerkleinerten Gewebeproben für zehn Stunden bei 56º C mit Proteinase K verdaut (Trio Thermoblock, Biometra, Göttingen, Deutschland). Anschließend wurde die DNS über Versetzen mit Perchloratlösung und Chloroform und anschließende Fällung mit Isopropanol aus dem Verdau extrahiert und nach Waschen mit 70% Ethanol in 0,1-fach konzentriertem TE-Puffer (Tris-HCl 10 mmol/l, Ethylendiamintetraacetat (EDTA) 1 mmol/l, ph = 8) gelöst. Die gereinigte DNS wurde dann als Matrize bei einer Polymerasekettenreaktion (PCR für englisch polymerase chain reaction) eingesetzt. Der PCR-Ansatz von 25 µl enthielt dabei PCR- Puffer, dntps 5 nmol, MgCl 2 37,5 nmol, Taq-Polymerase 0,5 U (alles Gibco, Gaithersburg, USA), H 2 O und jeweils 12,5 pmol Primer. 13

14 Methoden Kapitel 2 Grundlage der Genotypisierung war die Vervielfältigung des CHIF-Allels, das in der CHIF KO-Maus vom Wildtyp verschieden ist (Abb. 2). Die transkribierte Region des Gens enthält 8 Exone. Im rekombinierten CHIF Gen sind ein Teil des Exon 2 sowie die Exone 3 und 4 durch die Neokassette ersetzt. 289 bp Exone Wildtyp 5' - Primer 3' - WT Primer Exone NEO knock-out 5' - Primer 3' - KO-Primer 428 bp Abb. 2: Wildtyp- (Wt) und KO-Allel des CHIF-Gens. Die Neokassette im KO-Allel (Neo = Neomycinresistenz) ersetzt die Exone 3 und 4 sowie einen Teil des Exons 2. Der 5 -Primer bindet an beide Allele, während die 3 - Primer allelspezifisch sind. Bei der PCR entstehen für das Wt-Gen ein Produkt von 289 Basenpaaren (bp) Länge, für das rekombinierte Gen ein 428 bp langes Produkt. Für jede Maus wurden zwei PCR-Reaktionen angesetzt: Beide enthielten einen 5'-Primer, der ca. 160 Basenpaare (bp) in 5' Richtung vor dem Beginn der Neokassette (Deletionspunkt) liegt und damit mit dem Wildtypallel sowie mit dem veränderten Allel hybridisiert (5'- GGTAGGACCTACTCACAGGAGA-3') (Abb. 2). Der erste Ansatz enthielt zusätzlich einen wildtypspezifischen 3'-Primer (5'-GCTCCAAGTGAGGTAGGTGTCT-3'), der an eine Wildtyp-Sequenz ca. 130 bp in 3 Richtung hinter dem Deletionspunkt bindet. Der zweite Ansatz enthielt einen KO-spezifischen Primer (5'-CTGCACGAGACTAGTGAGACGT-3'), der an eine Sequenz im Targetingvektor bindet, die ca. 270 bp in 3'-Richtung hinter dem Einsatzpunkt der Neokassette liegt. Alle Primer wurden uns von Dr. Gabor Igloi, Freiburg, zur Verfügung gestellt. Damit ergab sich in der PCR für das Wt-Allel im ersten Ansatz ein Amplifizierungsprodukt von 289 bp Länge und für das KO-Allel im zweiten Ansatz ein Produkt von 428 bp Länge. Für heterozygote Mäuse ergab sich in beiden Ansätzen ein entsprechendes Amplifizierungsprodukt. Die Größenbestimmung der amplifizierten Nukleinsäurefragmente erfolgte durch elektrische Auftrennung in Agarosegelen. Gele aus TE-Puffer und Agarose (20g/l) wurden mit Ethidiumbromid (0,1 g/l) versetzt, das mit den Basen der DNS-Fragmente interkaliert und bei Anregung durch UV-Licht fluoresziert. Zusammen mit einem Ladepuffer (Bromphenolblau (2 14

15 Kapitel 2 Methoden g/l), Glycerol (600 g/l), TE-Puffer (400 ml/l)) wurden die Proben in je eine Geltasche eingebracht und für 20 min bei einer Spannung von 100 V aufgetrennt. Unter UV-Licht konnte schließlich anhand eines Markers die Größe der verschiedenen Fragmente festgestellt werden (Abb. 3). Zur Dokumentation der Ergebnisse wurden die Gele photographiert. Marker 100 bp Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 1 Ansatz 2 { { { +/- -/- +/+ 428 bp 289 bp Abb. 3: Gelelektrophorese zur Bestimmung des Genotyps: Für jede Maus wurden zwei PCR- Ansätze untersucht. Beide Ansätze enthielten den gleichen 5 -Primer. Ansatz 1 enthielt zusätzlich einen wildtyp-spezifischen 3 -Primer, während der 3 -Primer in Ansatz 2 spezifisch für das KO-Allel war. In der Ethidiumbromid- Agarose-Gelelektrophorese lassen sich das 289 bp große Fragment für das Wildtyp-Allel (+/+) und das 428 bp große Fragment des mutierten Allels (-/-) unterscheiden. Heterozygote Mäuse (+/-) weisen zwei PCR-Produkte auf. 2.3 Die Versuchsprotokolle Amiloridexperiment Unter Standardbedingungen, nach Vorbehandlung mit Glukokortikoiden sowie vor Beginn und nach Abschluß der natriumarmen und kaliumreichen Diät untersuchten wir die Wirkung von Amilorid auf die fraktionellen Ausscheidungen von Na + und K +. Zu diesem Zweck wurde den Mäusen nach Gewinnung einer ersten Urinprobe Amilorid (5 mg/kg KG) subkutan (s.c.) injiziert. Die Entnahme der zweiten Urinprobe erfolgte zweieinhalb Stunden später Vorbehandlung mit Glukokortikoiden 40 mg/kg Körpergewicht (KG) Triamcinolon (Delphicort R, Lederle, Wolfratshausen, Deutschland) wurden subkutan 72, 48 und 24 Stunden vor dem Experiment injiziert. Am Morgen des Experimentiertags wurde zunächst ein Amiloridexperiment durchgeführt. Anschließend wurden die Mäuse getötet und das Kolon in der Ussingkammer untersucht Natriumarme Diät Die Versuchstiere erhielten für vierzehn Tage natriumarmes Futter (Na + 0,136 g/kg, K + 7,17 g/kg, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) bei freiem Zugang zu normalem Trinkwasser. Nach dem Amiloridexperiment am vierzehnten Tag wurden die Mäuse getötet und das Kolon in der Ussingkammer untersucht. 15

16 Methoden Kapitel Kaliumreiche Diät Für zehn Tage erhielten die Versuchstiere ausschließlich Futter mit einem Kaliumgehalt von 80g/kg (Na + 2,5 g/kg) (Altromin GmbH, Lage, Deutschland) bei freiem Zugang zu normalem Trinkwasser. Nach dem Amiloridexperiment am zehnten Tag wurden die Mäuse getötet und das Kolon in der Ussingkammer untersucht Wasserentzug Nach Abnahme einer Urinprobe wurde den Mäusen für insgesamt 21 Stunden der Zugang zu Trinkwasser entzogen. Während dieser Zeit hatten sie weiterhin freien Zugang zu Standardfutter. Urinabnahmen erfolgten nach 12, 15, 18 und 21 Stunden. Nach der letzten Urinprobe wurde unter Narkose Blut aus der Schwanzvene und aus dem Herzen entnommen. 2.4 Die Messung der Na + -, K + - und Kreatininkonzentration in Plasma und Urin Blutentnahme, Uringewinnung und Probenvorbereitung Die Urinproben wurden durch spontane Miktion der Mäuse auf eine desinfizierte Glasunterlage gewonnen. Zur Entnahme von venösem Blut wurden die Mäuse in einer Kunststoffröhre unter Infrarotlicht für sieben Minuten gewärmt. Eine der beiden durch die erhöhte Durchblutung gut sichtbaren Schwanzvenen wurde mit einem Skalpell punktiert und ca. 150 µl Blut in heparinisierte Glasröhrchen aufgesaugt. Nach der anschließenden Zentrifugation des Blutes (13500 U/min, 5 Minuten, Zentrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) konnte der Hämatokrit abgelesen werden. Zur Bestimmung des Kreatininspiegels im Plasma war aus meßtechnischen Gründen eine größere Blutprobe nötig. Dafür wurden die Tiere zunächst mit 4 mg/kg KG Xylazin (Rompun, Bayer, Leverkusen, Deutschland) und 100 mg/kg KG Ketamin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland; gelöst in 0,9% NaCl) intraperitoneal narkotisiert. Anschließend wurde der Thorax eröffnet, die untere Hohlvene durchtrennt und das Blut mit einer heparinisierten Spritze aus der Brusthöhle aspiriert. Alle Blutproben wurden für drei Minuten bei U/min zentrifugiert, um Plasma zu gewinnen. Hämolytische Proben wurden gekennzeichnet. Alle Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -18 C aufbewahrt und nach dem Auftauen gründlich geschüttelt und zentrifugiert. 16

17 Kapitel 2 Methoden Die Flammenphotometrie Die Bestimmung der Na + - und K + -Konzentration in Plasma und Urin wurde mit einem Standard-Flammenphotometer (FCM 6341, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Die Grundlage der Flammenphotometrie ist die Emission elementspezifischer Wellenlängen (sog. Spektrallinien), die durch das Einsprühen einer Elektrolytlösung in eine Flamme erzeugt werden (34). Das emittierte Licht wird durch ein Interferenzfilter geleitet und trifft auf einen Photoempfänger, der das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umwandelt. Die Intensität des auf den Photoempfänger treffenden Lichtsignals ist proportional der Anzahl der angeregten Atome und somit der Konzentration der eingesprühten Elektrolytlösung bei konstanter Volumenstromstärke. Um die Konzentration einer Elektrolytlösung störungsfrei messen zu können, bedient sich die Flammenphotometrie zusätzlich des sogenannten Leitlinienprinzips (89): Sowohl den Proben- als auch den Eichlösungen war Lithium in einer bekannten Konzentration (5 mmol/l) beigefügt. Mit Hilfe der spezifischen Kennlinie des Lithiums kann durch Quotientenbildung die Konzentration der Elektrolyte in den Probenlösungen unabhängig von der Volumenstromstärke errechnet werden Die Kreatininmessung Die Konzentration von Kreatinin, einem endogenen Metaboliten des Muskelstoffwechsels, bestimmten wir mit einer enzymatischen Methode (Crea-Plus, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland). Kreatinin wird hierbei unter Einwirkung von Kreatininase zu Kreatin hydrolysiert. Dieses wiederum wird dann unter Einwirkung von Kreatinase zu Sarcosin und Harnstoff hydrolysiert. Sarcosin kann von Sauerstoff unter Mitwirkung von Sarcosinoxidase zu Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxyd umgesetzt werden. Das entstehende Wasserstoffperoxyd bildet mit 4- Aminophenazon und TBHB (2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure) unter katalytischer Wirkung der Peroxidase einen Chinoniminfarbstoff, dessen Farbintensität der Kreatininkonzentration direkt proportional ist und photometrisch bestimmt werden kann. Diese Messungen wurden freundlicherweise im Zentrallabor des Universitätsklinikums Freiburg durchgeführt, wo der Crea-Plus Testansatz routinemäßig verwendet wird. 17

18 Methoden Kapitel Die Fraktionelle Ausscheidung von Natrium und Kalium Unter der fraktionellen Ausscheidung einer Substanz versteht man das Verhältnis von im Urin ausgeschiedener zu in den Primärharn filtrierter Menge. Die Angabe der fraktionellen Ausscheidung einer Substanz ist im Gegensatz zu ihrer Urinkonzentration unabhängig von der Konzentrierung des Urins und erlaubt deshalb den Vergleich zwischen verschiedenen Experimentalgruppen. Die Berechnung der fraktionellen Na + -Ausscheidung erfolgte nach folgender Formel: FE Na + [ Na ] U [ Kr] = + [ Na ] [ Kr] P P U FE Na [Na + ] U [Na + ] P [Kr] P [Kr] U fraktionelle Na + -Ausscheidung Na + -Konzentration im Urin Na + -Konzentration im Plasma Kreatininkonzentration im Plasma Kreatininkonzentration im Urin Die Berechnung der fraktionellen K + -Ausscheidung erfolgte auf entsprechende Weise. 2.6 Die Messung der Urin-Osmolalität Die Bestimmung der Osmolalität von Urinproben wurde mit einem Standard-Osmometer (Semi-Micro-Osmometer, Knauer, Berlin, Deutschland) durchgeführt. Grundlage der Messung ist die Erniedrigung des Gefrierpunkts einer Elektrolytlösung im Vergleich zu destilliertem Wasser abhängig von der Konzentration der Lösung (1): Bei kontinuierlicher Kühlung von Wasser sinkt dessen Temperatur zunächst unter 0 C und steigt, sobald das Gefrieren durch Vibration eingeleitet wird, wieder an. Wasser erreicht dabei ein Temperaturplateau bei seiner Gefriertemperatur 0 C. Das Temperaturplateau und damit der Gefrierpunkt von wässrigen Lösungen liegt unterhalb von 0 C. Die Gefrierpunkterniedrigung T (im Vergleich zu 0 C) ist ein Maß für die Osmolalität einer Lösung, die auf dem Meßgerät direkt abgelesen werden kann. Gemessen wurden jeweils 200 µl 1:20 verdünnten Urins. Die eigentlichen Osmolalitäten wurden dann anhand des Verdünnungsfaktors errechnet. Zuvor war eine Kurve erstellt worden, die die Linearität der Meßergebnisse von Lösungen unterschiedlicher Verdünnungsgrade bestätigte. 18

19 Kapitel 2 Methoden 2.7 Die Messungen in der perfundierten Ussingkammer Die elektrische Meßanordnung in der Ussingkammer Epithelien, die Ionen und damit elektrische Ladungen transportieren, können auf diese Weise elektrische Potentialdifferenzen zwischen apikaler und basolateraler Epithelseite erzeugen. Hans H. Ussing entwickelte 1952 eine Methode, mit deren Hilfe der den zugrundeliegenden Transportprozessen entsprechende Strom gemessen werden kann (41). In einer von Lösung durchspülten Meßkammer, die von einem Epithel in zwei Hälften getrennt wird, entsprechen die Kammerhälften der basolateralen und apikalen Seite des Epithels. Sofern die Lösungen auf beiden Seiten des Epithels gleich sind, beruht eine Potentialdifferenz zwischen den Kammerhälften auf epithelialen Transportprozessen. Durch Kurzschließen der beiden Kammern wird das transepitheliale Potential auf Null geklemmt. Der dann meßbare Kurzschlußstrom I sc entspricht dem aktiven Transport über das Epithel. In dem von uns verwendeten alternativen Meßaufbau wurde das transepitheliale Potential V te nicht auf Null geklemmt, sondern mit einem dem Epithel parallel geschalteten Spannungsmeßgerät gemessen. Dessen hochohmiger Widerstand verhinderte einen Kurzschluß. Wurden dann über einen Impulsgenerator (Dr. U. Fröbe, Physiologisches Institut Freiburg, Deutschland) Stromstöße I o über das Epithel geleitet, erzeugten diese einen vom Widerstand des Epithels R te abhängigen Spannungsabfall V te. Der epitheliale Widerstand R te konnte nach dem Ohmschen Gesetz aus dem Spannungsabfall V te und dem Injektionsstrom I o ermittelt werden: R te V = I0 te Damit ließ sich aus R te und dem transepithelialen Potential der äquivalente Kurzschlußstrom I' sc berechnen - d.h. der Strom, der bei einem Kurzschluß des Epithels fließen würde. I' = sc V R te te Transepitheliales Potential V te und Spannungsabfall V te wurden von einem Schreiber (Abimed, Düsseldorf, Deutschland) aufgezeichnet und anhand des Ausdrucks ausgewertet. Dabei wurde der Leerwiderstand der Kammer vom Epithelwiderstand subtrahiert und die Spannungsnull aus dem Wert vor und nach dem Experiment gemittelt. 19

20 Methoden Kapitel Der Aufbau der Kammer Das Kammervolumen betrug 1 ml. Die Kammer wurde kontinuierlich mit einer Flußrate von ml/min durchströmt, wobei sowohl die Badlösung als auch die Kammer selbst auf 37 C geheizt waren. Der Injektionsstrom von 1,5 µa wurde alle 5 s für eine Dauer von 1s appliziert (Abb. 4 a und b) Abb. 4 a und b: Originalphoto (a) und Schemazeichnung (b) einer perfundierten Ussingkammer. Die Kolonmukosa (6) wird zwischen die zwei Hälften des Kammereinsatzes (1) gespannt. Dieser wird dann in die Kammer (4) eingesteckt. Beide Epithelseiten werden kontinuierlich mit Experimentallösung perfundiert. Über 4 5 Silberdrahtelektroden (3) wird der Strom I 0 injiziert. Abb. 4 a Abb. 4 b Der Spannungsabfall V te wird dann über eine mit 1 M KCl-Lösung hergestellte Agarbrücke von einer in 1 M KCl eingetauchten Ag-AgCl- Elektrode (2) aufgezeichnet. Die Kammer wird über einen Heizblock (5) auf 37 C erwärmt. Ein über Dreiwegehähne verbundenes Zuflußsystem ermöglicht den fließenden Wechsel der Badlösungen Die von uns verwendeten Kammereinsätze (Abb. 4 c) hatten eine Öffnung von 7,06 mm 2. Die präparierte Darmschleimhaut wurde direkt von einem Glasstab auf den Gewebeträger aufgebracht und dann in die Kammer eingesetzt. 20

21 Kapitel 2 Methoden 1 2 Abb. 4 c: Der Gewebeträger, der als Kammereinsatz dient. Die Kolonmukosa wird auf den Ring (1) abgerollt und die beiden Hälften des Einsatzes werden zusammengesetzt. Die Ausspaarung (2) in der zweiten Trägerhälfte ist so angepaßt, daß das Gewebe fest im Kammereinsatz verankert wird und eine elektrische Abdichtung zwischen den Kammerhälften entsteht Die Präparation des Darmes Die Tiere wurden in Narkose nach Thorakotomie durch Durchtrennung der Hohlvenen getötet und die Bauchhöhle eröffnet. Nach Anspülen des Kolons mit Kolonaufbewahrungslösung (siehe 2.8) von rektal wurde das proximale Kolon vorsichtig mit der Pinzette gegriffen und analwärts stumpf vom Mesenterium getrennt. Anschließend wurde das distale Kolon durch Scherenschnitt an der Grenze zum proximalen Kolon und am Rektum vorsichtig herausgetrennt und in einer mit 4 C kalter Aufbewahrungslösung gefüllten Petrischale mit der Epithelseite nach innen auf einen angefeuchteten Glasstab aufgezogen. Nach einer feinen Inzisur mit dem Skalpell im proximalen Anteil des Präparats konnte die Bindegewebs- und Muskelschicht unter dem Mikroskop vorsichtig abgestreift werden, so daß nur Epithel und Submukosa erhalten blieben. Anschließend wurde das Päparat mit dem Skalpell in Längsrichtung aufgeschnitten und direkt vom Glasstab auf den Gewebeträger aufgebracht. Die komplette Präparation dauerte vom Tod des Tieres bis zum Einsatz des Gewebes in die Ussingkammer ungefähr 15 Minuten. Aufgrund der Dauer der einzelnen Experimente (ca. 50 Minuten) wurde üblicherweise von jedem Tier nur ein Präparat verwendet Der Versuchsablauf Nach Einsetzen des Präparats in die Ussingkammer wurde zunächst für zehn Minuten von luminal Amilorid 5x10-5 mol/l gegeben, um dem Epithel eine Erholung unter gleichzeitiger Schonung der Natriumtransportprozesse zu ermöglichen. Die Wirkung von Amilorid wurde durch Auswaschen der luminalen Lösung mit Kontrollösung und erneute Amiloridgabe bestimmt. Auswasch- und Einwascheffekt wurden anschließend gemittelt. 21

22 Methoden Kapitel 2 Im weiteren Verlauf wurde Amilorid 5x10-5 mol/l in der luminalen Perfusionslösung konstant beibehalten. Carbachol 10-4 mol/l wurde basolateral für drei Minuten gegeben und anschließend wieder ausgewaschen. Es folgte die basolaterale Gabe von Forskolin 5x10-6 mol/l und, nach Stabilisierung des transepithelialen Potentials, unter Forskolin nochmals basolateral die Gabe von Carbachol 10-4 mol/l. 2.8 Lösungen und Substanzen Als Kontrollösung wurde bei den Ussingkammer-Experimenten eine isotone modifizierte Ringerlösung verwendet. Diese setzte sich aus 145 mmol/l NaCl, 0,4 mmol/l KH 2 PO 4, 1,6 mmol/l K 2 HPO 4 *3 H 2 O, 5 mmol/l Glucose, 1 mmol/l MgCl 2 *6 H 2 O und 1,3 mmol/l Ca- Gluconat zusammen. Die Präparation des distalen Kolons erfolgte in einer speziellen Aufbewahrungslösung, die 127 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l Glucose, 1 mmol/l MgCl 2 *6 H 2 O, 5 mmol/l Na-Pyruvat, 10 mmol/l N-[2-Hydroxyethyl]piperazino-N -2- Ethansulfonsäure (HEPES) und 1,25 mmol/l CaCl 2 *2 H 2 O enthielt. Die Kontrollösung war phosphatgepuffert, während der Kolonaufbewahrungslösung HEPES als Puffer beigefügt war. Beide Lösungen wurden auf ph 7.4 eingestellt. Für die Ussingkammer-Experimente enthielten alle Lösungen Indomethacin 10-6 mol/l. Die Substanzen für die Experimentallösungen (Amilorid 5x10-5 mol/l, Carbachol 10-4 mol/l und Forskolin 5x10-6 mol/l sowie Indomethacin) wurden der Kontrollösung zugesetzt und der ph- Wert gegebenenfalls neu eingestellt. Alle verwendeten Chemikalien waren von höchstem verfügbaren Reinheitsgrad (Sigma, Deisenhofen; Merck, Darmstadt; und Böhringer, Mannheim; Deutschland). 2.9 Statistik Alle Versuchsergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwertes (SEM) angegeben. Dabei ist SEM = σ n 1 n wobei und σ der Standardabweichung der Stichprobe n der Anzahl der Beobachtungen entspricht. 22

23 Kapitel 2 Methoden Zur Prüfung auf Signifikanz wurde bei gepaart erhobenen Daten der zweiseitige gepaarte t-test durchgeführt. Der t-wert (t) wurde ermittelt gemäß d t = SEM d d = Mittelwert der Differenzen. Bei ungepaarten Daten kam der ungepaarte t-test zum Einsatz. Dabei war der t- Wert t = x x 1 2 σ 1 2 n + σ n x 1,2 = Mittelwerte. Als Signifikanzgrenze wurde p<0,05 angesehen. Signifikante Unterschiede sind in den Abbildungen durch einen Stern bzw. durch gekennzeichnet. 23

24 Ergebnisse Kapitel 3 3 ERGEBNISSE 3.1 Die Nierenfunktion der CHIF knock-out Maus unter Standardbedingungen Die Plasmawerte Der knock-out des CHIF Gens bleibt ohne signifikante Auswirkungen auf die Plasma- Parameter des Salz- und Wasserhaushaltes. Die Plasma K + -Konzentration der knock-out Tiere lag bei 6,34±0,14 mmol/l (n=34), die der Wildtyptiere bei 6,51±0,14 mmol/l (n=27). Die Plasma Na + -Konzentration betrug bei den CHIF knock-out Mäusen 141,21±0,54 mmol/l (n=38) und in der Wildtypgruppe 141,97±0,90 mmol/l (n=16). Die Plasma-Kreatininkonzentration als indirektes Maß für die Filtrationsfunktion der Niere war mit 9,19±0,42 µmol/l (n=10) in der knock-out Maus ebenfalls nicht signifikant verschieden von der des Wildtyps (8,62±0,43 µmol/l, n=8). Tabelle 1 faßt die Messungen zusammen. Parameter CHIF knock-out Wildtyp Hämatokrit 52,5 ± 0,78 (32) 53,6 ± 0,72 (28) [Na + ] P (mmol/l) 141,21 ± 0,54 (38) 141,97 ± 0,90 (16) [K + ] P (mmol/l) 6,34 ± 0,14 (34) 6,51 ± 0,15 (27) [Kreatinin] P (µmol/l) 9,19 ± 0,42 (10) 8,62 ± 0,43 (8) Tabelle 1: Vergleich der Plasmawerte von CHIF knock-out Maus und Wildtyp-Maus unter Standardbedingungen. Mittelwerte ± SEM (Anzahl der Messungen) Die fraktionellen Ausscheidungen Als zusammenfassenden Parameter des renalen Na + - und K + -Transportes untersuchten wir die fraktionellen Ausscheidungen (FE für englisch: fractional excretion) von Natrium und Kalium im Urin. Weder die FE Na + noch die FE K + der knock-out Mäuse unterschieden sich von den FE s der Wildtyp-Mäuse. Die FE Na + lag in der CHIF KO-Maus bei 0,26±0,02 % (n=30) gegenüber 0,18±0,03 % im Wildtyp (n=14). Die FE K + betrug 13,32±1,07 % (n=30) in der knock-out Maus und 11,84±0,80 % (n= 25) in der Kontrollgruppe. 24

25 Kapitel 3 Ergebnisse Als Maß für den Anteil, den der Aldosteron-vermittelte Ionentransport im Sammelrohr an der Gesamtausscheidung von Na + und K + hat, untersuchten wir die Veränderung der fraktionellen Ausscheidungen nach Gabe von Amilorid. Amilorid hemmt in der von uns verwendeten Dosis (5 mg/kg KG) spezifisch den Aldosteron-induzierten Kanal ENaC. Dies bewirkt eine Erhöhung der FE Na + sowie eine Senkung der FE K +. Das Ausmaß dieser Veränderungen ( FE Na + (Amil) und FE K + (Amil)) spiegelt die im Sammelrohr der untersuchten Maus vorhandene ENaC- Aktivität wider. Amilorid führte in beiden Gruppen zu einer signifikanten Steigerung der Natriumausscheidung und zu einer signifikanten Senkung der Kaliumausscheidung, ohne jedoch Unterschiede zwischen den Genotypen aufzudecken (Abb. 5 a und b) (13) (30) (25) (30) FE Na + (%) (14) (30) FEK+ (%) (23) (30) 0 Amil Wildtyp Amil CHIF knock-out 0 Amil Wildtyp Amil CHIF knock-out Abb. 5 a: Die fraktionelle Natrium-ausscheidung der CHIF knock-out Maus im Vergleich zum Wildtyp. Amilorid (Amil, 5 mg/kg KG) erhöht die FE + Na in beiden Gruppen signifikant (A). Es finden sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Genotypen. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) Abb. 5 b: Die fraktionelle Kaliumausscheidung der CHIF knock-out Maus im Vergleich zum Wildtyp. Amilorid (Amil, 5 mg/kg KG) senkt die FE + K in beiden Gruppen signifikant (A). Es finden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Genotypen. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) 3.2 Die Nierenfunktion der CHIF knock-out Maus unter Stimulationsbedingungen Glukokortikoide Die Plasmawerte unter Glukokortikoiden Eine dreitägige Vorbehandlung der Mäuse mit Glukokortikoiden blieb weitgehend ohne signifikante Auswirkungen auf die Plasmawerte von KO- und Wildtyp-Mäusen und legte keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Genotypen offen (Tabelle 2). Die einzige 25

26 Ergebnisse Kapitel 3 signifikante Veränderung fand sich in der Plasma-Kreatininkonzentration ([Krea] P ) der knockout Mäuse. Sie betrug unter Glukokortikoiden 6,19±0,55 µmol/l (n=7) gegenüber 9,19±0,42 µmol/l (n=10) unter Standardbedingungen. Als Vergleichsdaten dienten dabei die unter 3.1 beschriebenen Befunde unter Standardbedingungen. Parameter CHIF knock-out Wildtyp Standard Glukokortikoide Standard Glukokortikoide [Na + ] P (mmol/l) 141,21 ± 0,54 (38) 137,46 ± 2,37 (7) 141,97 ± 0,9 (16) 141,88 ± 0,88 (8) [K + ] P (mmol/l) 6,34 ± 0,14 (34) 6,35 ± 0,5 (7) 6,51 ± 0,15 (27) 6,19 ± 0,59 (8) Hämatokrit (%) 51,5 ± 0,78 (32) 49,5 ± 0,79 (7) 53,6 ± 0,72 (28) 55,1 ± 1,47 (7) [Krea] P (µmol/l) 9,19 ± 0,42 (10) 6,19 ± 0,55 (7) * 8,62 ± 0,43 (8) 7,29 ± 0,97 (8) Tabelle 2: Die Plasmawerte von CHIF knock-out Maus und Wildtyp-Maus nach dreitägiger Gabe von Glukokortikoiden. Als Vergleichsdaten dienen die unter 3.1 beschriebenen Befunde unter Standardbedingungen. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) * Signifikanter Unterschied zwischen Standardbedingungen und Glukokortikoidbehandlung Die fraktionelle Na + - und K + -Ausscheidung unter Glukokortikoiden Interessanterweise konnte in beiden Genotypen die FE Na + durch die Glukokortikoidbehandlung nicht weiter gesenkt werden (Abb. 6 a). Auch die FE K + veränderte sich unter Glukokortikoiden nicht signifikant (Abb. 6 b). Es fand sich kein Unterschied zwischen den Genotypen. FE Na + (%) (14) (8) (30) (7) FE K + (%) (25) (8) (30) (7) Wildtyp Glu Glu CHIF knock-out 0 Wildtyp Glu Glu CHIF knock-out Abb. 6 a: Die fraktionelle Natriumausscheidung vor und nach Gabe von Glukokortikoiden (Glu, gestreifte Balken) im ungepaarten Vergleich. In beiden Genotypen nimmt die FE + Na unter Glukokortikoiden Abb. 6 b: Glukokortikoide (Glu, gestreifte Balken) haben keinen Einfluß auf die fraktionelle Kaliumausscheidung. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) zu, ohne dabei signifikant vom Vorkontrollwert abzuweichen. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) 26

27 Kapitel 3 Ergebnisse Die Wirkung von Amilorid auf FE Na + und FE K + unter Glukokortikoiden Wie unter Standardbedingungen, so führten wir auch nach der dreitägigen Vorbehandlung mit Glukokortikoiden ein Amiloridexperiment durch (vergl ). Die Gabe von 5 mg/kg KG Amilorid s.c. erhöhte die FE Na + in der KO-Maus von 0,31±0,11 % (n=7) auf 0,75±0,14 % (n=6) und senkte die FE K + von 10,85±1,77 % (n=7) auf 2,12±0,59 % (n=6). In der Wildtyp-Maus erhöhte Amilorid die FE Na + von 0,33±0,07 % auf 0,83±0,12 % (jeweils n=8) und senkte die FE K + von 13,66±3,15 % auf 2,58±1,02 % (n=8). Es fand sich kein Unterschied zwischen den Genotypen. Die Amiloridwirkungen FE Na + (Amil) bzw. FE K + (Amil), die die Differenz zwischen der FE vor Gabe von Amilorid und der FE nach Gabe von Amilorid bezeichnen, unterschieden sich in beiden Genotypen nach der dreitägigen Gabe von Glukokortikoiden nicht von den Werten unter Standardbedingungen (Abb. 7 a und b). Fe Na + (Amil) (%) (13) (8) Glu Wildtyp (29) (6) Glu CHIF knock-out FE K + (Amil) (%) Wildtyp Glu (23) (8) CHIF knock-out Glu (6) (29) Abb. 7 a: Glukokortikoide (Glu, gestreifte Balken) haben im ungepaarten Vergleich keinen signifikanten Einfluß auf FE Na+(Amil). Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) Abb. 7 b: Glukokortikoide (Glu, gestreifte Balken) haben im ungepaarten Vergleich keinen signifikanten Einfluß auf FE K+(Amil). Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) Natriumarme Diät Da für die CHIF-Expression eine Abhängigkeit vom Blut-Aldosteronspiegel beschrieben worden ist, wollten wir prüfen, ob eine Erhöhung des Aldosteronspiegels durch die Gabe einer natriumarmen Diät in CHIF KO- und Wildtyp-Mäusen Unterschiede in der renalen Elektrolytausscheidung offen legt. 27

28 Ergebnisse Kapitel 3 Für 14 Tage erhielten die Mäuse ausschließlich Zugang zu Futter mit einem Natriumgehalt von 0,136 g/kg bei freiem Zugang zu Trinkwasser, was die endogene Aldosteronsekretion anregen sollte. Die Diät wurde von den Mäusen gut vertragen; es kam weder zu Todesfällen noch zu Gewichtsveränderungen. Der Vergleich Vorkontrolle/Diät wurde, soweit möglich, als gepaartes Experiment durchgeführt Die Plasmawerte unter natriumarmer Diät Die natriumarme Diät führte weder in den knock-out Mäusen noch in den Wildtyp-Mäusen zu einer Absenkung der Plasma-Natriumkonzentration. [K + ] P sowie der Hämatokrit blieben ebenfalls in beiden Genotypen unverändert (Tabelle 3). Im Vergleich zu dem unter 3.1. beschriebenen Plasma-Kreatininspiegel unter Standardbedingungen sank [Krea] P durch die natriumarme Diät in der knock-out Maus signifikant, während [Krea] P in der Wildtyp-Maus unverändert blieb (Tabelle 3). Parameter CHIF knock-out Wildtyp Vorkontrolle Na+ arme Diät Vorkontrolle Na+ arme Diät [Na + ] P (mmol/l) 140,68 ± 1,42 (6) 137,44 ± 0,63 (7) 144,77 ± 0,85 (7) 143,22 ± 2,44 (8) [K + ] P (mmol/l) 6,74 ± 0,07 (5) 6,60 ± 0,27 (7) 6,78 ± 0,18 (7) 6,34 ± 0,25 (3) Hämatokrit (%) 50,9 ± 0,60 (7) 50,7 ± 1,07 (7) 54,2 ± 0,63 (8) 54,4 ± 0,78 (8) [Krea] P (µmol/l) 9,19 ± 0,42 (10) 7,58 ± 0,43 (7) * 8,62 ± 0,43 (8) 8,95 ± 0,77 (8) Tabelle 3: Die natriumarme Diät hat keine Auswirkungen auf [Na + ] P, [K + ] P und den Hämatokrit. Hingegen sinkt in der knock-out Maus im ungepaarten Vergleich der Plasma-Kreatininspiegel signifikant im Vergleich zu dem Wert unter Standardbedingungen. Als Vergleichsdaten für [Krea] P gelten dabei die unter 3.1 beschriebenen Werte. Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) * Signifikanter Unterschied zwischen Vorkontrolle und Na + -armer Diät Die fraktionelle Na + - und K + -Ausscheidung unter natriumarmer Diät Die Abbildungen 8 a und b zeigen die Auswirkungen der natriumarmen Diät auf die FE Na + und FE K + der CHIF knock-out Maus. FE Na + sank durch die natriumarme Diät in der KO-Maus (n=6) mit 0,01±0,005 % im Vergleich zum Vorkontrollwert von 0,26±0,04 % deutlich. FE Na + in der Wildtyp-Maus (n=8) sank von 0,23±0,03 % auf 0,01±0,002 % (Abb. 8 a). Es fand sich kein Unterschied zwischen den Genotypen. 28

29 Kapitel 3 Ergebnisse Die FE K + in der CHIF KO-Maus sank, anders als bei einer verstärkten Aldosteronsekretion erwartet, durch die natriumarme Diät signifikant von 13,11±2,35 % auf 8,40±0,88 % (n=6). Dies steht im Gegensatz zum Befund beim Wildtyp, wo FE K + von 12,80±1,84 % zu 12,98±2,20 % (n=8) unverändert blieb (Abb. 8b). 0.3 FE Na + (%) Abb. 8 a: Die natriumarme Diät (Na + ) senkt im gepaarten Experiment die FE Na + signifikant im Vergleich zur Vorkontrolle (A). Mittelwert ± SEM, 0 Na + Na + n=anzahl der Experimente Wildtyp CHIF knock-out n=8 n= FE K + (%) Na + Na + Wildtyp CHIF knock-out n=8 n=6 Abb. 8 b: Im Unterschied zum Wildtypbefund senkt die natriumarme Diät (Na + ) die FE + K in der knockout Maus signifikant (A). Gepaarte Experimente, Mittelwert ± SEM, n=anzahl der Experimente Die Wirkung von Amilorid auf FE Na + und FE K + unter natriumarmer Diät Sowohl vor Beginn der natriumarmen Diät wie auch an deren Ende führten wir ein Amiloridexperiment durch, um den Anteil des Aldosteron-vermittelten Ionentransportes im Sammelrohr an der renalen Ausscheidung von Na + und K + zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 9 a d zusammengefasst. Amilorid erhöhte in beiden Genotypen sowohl unter Standardbedingungen wie auch nach natriumarmer Diät die FE Na + signifikant. Dabei lagen die FE Na + vor und nach der Gabe von Amilorid unter natriumarmer Diät signifikant niedriger als unter Standardbedingungen (Abb. 9 a). FE Na + (Amil) hingegen, das die Differenz der FE + Na vor und nach Gabe von Amilorid angibt, veränderte sich durch die natriumarme Diät nicht (Abb. 9 b). Die Befunde der Wildtypgruppe waren nicht signifikant von denen der knock-out Gruppe verschieden. 29

30 Ergebnisse Kapitel Wildtyp CHIF KO (5) FE Na + (%) (8) (7) (6) (7) (5) Abb. 9 a: Die Wirkung von Amilorid (Amil) auf die fraktionelle Natriumausscheidung vor und nach natriumarmer Diät. Amilorid erhöht die FE + Na signifikant (A); die Absolutwerte der FE + Na liegen allerdings in (8) (6) Amil Amil Amil Amil Vorkontrolle nach Na+ Diät beiden Genotypen nach Diät signifikant niedriger. Mittelwert ± SEM, signifikanter Unterschied zwischen Vorkontrolle und Werten nach Diät. FE Na + (Amil) (%) Abb. 9 b: Die natriumarme Diät hat keinen Einfluß auf die Amilorid-induzierte Erhöhung der FE Na +, FE Na +. Gepaarte Ex- (Amil) 0 Na + Na + Wildtyp CHIF knock-out n=7 n=5 perimente, Mittelwert ± SEM (Anzahl der Experimente) 16 (8) (6) (8) Wildtyp CHIF KO 12 Abb. 9 c: Die Wirkung von Amilorid (Amil) FE K + (%) 8 (6) auf die fraktionelle Kaliumausscheidung vor und nach natriumarmer Diät. Amilorid senkt die FE + K signifikant (A). Die Absolutwerte 4 0 (7) (5) (7) Amil Amil Amil (5) Amil der FE + K liegen in der KO-Maus nach Diät signifikant niedriger ( ), während sie im Wildtyp unverändert bleiben. Mittelwert ± SEM, signifikanter Unterschied zwischen Vorkontrolle nach Na+ Diät Wildtyp und KO-Maus. FE K + (Amil) (%) Wildtyp CHIF knock-out n=7 n=5 Na + Na + Abb. 9 d: FE K + bleibt durch die (Amil) natriumarme Diät in beiden Genotypen unbeeinflußt. Mittelwert ± SEM (Anzahl der -15 Experimente) 30