Abbildung 31: Aktivität der schwarzen Granulenfraktion aus dem DEMON -Reaktor Tobl. Verlauf der Stickstoffverbindungen Ammonium (NH +

Transkript

1 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 31: Aktivität der schwarzen Granulenfraktion aus dem DEMON -Reaktor Tobl. Verlauf der Stickstoffverbindungen Ammonium (NH 4 + ), Nitrit (NO 2 - ) und Nitrat (NO 3 - ) unter anaeroben Bedingungen. In Abbildung 30 sind die Verläufe der gemessenen Stickstoffverbindungen im Aktivitätstest mit roten Granulen dargestellt. Die Abnahme von Ammonium (von 110 auf 87 mg N/L) bedeutete eine durchschnittliche stündliche Abnahme von 9,6 mg/l Ammonium-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz (Abb. 32), die Abnahme von Nitrit (von 77 auf 51 mg N/L) eine durchschnittliche stündliche Abnahme von 9,8 mg/l Nitrit-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz. Eine leichte Zunahme von Nitrat (von 3 auf 8,4 mg N/L) bedeutete eine durchschnittliche stündliche Zunahme von 1,8 mg/l Nitrat-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz (Abb. 32). Abbildung 31 zeigt die Verläufe der gemessenen Stickstoffverbindungen im Aktivitätstest mit schwarzen Granulen. Die Abnahme von Ammonium (von 108 auf 94 mg N/L) bedeutete eine durchschnittliche stündliche Abnahme von 1,25 mg/l Ammonium-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz (Abb. 32), die Abnahme von Nitrit (von 80 auf 69 mg N/L) eine durchschnittliche stündliche Abnahme von 1,32 mg/l Nitrit-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz. Eine leichte Zunahme von Nitrat 79

2 Ergebnisse ARA Tobl (von 3,2 auf 6 mg N/L) bedeutete eine durchschnittliche stündliche Zunahme von 0,2 mg/l Nitrat-Stickstoff pro Gramm Trockensubstanz (Abb. 32). Abbildung 32: Vergleich der Umsatzraten der roten und schwarzen Granulenfraktion des DEMON -Reaktors der ARA Tobl. Die Umsatzraten der roten und schwarzen Granulenfraktion aus dem DEMON - Reaktor in Tobl werden in Abbildung 32 miteinander verglichen. Die rote Granulenfraktion unterschied sich deutlich in ihrer Abbauleistung von jener der schwarzen Granulenfraktion, dies zeigte sich in den Abbauraten von Ammonium (9,6 bzw. 1,25 mg N/L*h*g TS) und Nitrit (9,78 bzw. 1,32 mg N/L*h*g TS). Die Umsatzraten der roten Granulenfraktion unterschieden sich dabei kaum von gemessenen Umsatzraten der Strasser Anammox-Biomasse (vgl. Abb. 29). 80

3 Ergebnisse ARA Tobl 6.4 Untersuchung auf Inhibitoren der Anammox-Bakterien Organische Säuren und Anionen Wie in Abbildung 33 deutlich zu erkennen, konnten nur geringe Konzentrationen organischer Säuren im Trübwasser, im Zulauf und im DEMON -Reaktor nachgewiesen werden. Im Zulauf (Trübwasser und Brüdenkondensat) zum Reaktor konnte Milchsäure in einer niedrigen Konzentration (5,2 mg/l), im Trübwasser Milchsäure (1,4 mg/l) und Buttersäure (6,2 mg/l) nachgewiesen werden. Im DEMON -Reaktor konnten Milchsäure (7,8 mg/l) und Capronsäure (12,9 mg/l) gefunden werden. Essigsäure, Phenylessigsäure und Propionsäure konnten nicht nachgewiesen werden (unter Detektionslimit). Abbildung 33: Organische Säuren und anorganische Anionen. Die anorganischen Anionen Chlorid, Nitrat, Phosphat und Sulfat konnten sowohl in den Zulaufproben als auch im Becken nachgewiesen werden. Chlorid kam in hohen Konzentrationen im Trübwasser (1,6 g/l) und im Zulauf (0,39 g/l) vor, im Becken selbst nahm die Chlorid-Konzentration kaum ab (0,37 g/l). Die höchsten 81

4 Ergebnisse ARA Tobl Konzentrationen von Sulfat konnten im Zulauf (40,8 mg/l) und im Becken (42,1 mg/l) nachgewiesen werden. Phosphat kam in geringen Konzentrationen in allen Proben vor (2,2 mg/l im Zulauf, 9,2 mg/l im Becken und 22,6 mg/l im Trübwasser). Im Gegensatz zu Nitrit (Messbereich unterschritten) konnte Nitrat nachgewiesen werden (1,3 mg/l im Zulauf, 3,9 mg/l im Trübwasser und 64,2 mg/l im Becken) Spurenelementversorgung Die ausreichende Versorgung der Bakterien mit essentiellen Spurenelementen wie Zink, Nickel, Eisen, Mangan, Kupfer, Kobalt und Molybdän muss im Reaktor gewährleistet sein. Die generierten Messwerte der Spurenelementanalysen für die Filtrate der Proben Trübwasser, Brüdenkondensat, DEMON -Zulauf und -Becken sind in Abbildung 34 dargestellt. Auffällig waren die hohen Messwerte für Phosphor in der Trübwasserprobe, sowie jene für Eisen im Trübwasser und im Becken. Kobalt und Molybdän lagen bei den Proben unter dem Detektionslimit der Atomabsorptionsspektroskopie (Ausnahme Kobalt in der Probe Trübwasser). Abbildung 34: Spurenelemente und Phosphor in Filtraten der Proben Trübwasser, Brüdenkondensat, DEMON -Zulauf und DEMON -Becken (0: unter dem Detektionslimit). 82

5 Ergebnisse ARA Tobl In Abbildung 35 sind die Spurenelemente, welche in der Biomasse gebunden sind, in den Proben DEMON -Becken (Gesamtbiomasse) sowie rote und schwarze Anammox-Granulen, dargestellt. Auffällig waren die zum Teil großen Unterschiede zwischen roter und schwarzer Anammox-Biomasse. Bei Phosphor und Eisen waren die gemessenen Konzentrationen in der schwarzen Granulenfraktion beinahe dreimal so hoch wie die Konzentrationen in der roten. Doppelt so hohe Konzentrationen in schwarzer Anammox-Biomasse konnten bei Zink und Mangan gemessen werden. Abbildung 35: Spurenelemente und Phosphor in der Biomasse des DEMON -Beckens (Gesamtbiomasse) sowie in roten und schwarzen Anammox-Granulen Biogene Amine Eine mögliche Substanzklasse, welche zur Inhibition der Anammox-Bakterien beitragen kann, sind freie Aminosäuren und primäre Amine. Mittels OPA/NAC- Methode kann die Gesamtheit der Aminosäuren und der primären Amine anhand ihrer Stickstoffgruppe erfasst werden. Für den Zulauf zum Reaktor konnte eine primäre Amine-Konzentration von unter 0,02 mm, für den DEMON -Reaktor eine Konzentration von unter 0,06 mm gemessen werden. 83

6 Ergebnisse ARA Tobl Osmotischer Druck Als Maß für den osmotischen Druck (durch erhöhte Salinität) wird die osmotische Konzentration bestimmt. Die Osmolalität im DEMON -Becken konnte seit Inbetriebnahme des Reaktors bestimmt werden und liegt konstant niedrig zwischen 25 und 30 mosm/kg Sulfide Im Faulturm entstehendes Sulfid wird an der ARA Tobl mit Eisen gefällt, es entstehen dabei schwarze Eisensulfidkomplexe. Die auftretende Schwarzfärbung einiger Anammox-Granulen könnte damit im Zusammenhang stehen. Zudem ist der Eisengehalt in der schwarzen Anammox-Biomasse erhöht (Abb. 35) und könnte für eine Komplexbildung in den Granulen zur Verfügung stehen. Daher erfolgte eine Bestimmung der Sulfidkonzentrationen in Filtratproben (Trübwasser, DEMON - Zulauf und -Becken) sowie die Konzentration von Sulfiden, welche in der Biomasse gebunden sind (DEMON -Becken (Gesamtbiomasse), rote und schwarze Granulenfraktion). Die gemessenen Sulfidkonzentrationen im Zulauf zum DEMON -Reaktor der ARA Tobl (1,2 µg S 2- /L) mit jenen im Zulauf der ARA Strass (2,5 mg S 2- /L) unterschieden sich deutlich. Die Sulfidkonzentration im Trübwasser der ARA Tobl lag ebenso deutlich darunter (75,9 µg S 2- /L). Auch die gemessenen Konzentrationen in den Reaktoren unterschieden sich stark (2,3 µg S 2- /L in Tobl bzw. 49,8 µg S 2- /L in Strass) (Abb. 36). In der Biomasse aus dem Becken der ARA Tobl (0,7 µg S 2- /g TS) konnten höhere Sulfidkonzentrationen als im Becken der ARA Strass (0,5 µg S 2- /g TS) nachgewiesen werden. Der Unterschied zwischen den gemessenen Konzentrationen in roter und schwarzer Anammox-Biomasse war gering (0,4 bzw. 0,3 µg S 2- /g TS) (Abb. 37). 84

7 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 36: Sulfidkonzentrationen in Filtratproben DEMON -Becken und -Zulauf (Vergleich mit ARA Strass) und Trübwasser (ARA Tobl). Abbildung 37: Sulfidkonzentrationen in Biomasse aus dem DEMON -Becken (Gesamtbiomasse der ARA Tobl und Strass) sowie in roten und schwarzen Granulenfraktionen (ARA Tobl). 85

8 Ergebnisse ARA Tobl 6.5 Feststoffeintrag und Belastung der Abwasserlinie In Abbildung 38 sind die Herkunft der Feststoffe und deren Weg in den DEMON - Reaktor schematisch dargestellt. Ein Abzug der Partikel im Vorlagebehälter ist nicht möglich, da sowohl aufschwimmender als auch sich absetzender Schlamm beobachtet werden kann. Abbildung 38: Herkunft der Feststoffe. Das Trübwasser aus der Schlammtrocknung und den Schneckenpressen wird in einem Vorlagebehälter zwischengespeichert. Es erfolgt die Mischung mit dem Brüdenkondensat und die Weiterleitung in den Zwischenspeicher. Das Abwasser im Zwischenspeicher entspricht dem Zulauf zum DEMON -Reaktor. Im Vorlagebehälter kann eine flotierende und eine sedimentierende Feststofffraktion beobachtet werden. 86

9 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 39: Links: Feststoffeintrag durch das Trübwasser. Mitte: Abgetrennte Feststoffe durch die Schneckenpressen. Ein Teil dieser Feststoffe gelangt durch die Spülung der Pressen wieder ins Trübwasser zurück. Rechts: Blick auf das Trocknungsband der Schlammtrocknungsanlage. Ein Teil dieser Feststoffe gelangt nach der Spülung des Trocknungsbandes zurück in das Trübwasser Sedimentationsverhalten Die drei Trübwasserfraktionen (Schneckenpresse Normalbetrieb, Schneckenpresse Spülung und Schlammtrocknung) unterschieden sich hinsichtlich ihres Sedimentationsverhaltens. Abbildung 40: Absetzverhalten nach 0 Minuten (links) und nach 30 Minuten (rechts). Schneckenpresse Normalbetrieb (1), Schneckenpresse Spülung (2) und Trocknung (3). Die Feststoffe aus der Fraktion der Schneckenpressen im Normalbetrieb waren gut absetzbar. Die Feststoffe, welche nach dem Spülvorgang im Trübwasser verbleiben, sedimentierten zwar langsam, aber weniger Schwimmschlamm trat auf. Sehr schlechtes Sedimentationsverhalten zeigten die Feststoffe aus der Trocknung. Versuche zur Bestimmung der Surface-Overflow-Rate im Trübwasser zeigten, dass die Feststoffe im Trübwasser aus der Fraktion der Schneckenpressen im 87

10 Ergebnisse ARA Tobl Normalbetrieb langsam und diskontinuierlich sedimentierten und zum Teil aufschwimmen. Die Feststoffe aus der Fraktion der Schneckenpressen im Spülbetrieb setzten sich gleichmäßig ab. Ein Aufschwimmen des Schlammes konnte hier nicht beobachtet werden (Abb. 41). Abbildung 41: Bestimmung der Surface-Overflow-Rate im Trübwasser in den Fraktionen Schneckenpresse Normalbetrieb und Schneckenpresse Spülung Siebanalyse Um die Korngrößenverteilung der Feststoffe charakterisieren zu können, wurden Siebanalysen durchgeführt. In Abbildung 42 sind die Partikel im Lupenbild dargestellt, in Abbildung 43 die kumulative Korngrößenverteilung der drei Trübwasserfraktionen. Die Partikel aus der Trocknung waren größer als jene aus den Schneckenpressen, zwischen den beiden Schneckenpressen-Fraktionen (Normalbetrieb und Spülung) gab es kaum Unterschiede. Um den Großteil der Feststoffe aus der Abwasserlinie zu entfernen, wird eine Maschenweite von 125 µm benötigt. 88

11 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 42: Feststoffe im Zulauf zum DEMON -Reaktor (links) und anfallende Partikel beim Pressvorgang (rechts). Abbildung 43: Kumulative Korngrößenverteilung der Feststoffe aus den Trübwasserfraktionen Trocknung, Schneckenpresse Spülung und Normalbetrieb. 89

12 Ergebnisse ARA Tobl 6.6 Laborreaktor Im Laborreaktorversuch wurde Biomasse (1,4 g TS) aus dem DEMON -Becken Tobl (Probenahme im Juni 2014) mit einem synthetischen Medium versetzt. Durch Zugabe von Spurenelementlösung nach Egli zum Medium konnten optimale Bedingungen für die Bakterien im Laborreaktor geschaffen werden. Nach zweiwöchigem Testbetrieb konnte ein leichter Zuwachs von Biomasse beobachtet werden (von 1,4 g TS auf 1,52 g TS), die Osmolalität im Reaktor (zwischen 20 und 30 mosm/kg) und die Alkalinität (zwischen 3,5 bis 5,0 mm) blieben konstant. In den Belüftungsintervallen konnte eine Abnahme von Ammonium (Zulauf: 200 mg N/L; Reaktor: 50 mg N/L) und eine Zunahme von Nitrit (Reaktor: 26 mg N/L), in den Belüftungspausen eine Abnahme von Ammonium und Nitrit, beobachtet werden. Abbildung 44: Ausschnitte der Online-Aufzeichnungen der Parameter ph und gelöster Sauerstoff. 90

13 Ergebnisse ARA Tobl Gut zu erkennen war der Verlauf des ph-wertes bei eingeschalteter (ph sinkt) und abgestellter (ph steigt) Belüftung (Abb. 44). Einen Abwärts-Drift der Sauerstoffsonde konnte beobachtet werden. 91

14 Ergebnisse ARA Tobl 6.7 Molekularbiologische Untersuchungen Extraktion der DNA Die DNA Extraktion erfolgte aus folgenden Proben (Abb. 45): Tobl AMX (nur Anammox-Biomasse), Tobl Biomasse gesamt (aus dem DEMON -Becken), Tobl rote Granulen, Tobl schwarze Granulen, Strass AMX (nur Anammox-Biomasse), Strass Biomasse gesamt (aus dem DEMON -Becken) und Strass Hydrozyklon Unterlauf. Abbildung 45: Agarose-Gelelektrophorese für die DNA Extrakte extrahiert mit der Kombination des Qiagen DNeasy Blood & Tissue und dem Powersoil DNA Isolation Kit (St.: Standard). Die Extraktion der DNA mittels einer Kombination (vgl. Material und Methoden) des Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) und Powersoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.) lieferte positive Ergebnisse für alle Proben. Einheitliche Banden in der Höhe genomischer DNA zeigten deutlich, dass die Fragmente nicht mechanisch zerstört und in kleinere DNA-Fragmente zerkleinert wurden. Eine solche Zerkleinerung konnte nur für eine Parallele der Strass Hydrozyklon Unterlauf Probe beobachtet werden (Schmierspur). Schwach sichtbare Banden sind ein Indiz für geringe, helle Banden ein Indiz für hohe DNA-Konzentrationen. 92

15 Ergebnisse ARA Tobl Quantifizierung der Anammox-Biomasse Mit Hilfe der Realtime PCR (qpcr) konnten die 16S rrna-gensequenz von Anammox-Bakterien in verschiedenen Proben (Kapitel und Abb. 45) quantifiziert werden. Es ergaben sich dabei Werte von 9*10 9 Genkopien pro Gramm Trockensubstanz in der Probe Tobl Gesamtbiomasse und 8,6*10 11 Genkopien pro Gramm Trockensubstanz in der Probe Strass Gesamtbiomasse. Die Proben Tobl rote und Tobl schwarze Granulen unterschieden sich nur geringfügig (rot: 3,2*10 10 Genkopien/g TS; schwarz: 3,7*10 10 Genkopien/g TS) voneinander (Abb. 46). Die Effizienz der qpcr betrug 0,34 (R 2 : 0,997). Der Verlauf der qpcr ist im Anhang dargestellt. Abbildung 46: Genkopien pro Gramm Trockensubstanz. Die Probe DEMON -Becken entspricht der Bezeichnung Tobl Biomasse gesamt. Die Proben Tobl AMX, Strass AMX und Strass Zyklon UL sind in der Abbildung nicht dargestellt. 93

16 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 47 zeigt die Schmelzkurve (melting curve) für die durchgeführte qpcr. Die dichte Aneinanderreihung der Peaks und das Fehlen von Peaks im unteren Temperaturbereich lassen darauf schließen, dass es zu keinen Primerdimerisierungen während der qpcr kam. Auffallend ist der Doppelpeak im Temperaturbereich 85 C bis 90 C (in der Abbildung markiert) welcher deutlich bei den Proben aus dem DEMON -Reaktor der ARA Tobl auftritt. Abbildung 47: Schmelzkurve (melting curve) zur Qualitätskontrolle der qpcr (X-Achse: Temperatur von 55 C bis 95 C; Y-Achse: df/dt in 5 C Schritten) S rrna Sequenzierung Der Artenreichtum des DEMON -Reaktors der ARA Tobl wurde mittels einer Verdünnungskurve (rarefaction analysis) ausgewertet (Abb. 48). Die insgesamt reads der roten Granulenfraktion konnten zu 575 OTUs gruppiert werden. In reads der schwarzen Granulenfraktion waren es 693 OTUs, in reads der DEMON -Becken-Gesamtfraktion waren es 630 OTUs. Für die Berechnung der Diversität wurde die Stichprobenmenge der kleinsten Fraktion (rote Granulenfraktion) herangezogen. Der Shannon-Index für die rote Granulenfraktion war 3,1231, jener der schwarzen Granulenfraktion 2,8764 und jener der DEMON -Beckenprobe 3,

17 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 48: Verdünnungskurve zur Veranschaulichung des Artenreichtums. In reads der roten Granulenfraktion konnten 575 verschiedene OTUs bestimmt werden. Diese Werte wurden für die Berechnung der Diversität herangezogen. Die dominanten Phylotypen (Betrachtung des Phylum-Levels) in der Probe DEMON -Becken waren Acidobacteria (12 Prozent), Chlorobi (50 Prozent), Proteobacteria (23Prozent), Chloroflexi (4 Prozent) und Planctomycetes (3,7 Prozent). In der roten Granulenfraktion konnten folgende relative Abundanzen festgestellt werden: Acidobacteria (16 Prozent), Chlorobi (37 Prozent), Proteobacteria (22 Prozent), Chloroflexi (6 Prozent) und Planctomycetes (4,9 Prozent). In der schwarzen Granulenfraktion konnten folgende relative Abundanzen festgestellt werden: Acidobacteria (14 Prozent), Chlorobi (37 Prozent), Proteobacteria (26 Prozent), Chloroflexi (7 Prozent) und Planctomycetes (5,6 Prozent) (Abb. 49). Die vollständige Auflistung der Diversität in den Proben des DEMON -Reaktors Tobl ist im Anhang dargestellt. 95

18 Ergebnisse ARA Tobl Abbildung 49: Dominante Phylotypen (relative Abundanz) und Diversität in den drei untersuchten Proben des DEMON -Reaktors der ARA Tobl. Die Bakterien-Gemeinschaft auf OTU-Level (operational taxonomic unit) ist in Abbildung 50 dargestellt. Dominant ist in allen drei Proben OTU 0001 mit einer relativen Abundanz von 45 Prozent im DEMON -Becken, 40 Prozent in der roten und 35 Prozent in der schwarzen Granulenfraktion. Die Sequenz ist mit 98 Prozent Ähnlichkeit der Sequenz vom unkultivierten Planctomyceten Klon 5GA_Pla_HKP_17 zuordenbar (Accession number: GQ356164). Bezogen auf die relative Abundanz ist OTU 0011 die zweithäufigste Gruppe in den drei Proben (7 Prozent im DEMON -Reaktor, 9 Prozent in der roten und 8 Prozent in der schwarzen Granulenfraktion). Mit 99 Prozent Ähnlichkeit konnte OTU 0011 der 96

19 Ergebnisse ARA Tobl Sequenz der Bakterien-Aufzuchtskultur Klon SRAO_12 zugeordnet werden (Accession number: KM210533). Abbildung 50: Relative Abundanz und Diversität auf OTU-Level des DEMON -Reaktors der ARA Tobl (Abundanz-Limit: > 0,5 Prozent. Insgesamt liegen 20 OTUs über diesem Limit, die restlichen OTUs werden als Andere zusammengefasst). OTU 0037 mit 99 Prozent Sequenzähnlichkeit zu einem unkultivierten β- Proteobakterium konnte zu 5 Prozent im DEMON -Reaktor, zu 6 Prozent in der 97

20 Ergebnisse ARA Tobl roten und zu 6 Prozent in der schwarzen Granulenfraktion gefunden werden (Accession number: CU924961). Die vierthäufigste Einheit in den drei Proben (5 Prozent im DEMON -Reaktor, 5 Prozent in der roten und 4 Prozent in der schwarzen Granulenfraktion) war OTU Mit 100 Prozent Ähnlichkeit konnte OTU 0019 der Sequenz eines unkultivierten Bakterien-Klons (BPO-10) zugeordnet werden (Accession number: KF564556). OTU 0004 mit relativen Abundanzen von 3 Prozent im DEMON - Reaktor, 4 Prozent in der roten Granulenfraktion und 4 Prozent in der schwarzen Granulenfraktion, konnte als eine der fünf größten Einheiten ausfindig gemacht werden und entspricht mit 99 Prozent Ähnlichkeit der Sequenz eines unkultivierten Acidobakteriums (Accession number: DQ829632). Ausgewählte OTUs und deren relative Häufigkeit (Abundanz-Limit > 0,5 Prozent), sowie Sequenzähnlichkeiten zu kultivierten und unkultivierten Bakterien sind in Abbildung 50 ausführlich dargestellt. Alle OTUs, welche unter dem Abundanz-Limit liegen, wurden als Andere zusammengefasst. 98

21 Ergebnisse ARA Bern 7 Ergebnisse ARA Bern Im DEMON -Reaktor der ARA Bern wurde auch Faulschlammzentrat der ARA Worblental mitbehandelt. Bei Überschreitung eines bestimmten Volumsanteils aus Worblental brach die Sauerstoffzehrung wegen einer vermuteten Hemmung der Nitrifikantenpopulation ein. Die Anammox-Bakterien wurden nicht gehemmt (Abb. 51). Abbildung 51: Anammox-Granulen aus dem DEMON -Reaktor Bern. Eine kräftige Rotfärbung und große Granulen deuten auf eine gesunde, intakte Anammox-Biomasse hin. 7.1 Aktivitätsuntersuchungen Die Zentratproben wurden mit synthetischem Verdünnungsmedium vermischt (siehe Anhang: Synthetische Verdünnungsmedien), und verschiedene Verdünnungsstufen (von 0 bis 100 Prozent) wurden hergestellt. Biomasse aus dem DEMON -Reaktor der ARA Bern wurde zugegeben (1 g TS/L) und bei 30 C inkubiert. Die Aktivität der aeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien wurde anhand der Stickstoff-Spezies Nitrit und Nitrat halbstündlich gemessen. Derselbe Test wurde in ausgewählten Proben mit Biomasse aus dem DEMON -Reaktor der ARA Strass wiederholt. Die Trockensubstanz-spezifischen Umsatzraten schwanken stark, da die Raten nicht auf den kaum quantifizierbaren Anteil der Ammonium-oxidierenden Bakterien, sondern auf die Gesamtbiomasse inklusive Anammox-Granulen und sonstige 99

22 Ergebnisse ARA Bern Partikel bezogen wurde. In der Mischprobe (genommen am 11. Juni 2014) der Zentrate aus der ARA Bern und der ARA Worblental konnte keine Hemmung der Nitrifikation beobachtet werden, die Umsatzraten unterschieden sich in den verschiedenen Verdünnungsstufen kaum. Veränderungen der Nitratkonzentration waren unbedeutend und kaum feststellbar (Abb. 52). Abbildung 52: Nitrit- und Nitratumsätze der Ammonium-oxidierenden Bakterien im Mischzentrat der ARA Bern und ARA Worblental. Die reinen Zentrate der ARA Worblental (Probenahme 11. Juni 2014) hingegen verursachten eine Hemmung der aeroben Biomasse aus dem DEMON -Reaktor der ARA Bern (Abb. 53). Auch eine Hemmung der Biomasse aus dem Reaktor der ARA Strass konnte beobachtet werden, wobei die Hemmwirkung auf die Biomasse der ARA Bern stärker war (Abb. 54). Eine Veränderung der Nitratkonzentration war in beiden Versuchen kaum feststellbar. 100

23 Ergebnisse ARA Bern Abbildung 53: Nitrit- und Nitratumsätze der Ammonium-oxidierenden Bakterien (Biomasse Bern) im Zentrat der ARA Worblental. Abbildung 54: Nitrit- und Nitratumsätze der Ammonium-oxidierenden Bakterien (Biomasse Strass) im Zentrat der ARA Worblental. 101

24 Ergebnisse ARA Bern Ein zusätzlicher Aktivitätsversuch nach dreimonatiger Einlagerung der Zentratprobe Worblental (bei 4 C) zeigte deutlich die veränderte und gesteigerte Aktivität. Für den Versuch wurde frische Biomasse der ARA Strass verwendet (Abb. 55). Abbildung 55: Nitrit- und Nitratumsätze der Ammonium-oxidierenden Bakterien (Biomasse Strass) im Zentrat der ARA Worblental nach dreimonatiger Lagerung der Probe bei 4 C. 102

25 Ergebnisse ARA Bern 7.2 Untersuchung auf Inhibitoren der aeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien Organische Säuren und Anionen Wie in Abbildung 56 deutlich zu erkennen, konnten nur geringe Konzentrationen organischer Säuren in der Trübwasser-Mischprobe (ARA Bern und ARA Worblental) und im Faulschlamm der ARA Worblental nachgewiesen werden. In der Trübwasser-Mischprobe wurde Milchsäure (17,5 mg/l) nachgewiesen. Essigsäure (57,5 mg/l) und Iso-Valeriansäure (7,2 mg/l) konnten in der Faulschlammprobe der ARA Worblental detektiert werden. Buttersäure, Capronsäure, Phenylessigsäure und Propionsäure konnten in keiner der Proben nachgewiesen werden (unter Detektionslimit). Die anorganischen Anionen Chlorid, Nitrit, Nitrat, Phosphat und Sulfat wurden routinemäßig mitgemessen und zeigten keine besonderen Auffälligkeiten. Abbildung 56: Konzentration organischer Säuren und anorganischer Anionen. 103

26 Ergebnisse ARA Bern Spurenelementversorgung und Schwermetalle Die generierten Messwerte der Spurenelementanalysen für die Filtrate der Proben DEMON -Becken, Trübwasser Mischprobe (ARA Bern und Worblental) und Faulschlammzentrat Worblental sind in Abbildung 57 dargestellt. Generell konnten kaum Unterschiede zwischen den Proben festgestellt werden. Abbildung 57: Spurenelemente und Phosphor in Filtraten der Proben DEMON -Becken, Trübwasser Mischprobe (ARA Bern und ARA Worblental) sowie im Faulschlammzentrat der ARA Worblental. Zusätzlich zu den Spurenelementen wurde in der Biomasse aus dem DEMON - Reaktor der ARA Bern eine Auswahl an toxischen Schwermetallen gemessen. Aluminium und Chrom wurden in geringen Konzentrationen nachgewiesen. Silber, Quecksilber, Cadmium, Blei und Vanadium lagen unter der Nachweisgrenze der ICP- Atomemmisionsspektroskopie (Abb. 58). 104

27 Ergebnisse ARA Bern Abbildung 58: Spurenelemente, Phosphor und einige ausgewählte toxische Schwermetalle in der Biomasse des DEMON -Beckens (Gesamtbiomasse) und in Anammox-Granulen des Reaktors der ARA Bern Biogene Amine Durch die Co-Fermentation (Schlachtabfälle, tierische Proteine, Blut) an der ARA Worblental könnte es zu einer Überlastung des Faulturms und damit verbundenen erhöhten Konzentrationen von biogenen Aminen kommen. Die gemessenen Konzentrationen biogener Amine waren in den Zentratproben der ARA Worblental mit bis zu 25 mg N/L etwa doppelt so hoch wie in den gemischten Zentraten (Trübwasser Mischung). Im DEMON -Reaktor waren sie bereits abgebaut und nicht mehr nachweisbar. 105

28 Ergebnisse ARA Bern Osmotischer Druck Die Osmolalität lag im DEMON -Reaktor der ARA Bern in einem günstigen Bereich von rund 50 mosm/kg, die Zentrate schwankten in Abhängigkeit des Ammoniumgehaltes von 150 bis 250 mosm pro Kilogramm. Die verfügbare Alkalinität in den Zentraten lag zwischen 100 und 150 mm, im Reaktor konnten knapp 20 mm gemessen werden Quartäre Ammoniumverbindungen Quartäre Ammoniumverbindungen konnten in den Proben der ARA Bern nicht nachgewiesen werden (unter 0,5 mg QAV/L) Chlorierte organische Verbindungen Der AOX-Gehalt als Summenparameter für diese Substanzklasse lag bei 0,25 bis 0,34 mg Cl/L. Das Faulschlammzentrat der ARA Worblental unterschied sich dabei nicht von den Proben der ARA Bern Antibiotika Aufgrund der Co-Vergärung von Schlachtabfällen an der ARA Worblental erfolgte eine Untersuchung der Proben auf Veterinärantibiotika. In biologischen Hemmtests mit sensitiven Bakterien konnten geringe Hemmungen durch das Faulschlammzentrat Worblental für die Antibiotika-Klassen Aminoglycoside, Penicilline und Makrolide festgestellt werden. 106

29 Ergebnisse ARA Bern Phenolische Verbindungen Im Faulschlammzentrat der ARA Worblental (Probenahme am 07. Juli 2014) wurde nach einer zweimonatigen Lagerung (bei 4 C) ein Phenolindex von 3,3 mg/l gemessen. Am 28. Oktober konnte ein Phenolindex von 1 mg/l bestimmt werden (Lagerung bei 4 C). Ein langsamer Abbau von Substanzen welche im Phenolindex erfasst werden, musste also auch in gekühlten Proben stattfinden. Unter der Annahme einer konstanten Abbaurate (aus den beiden generierten Messwerten) von 0,04 mg/l*d, lag der errechnete Messwert des Phenolindex für den Zeitpunkt der Probenahme bei 6 mg/l. Aufgrund der Messergebnisse aus den Aktivitätstests und den bestimmten Phenolindex-Konzentrationen erfolgte ein entsprechender Hemmversuch. Die Hemmung nahm mit steigender Phenolkonzentration stark zu, bereits ab 3 mg/l lag die Hemmung bei über 60 Prozent (Abb. 59). Abbildung 59: Hemmung der aeroben Ammonium-Oxidierer mit steigender Phenolkonzentration. Bereits bei 3 mg/l Phenol kommt es zu einer 60 Prozentigen Hemmung der Bakterien. 107

30 Diskussion 8 Diskussion 8.1 ARA Tobl Der DEMON -Reaktor der ARA Tobl ist für die Entfernung hoher Stickstofffrachten aus dem Trübwasser und zur Reduzierung der damit verbundenen hohen Stickstoffrückbelastung des Hauptstromes zuständig. Der Zulauf zum Reaktor besteht dabei aus einer Mischung aus Trübwasser und Brüdenkondensat, wobei der Volumsanteil der Brüden um das Neunfache höher liegt als jener des Trübwassers (Abb. 18). Das Trübwasser aus dem Faulturm zeichnet sich im Gegensatz zum Brüdenkondensat durch eine deutlich höhere Ammoniumkonzentration aus. Die tägliche Zulaufmenge des Trübwasser-Brüdenkondensat-Gemischs variiert zwischen und m³. Bei der Planung der Anlage wurde der hohe Anteil an Brüdenkondensat nicht mitberechnet, die sich daraus ergebende Verdünnung (auf 150 bis 250 mg NH + 4 -N/L) des Trübwassers (Abb. 17, Abb. 20) darf daher nicht außer Acht gelassen werden. In den beiden Faultürmen der ARA Tobl wird zudem Co- Vergärung betrieben, wobei Molke einer Sennerei als Co-Substrat dient. Seit Inbetriebnahme des DEMON -Reaktors der ARA Tobl konnte der geplante und errechnete Wirkungsgrad (über 70 Prozent) in Bezug auf die Stickstoff-Entfernung nie wirklich erreicht werden (Abb. 17). Durch die Zugabe der Molke kann eine Überlastung der Faultürme nicht ausgeschlossen werden und eine Akkumulation von z.b. organischen Säuren und biogenen Aminen wäre die Folge. Diese Substanzklassen sind auch potentielle Hemmsubstanzen des Deammonifikationsprozesses und könnten damit auch für den Leistungseinbruch des Reaktors verantwortlich sein. Zudem ergeben sich an der ARA Tobl einige Probleme in der technischen Durchführung und Steuerung des Reaktors. Der Hydrozyklon, eigentlich für die Rückhaltung der langsam wachsenden Anammox-Bakterien verantwortlich, muss zur Entfernung eingetragener Feststoffe, welche durch die Trübwasserfraktion in den Reaktor gelangen, zweckentfremdet werden. Lange Laufzeiten des 108

31 Diskussion Hydrozyklons sind die Folge, welche einen negativen Einfluss auf die Trockensubstanz (Abb. 19) und Retentionszeit der Biomasse im Reaktor haben. Zurzeit liegt die Laufzeit des Hydrozyklons bei 16 Stunden täglich. Die Belüftungselemente des DEMON -Reaktors werden zudem nicht direkt, sondern zeitgleich mit allen anderen Belüftungselementen der ARA Tobl gesteuert. Eine unabhängige Belüftungssteuerung des Reaktors soll Anfang Juni 2015 realisiert werden. Dadurch lassen sich die beiden Teilprozesse des Anammox-Prozesses (partielle Nitrifikation und Deammonifizierung) dann zielgerichteter und phabhängig steuern (bisher erfolgt die Steuerung des DEMON -Reaktors zeitabhängig) Aktivitätsbeurteilung Die aeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien des DEMON -Reaktors Tobl werden nicht gehemmt. Ihre Umsatzraten für Ammonium und Nitrit entsprechen den im Vorfeld des Projektes generierten Raten mit Biomasse des Reaktors der ARA Strass (Abb. 27). Anders sieht es bei der anaeroben Anammox-Biomasse aus. Die Umsatzraten für Ammonium und Nitrit unterscheiden sich deutlich von den Raten mit Biomasse der ARA Strass. Die anaerobe Biomasse aus Strass baut 8,8 mg NH + 4 -N/L*h*g TS und 10,7 mg NO - 2 -N/L*h*g TS ab, die Biomasse aus Tobl lediglich 1,4 NH + 4 -N/L*h*g TS und 2,8 mg NO - 2 -N/L*h*g TS (Abb. 29). Im Zuge dieser Aktivitätstests konnte deutlich festgestellt werden, dass die Granulen aus dem Reaktor der ARA Tobl kleiner und blasser sind als vergleichbare Granulen aus anderen DEMON -Reaktoren, zudem konnte eine deutliche Schwarzfärbung einiger Anammox-Granulen beobachtet werden (Abb. 21, 22 und 23). Bei genauerer Betrachtung der einzelnen Granulen fiel zudem auf, dass es auch mehrere Zwischenstufen der Schwarzfärbung gibt. Aufgrund ihres Dichteunterschiedes konnten die beiden Granulenfraktionen voneinander getrennt und ihre Abbauleistung separat beurteilt werden. 109

32 Diskussion In den Aktivitätstests der roten und schwarzen Granulenfraktion konnten eindeutige Unterschiede festgestellt werden: die rote Granulenfraktion unterscheidet sich kaum (Abbau von 9,6 mg NH + 4 -N/L*h*g TS und 9,78 mg NO N/L*h*g TS), die schwarze Granulenfraktion jedoch deutlich von gesunder Anammox-Biomasse aus dem Reaktor der ARA Strass (Abbau von 1,25 mg NH N/L*h*g TS und 1,32 mg NO 2 N/L*h*g TS) (Abb. 29 und 32). Ein weiteres Merkmal der schwarzen Granulen, welche eine Unterscheidung beider Fraktionen möglich macht, ist ihr unterschiedlicher Häm-Gehalt. Häm ist als prosthetische Gruppe Bestandteil des Redoxsystems der Anammox-Bakterien und erreicht in diesen einen wesentlich höheren Anteil als in anderen Mikroorganismen. Mit 20 Prozent am gesamten Proteinanteil kann durch die Quantifizierung von Häm auf die Stoffwechselaktivität und die Menge der Anammox-Bakterien geschlossen werden (Podmirseg et al., 2015). Der Anteil an gemessenem Häm liegt für den gesamten DEMON -Reaktor der ARA Tobl (< 0,01 AU/g TS) weit unter den gemessenen Konzentrationen des Reaktors in Strass (0,045 AU/g TS). Die rote Granulenfraktion der ARA Tobl (> 0,05 AU/g TS) liegt im Bereich der Biomasse aus Strass und deutlich über den gemessenen Konzentrationen der schwarzen Granulenfraktion (< 0,005 AU/g TS) (Abb. 24). Zum Zeitpunkt der Trockensubstanzbestimmung (Mai 2014) betrug der Anteil roter Granulen an der gesamten Anammox-Biomasse (Abb. 25) 30 Prozent, der Anteil schwarzer Biomasse betrug 65 Prozent, wobei sich die fehlenden 5 Prozent durch Verluste beim Sieben und der Trennung der beiden Fraktionen mittels Percoll-NaCl- Lösung erklären lassen. In Summe bedeuten diese Ergebnisse, dass die fast inaktive schwarze Granulenfraktion mengenmäßig deutlich stärker vertreten ist und die Stickstoff-Abbauleistung im DEMON -Reaktor praktisch nur durch die geringe Menge roter Granulen bewerkstelligt wird. Es war daher notwendig, Ursachen und Erklärungen für die Schwarzfärbung der Anammox-Bakterien zu finden und in welchem Zusammenhang diese Schwarzfärbung mit der Abbauleistung im Reaktor steht bzw. ob die schwarzen Aggregate überhaupt Anammox-Granulen sind. 110

33 Diskussion Potentielle Hemmstoffe Ein Einfluss durch erhöhte Konzentrationen von freiem Ammoniak (FA) und freier salpetriger Säure (FNA) auf die anaerobe Biomasse des DEMON -Reaktors der ARA Tobl kann ausgeschlossen werden. Dapena-Mora et al. (2007) konnten einen 50 prozentigen Aktivitätsverlust bei einer Ammonium-Konzentration von 770 mg N/L zeigen, wobei freies Ammoniak (NH3, FA) die eigentliche Inhibition verursacht. Im DEMON -Reaktor der ARA Tobl können zum einen durch die Verdünnung des Ammonium-reichen Trübwassers mit Brüdenkondensat, nur zwischen 150 und 250 mg N/L gemessen werden. Zum anderen ist der ph im Reaktor zu niedrig, so dass es zu keiner Umwandlung von Ammonium zu freiem Ammoniak kommt. Einen kompletten Aktivitätsverlust der Anammox-Biomasse konnte Strous et al. (1999) bei Nitrit-Konzentrationen von 100 mg N/L zeigen. Auch diese Konzentrationen können im Reaktor nicht gemessen werden. Die Versorgung der Bakterien im DEMON -Reaktor mit Spurenelementen ist durch den Zulauf aus Brüdenkondensat und Trübwasser knapp gewährleistet, wobei die Konzentrationen für Zink, Nickel, Eisen und Kupfer im Zulauf zum Teil sehr gering sind (Abb. 34). Eine Dosierung mit Spurenelementen wurde mit Inbetriebnahme des Reaktors an der ARA Tobl zwar durchgeführt, nachdem der Wirkungsgrad jedoch einbrach und eine Steigerung durch Dosierung der Spurenelemente nicht möglich war, wieder abgebrochen. Dennoch ist es vor allem wichtig, dass die Spurenelemente für die Biomasse zugänglich sind (Abb. 35). Die in der gesamten Biomasse des Reaktors gemessenen Konzentrationen von Zink (1,6 mg/g TS) und Phosphor (28 mg/g TS) liegen über vergleichbaren gemessenen Konzentrationen anderer Reaktoren. Die Spurenelemente Nickel (0,014 mg/g TS), Eisen (6,6 mg/g TS), Mangan (0,34 mg/g TS), Kupfer (0,14 mg/g TS), Kobalt (0,002 mg/g TS) und Molybdän (0,003 mg/g TS) zeigen keine Unterschiede zu vergleichbaren Proben. Die Spurenelemente sind für die Biomasse daher zugänglich (Abb. 35 und 60). 111

34 Diskussion Abbildung 60: Spurenelementkonzentrationen in Biomasse. 40 verschiedene Biomasse-Proben aus DEMON - Reaktoren werden in dieser Grafik gemeinsam dargestellt. Die Boxen beinhalten den Großteil der gemessenen Konzentrationen in diesen Reaktoren und sind mit dem Mittelwert (Linie) und dem Median (Quadrat) dargestellt. Obere und untere Ausreißer werden mit den Punkten ober- und unterhalb der Boxen dargestellt. Durch diese Darstellung können aussagekräftige Vergleiche über die Spurenelementkonzentrationen in der Biomasse getroffen werden. Betrachtet man die rote und schwarze Granulenfraktion getrennt voneinander kann festgestellt werden, dass die Konzentrationen von Zink, Phosphor und Eisen in den schwarzgefärbten Granulen deutlich höher sind (Abb. 35). In den roten Anammox- Granulen liegen die gemessenen Konzentrationen von Phosphor (4,1 mg/g TS) und Eisen (1,2 mg/g TS) zudem unter den vergleichbaren Messwerten anderer Reaktoren. In den schwarzen Anammox-Granulen liegen die gemessenen Konzentrationen von Zink (1,1 mg/g TS) und Nickel (0,057 mg/g TS) über vergleichbaren Messwerten (Abb. 60). In den Faultürmen entstehendes Sulfid wird an der ARA Tobl mittels Eisen gefällt, es entstehen schwarze Eisensulfidkomplexe. Die Schwarzfärbung der Granulen könnte damit im Zusammenhang stehen. Zudem ist der Eisengehalt in den schwarzen Granulen erhöht und es wäre durchaus möglich, dass Eisen in der Biomasse zur 112

35 Diskussion Bildung solcher Eisensulfidkomplexe zur Verfügung steht und die Aktivität der Bakterien beeinflusst und die Schwarzfärbung verursacht. Sowohl in den Filtraten der Zuläufe und der DEMON -Reaktoren in Tobl und Strass konnten Unterschiede festgestellt werden. Im Zulauf der ARA Strass (2,5 mg S 2- /L) und im Becken (49,8 µg S 2- /L) konnten deutlich höhere Werte als im Zulauf der ARA Tobl (1,2 µg S 2- /L) und im Becken (2,3 µg S 2- /L) gemessen werden (Abb. 36). In den Biomassen gefundene Sulfid-Konzentrationen unterscheiden sich unwesentlich: Biomasse Strass mit 0,7 µg S 2- /g TS, Biomasse Tobl mit 0,5 µg S 2- /g TS, rote Granulen mit 0,4 µg S 2- /g TS und schwarze Granulen mit 0,3 µg S 2- /g TS (Abb. 37). Die Messwerte in den Filtraten und der Biomasse liegen um mehrere Größenordnungen unter der von Jin et al. (2013) beschriebenen Hemm- Konzentration von 32 mg S 2- /L. Damit kann Sulfid als Verursacher der Inhibition und die auftretende Schwarzfärbung ausgeschlossen werden. Wie bereits erwähnt, könnte die Zugabe von Molke als Co-Substrat zu einer Überlastung der Faultürme führen und eine Akkumulation von organischen Säuren, Aminosäuren und biogenen Aminen wäre die Folge. Leicht flüchtige organische Fettsäuren könnten ein gesteigertes Wachstum von konkurrierenden Denitrifikanten bewirken. In den Untersuchungen konnten jedoch nur geringe Konzentrationen von wenigen mg/l organischer Säuren im Trübwasser, im Zulauf und im DEMON -Reaktor nachgewiesen werden (Abb. 33). Damit dürften die organischen Säuren unter den vermuteten Hemm- Konzentrationen liegen bzw. ein Wachstum der Denitrifikanten nur in geringem Maße fördern. Die Konzentration biogener Amine im Zulauf des DEMON -Reaktors betrug 0,02 mm, im Reaktor selbst konnte eine Konzentration von 0,06 mm gemessen werden. Die Forschung in Bezug auf biogene Amine und Aminosäuren und deren inhibitorische Wirkung auf Anammox-Bakterien ist noch wenig fortgeschritten. In Voruntersuchungen von Ni und Zhang (2013) konnten einige Aminosäuren ausfindig gemacht werden, welche den Anammox-Prozess inhibieren und eine Schwarzfärbung der Granulen bewirkt. Die in der Literatur angegebenen 113

36 Diskussion Konzentrationen liegen jedoch über den in Tobl gemessenen Werten und somit können biogene Amine und Aminosäuren als Inhibitoren bzw. als Verursacher der Schwarzfärbung der Anammox-Granulen im DEMON -Reaktor der ARA Tobl ausgeschlossen werden (Kapitel ; Ni und Zhang, 2013) Molekularbiologische Untersuchungen Aufgrund der beobachteten schwarzverfärbten Granulen wurden im Zuge dieser Arbeit molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt. Mit Hilfe der qpcr sollte ein eventueller Unterschied zwischen der roten und schwarzen Granulenfraktion auf Basis der 16S rrna untersucht und die Frage geklärt werden, ob die schwarzen Granulen Anammox-DNA enthalten und ob sich der DNA-Gehalt zwischen den Proben Tobl Gesamtbiomasse, Tobl schwarze Granulenfraktion und Tobl rote Granulenfraktion unterscheidet. Des Weiteren sollte mit Hilfe der Illumina-Sequenzierung die mikrobielle Gemeinschaft des DEMON -Reaktors Tobl charakterisiert werden. In einer chinesischen Forschungsstudie wurde die Interaktion von inaktiven methanogenen Granulen und Anammox-Bakterien in Bezug auf die Granulenbildung untersucht (Ni et al., 2010). Eine der gewichtigsten Limitierungen für das Wachstum von Anammox-Bakterien ist deren lange Generationszeit (Strous et al., 1998). Zudem spielt die Nitrit-Konzentration eine entscheidende Rolle bei Wachstum und Granulenbildung: geringe Nitrit-Konzentrationen bedeuten für das Wachstum eine Limitierung durch Substratmangel (van der Star et al., 2007). Die Untersuchungen von Ni et al. (2010) zeigten, dass bereits nach wenigen Monaten auf den schwarz-braunen methanogenen Granulen Anammox-Bakterien dauerhaft anhafteten. Nach weiteren Monaten veränderte sich die Färbung des Schlamms von bräunlich-schwarz hin zu rötlich-braun. Die Impfgranulen mit glatten Oberflächen zerbrachen, sobald diese ausschließlich einem Anammox-angepassten Nährmedium ausgesetzt waren und kleine rote Granulen konnten beobachtet werden. Bei der Bildung von Anammox-Granulen werden derzeit zwei unterschiedliche Mechanismen unterschieden: zum einen heften sich Anammox-Bakterien an bereits 114

37 Diskussion bestehende Anammox-Granulen und vergrößern dadurch den Durchmesser der Kompartimente, zum anderen wird eine Entwicklung neuer Anammox-Granulen an Biofilm-Material nicht ausgeschlossen (Imajo et al., 2004). Eine weitere wichtige Rolle spielen extrazelluläre Polymere (Liu et al., 2003). Die Polymere verbinden mittels physikalischer Kräfte benachbarte Zellen durch die Veränderung der negativen Oberflächenspannung der Bakterien miteinander (Schmidt und Ahring, 1994). Bei hohen Stickstoff-Gehalten bilden Anammox-Bakterien vermehrt solche extrazellulären Polymere und vergrößern dadurch den Granulen-Durchmesser. In der Studie von Ni et al. (2010) wird der inaktive methanogene Schlamm daher als ideales Inokulum und Trägermaterial zur raschen Entwicklung und Granulenbildung von Anammox-Bakterien beschrieben. Die auftretende Schwarzfärbung einiger Granulen an der ARA Tobl könnte daher mit der Granulenbildung um einen Biofilm erklärt werden. Mithilfe molekularbiologischer Methoden sollte daher geprüft werden, ob sich die roten und die schwarzen Granulen, bezogen auf die Gesamtbiomasse, im Anammox- Bakterien-Anteil unterscheiden (qpcr) und um welche Mikroorganismen es sich eventuell beim Biofilm-Trägermaterial handelt (Sequenzierung). Mit Hilfe der Realtime PCR (qpcr) konnten die 16S rrna-gensequenzen von Anammox-Bakterien in verschiedenen Proben quantifiziert werden. Bezogen auf die Gesamtbiomasse ist der Anteil an Anammox-Bakterien in der Probe der ARA Strass deutlich höher als jener der Probe der ARA Tobl. Die rote und schwarze Granulenfraktion unterschieden sich nur geringfügig voneinander und liegen in etwa im Bereich der Gesamtprobe der ARA Tobl (Abb. 46). Es konnte daher zum einen gezeigt werden, dass im Reaktor Strass mehr Anammox-DNA vorliegt als in Tobl und zum anderen, dass auch die schwarzen Granulen zu einem großen Teil aus Anammox-DNA bestehen. Da DNA jedoch auch dann noch vorliegt, wenn ein Organismus bereits abgestorben ist, kann keine Aussage über den Vitalitätszustand der Bakterien getroffen werden. Dafür müssten weitere Untersuchungen auf RNA Basis durchgeführt werden. 115

38 Diskussion Bei der Schmelzkurven-Analyse der durchgeführten qpcr konnte ein auffallender zweiter Peak im Temperaturbereich 85 C bis 90 C beobachtet werden (Abb. 47). Dieser zweite Peak ist in den Proben aus dem DEMON -Reaktor der ARA Tobl deutlicher ausgeprägt als in den Proben der ARA Strass. Der Unterschied zwischen diesem zweiten Peak und dem darauffolgendem Hauptpeak gibt Hinweise darauf, dass sich die in der qpcr amplifizierten Sequenzen in mindestens einem Basenpaar unterscheiden, oder eine etwas heterogene Gemeinschaft vorliegt (Doppelpeak). Park et al. (2010) und van der Star et al. (2007) berichten, dass sich die angereicherte Anammox-Spezies, in den von ihnen untersuchten Reaktoren von der angeimpften Anammox-Art unterschied. Während die angeimpften Bakterien eng verwandt mit der Art Candidatus Kuenenia stuttgartiensis waren, konnten beide Forschergruppen alsbald Candidatus Brocadia fulgida als häufigste auftretende Art ausfindig machen. Diese Verschiebung ist möglicherweise damit zu erklären, da Brocadia-Arten eine geringere Affinität für Nitrit, im Vergleich mit Kuenenia stuttgartiensis, besitzen (Park et al., 2010). Die Anammox-Diversität ist im Schlamm recht hoch, und welcher Organismus bzw. welche Anammox-Art sich schlussendlich durchsetzt, ist nicht durch die Animpfung der Reaktoren bestimmt, sondern v.a. durch Nischen-Differenzierung und andere Aspekte. Da die Stöchiometrie und Stoffwechselwege der Anammox-Bakterien aber annähernd ident sind, hat dies keinen Einfluss auf die Abbauraten von Stickstoff (van der Star et al., 2007). Aufgrund der qpcr-ergebnisse kann eine solche Verschiebung der Anammox-Arten-Zusammensetzung im DEMON -Reaktor Tobl nicht ausgeschlossen werden. Park et al. (2010) zeigten zudem, dass sich zusätzlich eine zweite wesentliche Population von Bakterien etablierte. Diese können dem Bacteroidetes/Chlorobi Phylum zugeordnet werden und wurden als hilfreich für die Biomasse-Granulierung beschrieben. Ähnliche Beobachtungen mit zum Teil anderen Organismengruppen (z.b. Chloroflexi) wurden zudem bereits von Chamchoi et al. (2007), Li et al. (2009) und Yamada et al. (2005) dokumentiert und könnten für den DEMON -Reaktor Tobl von Relevanz sein. 116

39 Diskussion Daher wird von Park et al. (2010) vermutet, dass die Gesamtpopulationsdynamik und Reaktorleistung nicht ausschließlich von Planctomycetes in Anammox- Reaktoren bestimmt wird, sondern auch von Bakterien und Bakteriengruppen, welche den Anammox-Granulen strukturelle Integrität verleihen und für die Granulenbildung förderlich sind. In den molekularbiologischen Untersuchungen des DEMON -Reaktors Tobl wurden folgende fünf häufig vertretenen (relative Abundanz) Bakterien-Phyla gefunden: Acidobacteria (11,6 Prozent), Chlorobi (50,2 Prozent), Proteobacteria (22,7 Prozent), Chloroflexi (4 Prozent) und Planctomycetes (3,7 Prozent) (Abb. 49). Als Referenz konnten von Gonzalez-Martinez et al. (2015) im DEMON -Reaktor Apeldoorn folgende Bakterien-Phyla gefunden werden: Acidobacteria (2,1 Prozent), Chlorobi (17,9 Prozent), Proteobacteria (34 Prozent), Chloroflexi (1,2 Prozent) und Planctomycetes (7,5 Prozent). Ein deutlich erhöhter Anteil an Chlorobi im DEMON - Bioreaktor Tobl und ein niedriger Anteil an Planctomycetes im Vergleich zum Reaktor in Apeldoorn ist feststellbar. Eine Hilfestellung bei der Anammox- Granulenbildung durch z.b. Bakterien des Phylums Chlorobi kann daher nicht ausgeschlossen werden. Mit Hilfe einer MANOVA konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Proben der ARA Tobl festgestellt werden (p-wert für alle Gruppen: 0,161444; F- Wert für alle Gruppen: 22,09043). Einen signifikanten Unterschied zwischen den Proben konnte für die Gruppen Chlorobi und Chloroflexi festgestellt werden. Mit Hilfe einer ANOVA konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Proben für die Gruppen der Acidobacteria (p-wert: 0,8616; F-Wert: 0,1528), Planctomycetes (p-wert: 0,09062; F-Wert: 3,679) und Proteobacteria (p-wert: 0,5282; F-Wert: 0,7112) festgestellt werden. Signifikante Unterschiede zwischen den Proben der ARA Tobl konnten für die Gruppen der Chlorobi (p-wert: 0,005777; F-Wert: 13,72) und Chloroflexi (p-wert: 0,001871; F-Wert: 21,35) festgestellt werden. Die Unterschiede für die Gruppe der Chlorobi zeigten sich zwischen den Proben Tobl rote Granulenfraktion und Tobl Gesamtbiomasse sowie Tobl schwarze Granulenfraktion und Tobl Gesamtbiomasse. Die Unterschiede für die Gruppe der 117

40 Diskussion Chloroflexi zeigten sich zwischen den Proben Tobl rote Granulenfraktion und Tobl schwarze Granulenfraktion sowie für Tobl Gesamtbiomasse und Tobl schwarze Granulenfraktion. Die Proben Tobl rote Granulenfraktion und Tobl Gesamtbiomasse unterschieden sich nicht signifikant. Die grünen Schwefelbakterien (Chlorobi) sind phototrophe, obligat anaerobe Bakterien mit verschiedenen äußeren Formen und ohne aktive Bewegung. Vertreter dieser Bakterien betreiben eine anoxygene Photosynthese mit reduzierten Schwefelverbindungen wie Schwefelwasserstoff (H 2 S) und Thiosulfat (S 2 O 2 3 ) oder mit elementarem Schwefel als Reduktans. Einige Arten sind auch in der Lage, Wasserstoff oder zweiwertiges Eisen phototroph zu oxidieren. Grüne Schwefelbakterien sind im Allgemeinen photoautotroph, einige können aber auch organische Stoffe mit Hilfe der Lichtenergie assimilieren und werden dann als photoheterotrophe Organismen bezeichnet. Grüne Schwefelbakterien kommen vorwiegend in anoxischen, Schwefelwasserstoff-haltigen Gewässerbereichen vor. Sie nutzen sehr effektiv Licht für die Photosynthese und kommen auch in lichtarmen Bereichen vor. Einige Grüne Schwefelbakterien bilden mit chemoheterotrophen Bakterien Aggregate (Mutualismus), so genannte Konsortien. Ein Beispiel dafür ist Chlorochromatium aggregatum. Dabei sind um lange begeißelte heterotrophe Bakterien mehrere Individuen von Grünen Schwefelbakterien angeordnet. Bei dem heterotrophen Organismus handelt es sich um ein sulfatreduzierendes Bakterium, welches Sulfat zu Sulfid reduziert. (Brock Mikrobiologie, S. 797). Die Proteobacteria stellen eines der größten Phyla der Bakterien dar. Zu ihnen gehören viele wichtige stickstofffixierende Bakterien und Krankheitserreger. Die Zellwände der Proteobacteria bestehen aus ein- bis wenigschichtigem Murein und Lipopolysacchariden und werden daher den gramnegativen Bakterien zugeordnet. Viele Arten sind motil (mit Begeißelung). Einige Untergruppen der Proteobacteria wie die Rhodospirillaceae (Purpurbakterien) und Chromatiaceae (Schwefel- Purpurbakterien) sind in der Lage, unter anaeroben Bedingungen Photosynthese zu betreiben. Sie benutzen dafür organische Stoffe, Schwefelwasserstoff, Schwefel oder Wasserstoff als Elektronen-Donor. Die Untergruppe der Myxobacteria steht 118

41 Diskussion bisher als einzige bekannte Gruppe von Proteobakterien im Übergangsfeld zwischen einzelliger und mehrzelliger Lebensweise. Zu den Beta-Proteobakterien werden unter anderem die aeroben Ammoniumoxidierer Nitrosomonas europaea und Nitrosomonas eutropha gezählt (Brock Mikrobiologie, S. 52, 707, 733). Die Gruppe der Acidobacteria bildet innerhalb der Bakterien ein eigenständiges Phylum und wurde bisher in einer Vielzahl von unterschiedlichen Ökosystemen nachgewiesen. In Bodenproben sind sie nicht selten die am häufigsten vertretene Bakteriengruppe, kommen aber auch in Wasser- und Sedimentproben vor. Acidobakterien sind wahrscheinlich außerordentlich divers und spielen in der Natur eine wichtige Rolle. Über den Stoffwechsel dieser Bakterien ist bis dato wenig bekannt. Dies liegt vor allem daran, dass diese Bakterien selten in Reinkulturen gehalten werden können (Brock Mikrobiologie, S. 793). Die Grünen Nichtschwefelbakterien oder Chloroflexi bilden eine phylogenetisch eigenständige Gruppe unter den Bakterien und werden von den Grünen Schwefelbakterien unterschieden. Vertreter der Chloroflexi sind gramnegativ, meist filamentös und thermophil. Chloroflexi sind metabolisch vielfältig: sie können anoxygen photoautotroph, photoheterotroph und bei Lichtmangel chemoorganotroph wachsen. Grüne Nichtschwefelbakterien können in heißen Quellen mit neutralen bis hohen ph-werten, aber auch in marinen Matten gefunden werden (Brock Mikrobiologie, S. 804). Wie sich z.b. phototrophe Organismen wie Chlorobi oder Chloroflexi im sehr lichtarmen DEMON -Reaktor Tobl halten oder möglicherweise sogar vermehren können, müsste weitergehend genauer untersucht werden. Es ist durchaus möglich, dass es sich bei den gefundenen Sequenzen um DNA-Reste von inaktiven, abgestorbenen Organismen handelt und diese ausschließlich für die Anammox- Granulen-Bildung von Bedeutung sind und mithilfe des Hydrozyklons im Bioreaktor zurückgehalten werden. Zur Überprüfung dieser Hypothese müssten weitere 119