Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK-Protein: Funktionelle Domänen und Phosphorylierung

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1 Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK-Protein: Funktionelle Domänen und Phosphorylierung Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat) des Fachbereiches Biologie Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Universität Konstanz Vorgelegt von Ferdinand Kappes Konstanz, im August 2004 Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2004 Referentin: Priv-Doz. Dr. Claudia Gruss Referent: Prof. Dr. Rolf Knippers

2 Inhaltsverzeichnis II Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht: Kappes, F., C. Damoc, R. Knippers, M. Przybylski, L. A. Pinna, and C. Gruss Phosphorylation by Protein Kinase CK2 Changes the DNA Binding Properties of the Human Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24: Kappes, F.*, I. Scholten*, N. Richter, C. Gruss, and T. Waldmann Functional Domains of the Ubiquitous Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24: * geteilte Erstautorenschaft Waldmann, T., I. Scholten, F. Kappes, H.G. Hu, and R. Knippers The DEK protein an abundant and ubiquitous constituent of mammalian chromatin, in press Weitere Veröffentlichungen: Kappes, F., K. Burger, M. Baack, F. O. Fackelmayer, and C. Gruss Subcellular localization of the human proto-oncogene protein DEK. J Biol Chem 276: Kulartz, M., E. Hiller, F. Kappes, L. A. Pinna, and R. Knippers Protein kinase CK2 phosphorylates the cell cycle regulatory protein Geminin. Biochem Biophys Res Commun 315: Präsentation auf Kongressen: 9/2000 Weimar Conference of Genetics, Weimar Poster-Präsentation 10/2001 Annual Meeting of the German Genetics Society, Halle, Short Talk 10/2003 1st Symposium of Transregio 5, München, Poster-Präsentation

3 Inhaltsverzeichnis III Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2001 bis August 2004 am Lehrstuhl für Molekulare Genetik (Prof. Dr. R. Knippers) der Universität Konstanz angefertigt. Bei meiner Betreuerin Priv. Doz. Dr. Claudia Gruss möchte ich mich für die Bereitstellung des Themas, für das stete Interesse am Fortgang der Arbeit, für die Diskussionsbereitschaft und für den vierwöchigen Forschungsaufenthalt in Oslo bedanken. Sie schied im Januar diesen Jahres durch eine Stellung in der Industrie aus. Ich wünsche Ihr von ganzem Herzen weiterhin viel Erfolg. Herrn Prof. Dr. R. Knippers möchte ich für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe danken, für das Interesse an der Arbeit und für die viele Unterstützung, die mir gerade nach dem Ausscheiden von Claudia Gruss entgegengebracht wurde. Einen besonderen Dank möchte ich dem DEK-Labor aussprechen, denn Tanja Waldmann, Nicole Richter, Friederike Knoche, Ingo Scholten und Hong Gang Hu, waren nicht nur Mitstreiter und oft genug Leidensgenossen im wissenschaftlichen Sinne, sondern schafften auch eine einzigartig freundschaftliche Atmosphäre. Dies wird mir sehr fehlen. Nicole und Tanja sei ganz besonders für die wunderbare Zusammenarbeit im Mutanten -Projekt und bei den unzähligen Reinigungen gedankt. Bei Tanja möchte ich mich noch ganz herzlich für die unermüdliche Hilfe, die Durchsicht dieses Manuskripts und für die vielen aufmunternden Worte, gerade am Schluss dieser Arbeit, bedanken. Martina Baack, die immer ein offenes Ohr für mich hatte, möchte ich für die vielen methodischen Tipps und für die vielen fruchtbaren Diskussionen danken, ohne die einiges nicht so gut geklappt hätte. Catalina Damoc gebührt ein großer Dank für die Durchführung der Massenspektrometrie. Ein weiterer Dank geht an Monika Kulartz und Daniel Schaarschidt, die beide immer sehr hilfsbereit waren und gerade am Schluss viel Geduld bei der Durchsicht des Manuskriptes aufgebracht haben. Allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, die namentlich nicht erwähnt wurden, möchte ich an dieser Stelle für die große Hilfsbereitschaft und das Miteinander danken. So trug jeder einzelne ein Stück zu dieser Arbeit bei. Bei Anita Krebs, die ein Jahr in unserer Gruppe verbrachte, möchte ich mich für den großen Enthusiasmus für die Problembewältigung des Baculovirus-Systems bedanken. Bei Sonja von Aulock möchte ich mich für die Einführung in die FACS-Messung bedanken. Ein Dankeschön geht hier auch an New England Biolabs, ohne deren λ-phosphatase die meisten hier gezeigten Daten nicht zustande gekommen wären. Meinen Mädels möchte ich ebenfalls einen Dank aussprechen für die vielen unschlagbaren Konstanzer -Nächte, den unzähligen Erörterungen über das Leben und die Welt und für das ichsein-dürfen. Karina möchte ich hier einen besonderen Dank aussprechen, denn du bist nicht alles, aber ohne dich ist alles nichts. Danke auch an Alex und Nino, die die Zeit in Konstanz mit so manch unvergesslichen Stunden gefüllt haben. Meiner WG und der Nachbarin möchte ich für die schöne Zeit danken und für die vielen kleinen wundervollen Gesten, die mir entgegengebracht wurden. Auch wenn ich im Laufe dieser Arbeit neben Höhen auch so manche Tiefen durchschritten habe, so entschädigte doch jedes Ergebnis vielfach und ließ die Freude an dieser faszinierenden Wissenschaft nie untergehen. Sehr schmerzlich war der Verlust meiner Oma, die die Fertigstellung dieser Arbeit leider nicht mehr miterleben durfte. Der letzte Dank an dieser Stelle gebührt meinen Eltern, die, obwohl nicht immer glücklich mit meinem eingeschlagenen Lebensweg, doch immer kompromisslos hinter mir standen und sich meist mehr gefreut und meist mehr gelitten haben als ich selber. Ich bin unendlich froh, euch zu haben. Diese Arbeit widme ich euch. Danke, euer Nondi.

4 Inhaltsverzeichnis IV Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis: IV VIII 1 Einleitung Der Zellkern Chromatin Hierarchische Organisation des Chromatins Histone Modifikation der Chromatinstruktur Posttranslationale Modifikation der Histone Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine HMGB (HMG-1/-2) HMGA (HMGY/I) HMGN (HMG14 / -17) Chromatinremodeling Das DEK-Protein Entdeckung Eigenschaften Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten Topologieveränderung und DNA-Bindung Interaktion mit anderen Proteinen Interaktion AP-2α, einem Transkriptionsaktivator Interaktion mit Daxx, einem Transkriptionsrepressor Interaktion mit LANA 29 2 Zielsetzung 30 3 Material und Methoden Material Allgemeine Lösungen Allgemeine Methoden SDS-Polyacryalmid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Coomassie Färbung und Silber Färbung von Polyacrylamid Gelen Western-Blot und Immunfärbung (Immunblot) Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984) Agarosegelelektrophorese 36

5 Inhaltsverzeichnis V DNA Fällung Plasmid-Präparation und Cäsiumchlorid Reinigung Baculovirus-System und Proteinreiniung Klonierung von His-DEK 37 Ko-Transfektion und Plaque-Assay Infektion, Reinigung und Dephosphorylierung von His-DEK und His-DEK Deletionsmutanten Antikörperproduktion und Reinigung SV Präparation von SV40-DNA Präparation von SV40-Minichromosomen Topologieassay (DEK Assay) DNA-Bandshiftassay (EMSA) Zellkultur, Synchronisation, Radioaktive Markierung mit [ 32 P]- Orthophosphat und [ 35 S]-Methionin (Pulse- und Pulse Chase Experimente), S-20 Extrakte, Hancock-Chromatin und Immunpräzipitation HeLa und CV1 Zellen Insektenzellen Synchronisation und in vivo Pulse-Markierung mit [ 32 P]- Orthophosphat und [ 35 S]-Methionin FACS Analyse Herstellung von Hanckock Chromatin Immunpräzipitation Herstellung von S-20 Extrakten In Vitro Phosphorylierung In-Gel-Kinaseassay Filter-Bindungs-Assay South-Western-Analysen Zellfraktionierung Mikrokokken Nuklease Verdau Sucrose-Dichtengradientenzentrifugation RNA-Präparation, Reverse Transkription und Real Time PCR Massenspektrometrie In-Gel-Verdau Triple-Quadrupole-Ion-Trap-Massenspektrometrie Datenbank-Suche und Kennzeichnung der Phosphopeptide 55

6 Inhaltsverzeichnis VI 4 Ergebnisse Biochechemische Charakterisierung von DEK in vivo DEK mrna während des Zellzyklus Neusynthese des DEK-Proteins während des Zellzyklus Halbwertszeit des DEK-Proteins in vivo DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert Expression, Reinigung und Charakterisierung von rekombinantem His-DEK mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem His-DEK aus dem Baculovirus-System ist hoch phosphoryliert Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung Phosphorylierung von DEK in vitro mit Zellextrakten Potenzielle DEK-phosphorylierende Kinasen und deren Phosphorylierungsstellen DEK wird durch die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo phosphoryliert Filter-Bindungsassays mit gereinigten Kinasen In-Gel-Kinaseassay Inhibition der DEK-Phosphorylierung mit TBB, einem hoch spezifischen CK2-Inhibitor Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in der DEK- Aminosäuresequenz Funktionelle Domänen des DEK-Proteins Nur dephosporyliertes His-DEK führt, wie GST-DEK, zur Bildung einer Topoisomerleiter und bindet an DNA Dephosporyliertes His-DEK bindet wie GST-DEK an SV40 Minichromosomen DNA-Bindung und Toplologierveänderung von DEK und DEK- Deletionsmutanten Das SAF-Box enthaltende Fragment bindet DNA Das SAF-Box-Fragment (87-187) ist für die Topologieveränderung verantwortlich Identifizierung einer zweiten DNA-Bindedomäne ( ) des DEK-Proteins Biochemische Aspekte der DEK-Phosphorylierung DEK-Multimerisierung und Phosphorylierung Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-DNA-Bindung Einfluss der CK2-Phosphorylierung auf die Aktivität der beiden DEK-DNA-Bindedomänen? Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-Chromatin- Interaktion 96

7 Abbildungsverzeichnis: VII Eine stärkere Phosphorylierung in der G1-Phase des Zellzyklus führt zu keiner Lokalisationsänderung von DEK Wie wird phosporyliertes DEK an Chromatin gebunden? DEK ist nur phosphoryliert auf Hancock-Chromatin zu finden Diskussion DEK-mRNA, DEK-Neusynthese und Halbwertszeit von DEK in HeLa Zellen DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert Kann eine erhöhte Phosphorylierung von DEK alleine durch die CK2 hervorgerufen werden? DEK ein Protein mit mehreren Modulen Das SAF-Box enthaltende Fragment (87-187) des DEK-Proteins ist für die DNA-Bindung und für die Topologieveränderung verantwortlich Der Bereich stellt eine zweite DNA-Bindedomäne von DEK dar Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 Regulation der DEK-Funktion? Einfluss der CK2-Phopshorylierung auf die DEK-Chromatin- Bindung DEK bleibt in vivo auch im phosphorylierten Zustand mit Chromatin assoziiert Regulation der DNA-Bindung und Multimerisierung von DEK durch die CK2- ein Modell Zusammenfassung Literatur Abkürzungen 139

8 Abbildungsverzeichnis: VIII Abbildungsverzeichnis: Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus 11 Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation 12 Abbildung 1-3 Das Nukleosom 14 Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin 15 Abbildung 1-5 Die Core -Histone 16 Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4 18 Abbildung 1-7 Die histone-code -Hypothese 19 Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine 20 Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins 25 Abbildung 3-1 pbluebachis2 38 Abbildung 3-2 Prinzip der homologen Rekombination zur Gewinnung von rekombinanten Viren 40 Abbildung 3-3 Plaque -Assay 41 Abbildung 3-4 Reinigung über Ni-NTA-Agarose 42 Abbildung 4-1 DEK m-rna während des Zellzyklus 57 Abbildung 4-2 Neusynthese von DEK während des Zellzyklus 58 Abbildung 4-3 Halbwertszeit von zellulärem DEK 60 Abbildung 4-4 Phosphorylierung von DEK in vivo 62 Abbildung 4-5 Reinigung von wthis-dek aus dem Baculovirus-System 63 Abbildung 4-6 His-DEK wird phosphoryliert exprimiert 64 Abbildung 4-7 In vitro Phosphorylierung von DEK 66 Abbildung 4-8 Potenzielle Phosphorylierungsstellen von DEK 67 Abbildung 4-9 Filterbindungs-Assay mit gereinigten Kinasen 68 Abbildung 4-10 In-Gel-Kinaseassay 69 Abbildung 4-11 Filterbindungs-Assay und Inhibition der CK2 durch TBB 72 Abbildung 4-12 Inhibition der DEK-Phosphorylierung durch Einstz von TBB in vitro und in vivo 73 Abbildung 4-13 Kartierung von CK2-Phosphorylierungsstellen durch ESI-MS 75 Abbildung 4-14 Identifizierte Peptide und Gesamtabdeckung 76 Abbildung 4-15 Schematische Darstellung aller klonierten und überexprimierten DEK-Deletionsmutanten 78 Abbildung 4-16 Darstellung einer Auswahl an gereinigten Deletionsmutanten aus dem Baculovirus-System 79 Abbildung 4-17 EMSA, South-Western und Topologieassay mit wthis-dek 81 Abbildung 4-18 Bindung von unbehandeltem und dephosphoryliertem His-DEK an salzgewaschene SV40 Minichromosomen 82 Abbildung 4-19 EMSAs mit wt-his-dek und verschiedenen DEK Deletionsmutanten 84 Abbildung 4-20 Topologieassay mit verschiedenen DEK-Deletionsmutanten 86

9 Abbildungsverzeichnis: IX Abbildung 4-21 EMSA mit C-terminalen DEK Fragmenten 87 Abbildung 4-22 Sedimentationsanalyse und native Gelelektrophorese von phosphoryliertem und dephosphoryliertem His-DEK 90 Abbildung 4-23 Sedimentationsverhalten von DEK in einer CK2- Phosphorylierungszeitreihe 91 Abbildung 4-24 Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 inhibiert die DEK-DNA Bindung 93 Abbildung Abbildung 4-26 EMSAs mit CK2-phosphorylierten DEK-Fragmenten 95 Abbildung 4-27 Mikrokokken-Nuklease Verdau von SV40-Minichromosomen 97 Abbildung 4-28 Interaktion von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His- DEK mit salzgewaschenen SV40-Minichromosomen 99 Abbildung 4-29 Gereinigte CK2 phosphoryliert endogenes, nukleosomal gebundenes DEK 100 Abbildung 4-30 Zellfraktionierung von G1-Phase-Zellen 102 Abbildung 4-31 Assoziation von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His- DEK mit nativen Oligonukleosomen 105 Abbildung 4-32 Hancock-Chromatin-Präparation 108 Abbildung 5-1 Funktionelle Domänen des DEK-Proteins 123 Abbildung 5-2 Modell einer möglichen Regulation der DEK-Funktion durch CK2- Phosphorylierung 128

10 1 Einleitung 1.1 Der Zellkern Der Zellkern setzt das Prinzip der Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle durch die Existenz einer Kernhülle um. Dies ist einer der fundamentalsten Unterschiede zur prokaryotischen Zelle. Die Kernhülle besteht aus zwei Lipid- Doppelschichten, von denen die äußere kontinuierlich in das Membransystem des Endoplasmatischen Retikulums übergeht, während die andere sich zum Kerninneren hin orientiert. Die Kernmembran ist durch Kernporenkomplexe durchspannt, die den Transport von Makromolekülen von und in den Kern regulieren (z.b. (Adam, 2001) und damit den Informationsaustausch zwischen Kern und Cytoplasma ermöglichen. Der Kern wird durch ein Geflecht von Intermediärfilamenten beweglich in der Zelle verankert. Die innere Stabilität wird durch die Kernlamina, die auch den Ab- und Wiederaufbau während der Kernteilung reguliert, vermittelt (Vlcek et al., 2001; Gruenbaum et al., 2003). Die Kernlamina ist auch an vielen anderen Prozessen regulierend beteiligt. Trotz der hohen Dichte an Proteinen, DNA und RNA im Zellkern, muss ein geordneter und regulierter Ablauf aller genetischen Prozesse ermöglicht werden. Dies wird, nach Meinung vieler Autoren, durch eine weitere Subkompartimentierung des Nukleus erreicht. Das am längsten bekannte Subkompartiment des Nukleus ist der Nukleolus, der den Ort der rrna- Synthese und des Ribosomenzusammenbaus darstellt (Scheer and Weisenberger, 1994). Eine weitere funktionelle Kompartimentierung erfolgt durch die Chromosomen Territorien. Jedes Chromosom nimmt, seinem DNA- Gehalt folgend, ein bestimmtes, nicht überlappendes Territorium im Zellkern ein (Lichter et al., 1988), welches wiederum in sogenannte subchromosomale Foci untergliedert ist. Aktive Gene oder aktive Transkriptionseinheiten sind hierbei auf der Oberfläche, inaktive Gene eher im inneren Bereich zu finden (Croft et al., 1999). In diesen Territorien lassen sich weitere Strukturen, die sogenannten PcG-Körper finden, die Polycomb Proteine enthalten und dadurch heterochromatische Bereiche darstellen (Saurin et al., 1998). Diese Bereiche können mit der Kernlamina assoziiert sein. Die Bereiche zwischen den Chromosomenterritorien werden durch das Inter-Chromatin-Domänen- Kompartiment (ICD) ausgefüllt (Bridger et al., 1998). Dieses Kanalsystem umgibt die Territorien, durchspannt sie teilweise und dient als Transportweg für Makromoleküle (z.b RNA) aus dem Kern. Pre-mRNA Spleißproteine kommen gehäuft in den sogenannten nuclear-speckles vor, wovon es pro Zelle etwa gibt (Spector, 1993). Weitere verschiedene örtlich eingegrenzte

11 Einleitung 11 Strukturen wurden kollektiv als nuclear-bodies bezeichnet (Grande et al., 1997) (Gall, 2000), (Schul et al., 1996). Die räumliche Trennung dieser Subkompartimente wird vermutlich über die Assoziation oder Anheftung an die sogenannte Kernmatrix vermittelt. Die Kernmatrix ist eine operational definierte Struktur, deren genaue Zusammensetzung noch nicht erschöpfend bekannt ist. Sie kann durch enzymatische Extraktion des Chromatins gewonnen werden und beinhaltet Teile der Kernporenkomplexe, Überreste der Nukleoli und ein dreidimensionales Netzwerk, das hauptsächlich aus heterogener RNA und verschiedenen Proteinen besteht. Die RNA übt bei der Aufrechterhaltung der faserigen Struktur eine wichtige Rolle aus (Xing and Lawrence, 1991),(He et al., 1990). Behandelt man Zellen mit Transkriptionshemmstoffen führt dies zum Zusammenbruch der Kernmatrix, was eine direkte Korrelation zwischen Transkription und der Existenz der Kernmatrix vermuten lässt (Fey et al., 1986); (Nickerson et al., 1989). Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus Der Nukleus ist eine mosaikartig zusammengesetzte Organelle, die durch die Kernhülle vom Cytoplasma getrennt ist. Die größten Strukturen sind die Chromosomenterritorien, die durch die ICD-Domänen voneinander getrennt werden. Weitere Kompartimente sind schematisch dargestellt (entnommen aus Architektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000). Die Kernmatrix scheint daher im Interphase-Kern eine wichtige Rolle bei der Organisation des Genoms und der subnuklearen Kompartimente zu haben (Gasser et al., 1989). Man geht davon aus, dass die Chromatinfasern in Schleifen von ca bp organisiert sind. Es wird vermutet, dass jede Schleife, in vivo einen funktionellen Abschnitt darstellt (Gasser et al., 1989). Die Chromatinschleifen sind über SAR/MAR-Bereiche an die Kernmatrix gebunden. Die bp

12 Einleitung 12 langen SAR/MAR-Elemente zeichnen sich durch AT-Reichtum aus und befinden sich meist außerhalb von kodierenden Regionen. Den SAR/MAR- Bereichen wird eine Funktion bei der Aufrecherhaltung der Domänenorganistion eukaryotischer Gene, bei der Transkriptionsaktivierung und bei der DNA- Replikation zugesprochen. Häufig werden SAR/MAR-Elemente stromaufwärts und -abwärts von transkribierten Genen oder Gengruppen gefunden oder liegen in unmittelbarer Nähe von regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren und Enhancern (Blasquez et al., 1989; Bonifer et al., 1991). Als Beispiele für SAR/MAR-bindende Proteine sind SAF-A (Romig et al., 1992a), Topoisomerase II (Udvardy et al., 1985; Adachi et al., 1989), Histon H1 (Izaurralde et al., 1989), Lamin B1, A und C (Luderus et al., 1994) bekannt. Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation Die einzelnen Chromatinschleifen sind an ihrer Basis mit architektonischen Elementen, den SAR/MAR- Bereichen, und über SAR/MAR-bindende Proteine an die Kernmatrix geheftet (entnommen aus: Die Archtitektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000) 1.2 Chromatin Die DNA, der Träger der genetischen Information aller Organismen, würde in einer eukaryotischen Zelle im ausgestreckten Zustand eine Länge von etwa zwei Meter in Anspruch nehmen. Diese langen Moleküle müssen nicht nur in einem Zellkern von 10-5 m Durchmesser Platz finden, sondern auch in einer hoch organisierten Art und Weise gelagert werden, die verschiedenste Prozesse, wie Transkription, DNA-Replikation, DNA-Reparatur und DNA- Rekombination ermöglichen. Dies wird durch eine Kompaktierung der DNA in verschieden stark kondensierten Schleifen erreicht. Diesen lichtmikroskopisch deutlich anfärbbaren Nukleoproteinkomplex nennt man Chromatin. Neben den

13 Einleitung 13 Histonen, den am häufigsten vorkommenden Proteinen im Chromatin, sind noch eine Vielzahl anderer Proteine, wie Nicht-Histon-Proteine, Transkriptionsfaktoren und Topoisomerasen mit diesem assoziiert. Chromatin ist eine hochdynamische Struktur, die verschiedensten Veränderungen, abhängig von dem funktionellen Status der Zelle, unterliegt Hierarchische Organisation des Chromatins Chromatin ist in drei verschiedene Ebenen organisiert, wobei Histon H1 entscheidend an der Entstehung und Aufrecherhaltung höherer Chromatinstrukturen beteiligt ist. Das Nukleosom stellt den kleinsten strukturellen Baustein des Chromatins und gleichzeitig die erste Kompaktierungsstufe dar. Ein Nukleosom besteht aus einem Histonoktamer, um das 146 bp DNA in 1,75 linksgängigen Windungen gewunden sind. Histone sind kleine basische Proteine auf die in Kapitel eingegangen wird. Durch die Bindung eines Histons H1-Moleküles an die Ein- und Austrittsstelle des Nukleosoms wird dieses zum Chromatosom vervollständigt. Hier sind nun 168 bp DNA in zwei vollen Windungen zu finden (Thoma et al., 1979; Thoma, 1988). Das Histonoktamer besteht aus je zwei H2A/H2B Dimeren und einem H3/H4 Tetramer, die zusammen die Core -Histone bilden. Im Nukleosem wird je ein H3/H4-Tetramer beidseitig von einem H2A/H2B-Dimer flankiert. Verbunden werden die einzelnen Nukleosomen durch die Linker -DNA, einem kurzen Stück DNA, die je nach Organismus und Zelltyp zwischen 0 und 120 bp variieren kann (Richmond, 1984; Luger et al., 1997).

14 Einleitung 14 Abbildung 1-3 Das Nukleosom A. Modell des Chromatosoms, bestehend aus dem Histonoktamer-Kern und zwei vollen Windungen der DNA (168 bp), die von einem Molekül H1 an der Ein- und Austrittstelle stabilisiert werden (aus Knippers, 6 Auflage, Thieme Verlag). B. Darstellung der 4 core -Histone, Struktur, Faltung und Interaktionen sind vereinfacht dargestellt. DNA wird durch einen weißen Schlauch symbolisiert. (a) Core -Histon Oktamer; (b) Nukleosomen Core Partikel in der Seitenansicht, mit 1.75 DNA-Windungen um das Oktamer; (c) Nukleosomen Core Partikel, Ansicht um 90 gedreht; (d) Lage der flexiblen N-terminalen Domönen der Core -Histone, Ansicht wie in (b); (e) Aufsicht auf die Struktur (aus (Smith, 1991). Die nukleosomale Verpackung der DNA wird als 10 nm -Faser oder auch als Perlenkettenstruktur ( beads on a string ) bezeichnet und führt zu einer Kompaktierung um den Faktor 6-7, im Vergleich zu proteinfreier DNA. Mit Bindung von Histon H1 an die Ein- und Austrittstelle des Nukleosoms, bildet sich die sogenannte 30 nm -Faser aus, bei der sich 6-8 Nukleosomen aufspiralisieren. Histon H1 befindet sich bei diesem sogenannten Solenoidmodell im Inneren der Helix. Diese zweite Kondensationsstufe führt zu einer Kompaktierung um den Faktor 40. Eine weitere Kompaktierung um den Faktor wird durch die Anheftung der 30 nm-faser über SAR/MAR-

15 Einleitung 15 Bereiche an die Kernmatrix vermittelt (Wolffe, 1998). Dabei entstehen die in Abbildung 1-2 beschriebenen Schleifen. Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin Organisation von Nukleosomen in Chromatin. Die core -Histone bilden zusammen mit 146 bp DNA das Nukleosom. Es ensteht eine Perlenkettenstruktur ( 10 nm -Faser), die durch die Bindung von H1 und unter bestimmten Salzbedingungen zu der 30 nm -Faser kondensiert (Solenoid-Struktur), wobei H1 immer zur zentralen Helix hin gerichtet ist. Die 30nm Faser spiralisiert sich weiter auf, bildet Schleifen die über die Kernmatrix angeheftet werden können. Rechts, Metaphase-Chromosom. (aus Schiessel, ) Histone Die Histone, kleine basische Proteine, bilden den Proteinbestandteil des Nukleosoms. Sie liegen im Massenverhältnis 1:1 zur DNA vor und sind die evolutionär am höchsten konservierten Proteine. Histone bestehen aus zwei Proteindomänen, einer globulären und ein- bis zwei flexiblen N- oder C- terminalen Armen (Abbildung 1-5). Die Histone H3 (135 aa, 15 kda) und H4 (102 aa, 11,2 kda) sind am höchsten konserviert. Sie unterscheiden sich an nur vier bzw. zwei Stellen zwischen Tierund Pflanzenzellen. Beide weisen einen hohen Anteil an Arginin auf (13 bzw. 14 %). H2A (129 aa, 13.9 kda) und H2B (125 aa, 13.7 kda) sind weniger stark konserviert und haben einen höheren Anteil an Lysin (11 bzw. 16 %). H1, das Linker" Histon, ist das größte ( aa, 22.5 kda) und zugleich am wenigsten konservierte Histon. Es hat einen sehr hohen Anteil an Lysin (29%).

16 Einleitung 16 Im C-terminalen Bereich der Core -Histone liegt die Histone-fold -Domäne, die maßgeblich an den Wechselwirkungen der Histone untereinander, sowie an der DNA-Bindung beteiligt ist. Diese Domäne besteht aus einer zentral gelegenen großen α-helix, an die beidseitig jeweils eine kleinere α-helix angeschlossen ist. Hierbei dient die große α-helix als Dimerisierungsdomäne, mit deren Hilfe H3 mit H4 sowie H2A mit H2B Heterodimere ausbilden können. Die Kontakte der Histone mit der DNA erfolgt über Argininreste, die eine elektrostatische Wechselwirkung mit dem Phosphatrückgrat der DNA-Doppelhelix eingehen (Pruss et al., 1995; Luger et al., 1997) Die N- und C-terminalen flexiblen Arme der Histone sind an der Ausbildung von höheren Chromatinstrukturen durch Wechselwirkungen mit benachbarten Nukleosomen beteiligt (Luger et al., 1997). Darüber hinaus sind sie Angriffspunkte für posttranslationale Modifikationen, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Abbildung 1-5 Die Core -Histone Schematische Darstellung der Core -Histone und des Linker -Histons H1. Alle Histone bestehen aus einer zentralen, globulären Domäne und flexiblen Armen mit einem hohen Anteil der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K). N, aminoterminales Ende. (aus Knippers 2001). 1.3 Modifikation der Chromatinstruktur Chromatin ist eine hochdynamische Struktur, die durch mannigfaltige Modifikationen auf veränderte Anforderungen in der Zelle reagieren muss. Die Chromatinstruktur spielt bei allen DNA-abhängigen Prozessen wie Replikation,

17 Einleitung 17 Transkription, Rekombination und Reparatur eine Rolle und greift regulierend in diese Prozesse ein. Neben den regulatorischen DNA-Sequenzen spielt die Veränderung der Chromatinstruktur eine immer bedeutendere Rolle. Mechanismen wie posttranslationale Modifikation der Histone oder Austausch der Core -Histone durch spezialisierte, funktionsspezifische Varianten, Chromatinremodeling, und Chromatinsilencing ermöglichen durch strukturelle und funktionelle Veränderungen eine gerichtete Antwort auf veränderte Situationen in der Zelle Posttranslationale Modifikation der Histone Zu posttranslationalen Veränderungen der Histonarme gehören Phosphorylierung (Serin/Threonin), Acetylierung (Lysine), Ubiquitinierung (Lysin), Sumoilierung (Lysin), ADP-Ribosylierung (Glutaminsäure) und die Methylierung (Lysine, Arginin). Die bisher am besten untersuchte Modifikation ist die reversible Acetylierung/Deacetylierung von bis zu 4 ε-aminogruppen an Lysinresten der N-terminalen Domänen von H3 und H4 (Grunstein, 1997). Jede eingeführte Acetylgruppe neutralisiert eine positive Ladung und schwächt somit die Bindung des Histons an das negativ geladene DNA-Rückgrat ab. Dies führt zu partiellen Auflockerungen im Nukleosom, die eine erleichterte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren an diesen Bereich ermöglichen. Tatsächlich sind die Histone in transkriptionsaktiven Chromatinbereichen hyperacetyliert, wohingegen die Histone in inaktiven Bereichen hypoacetyliert sind (Grunstein, 1997). Die reversible Acetylierung/Deacetylierung wird durch die Enzym- Familien der Histon-Acetyltransferesen (HATs) und durch die Histon- Deacetylasen (HDACs) vermittelt (Marmorstein, 2001; Marmorstein and Roth, 2001). Die Acetylierung der Core -Histone beeinflusst auch die Wechselwirkung des Histons H1 mit dem Chromatin. In hyperacetylierten Bereichen des Genoms ist die H1 Menge deutlich erniedrigt (Ridsdale et al., 1990). Neben der Acetylierung werden die Histone auch an Serinen und Threoninen phosphoryliert (Abbildung 1-6), was funktionelle Konsequenzen in der Mitose, in der Chromosomenkondensation und auf die transkriptionelle Aktivität hat. Beispielsweise wird Histon H1 zellzyklusabhängig phosphoryliert, wobei das Maximum in der Mitose erreicht wird (Roth and Allis, 1992);(Bradbury et al., 1974). Die Phosphorylierung scheint auch eine Rolle bei der Regulation anderer Histon-Modifikationen zu haben. So ist z.b. die Phosphorylierung von S10 des Histons H3 eine Voraussetzung für die Acetylierung von K14. Die Methylierung von Histonen wird von Histon-Methyl-Transferasen (HMTasen) durchgeführt. Histon H3 kann an fünf Lysinen (K4, K9, K27, K36, K79) methyliert werden, wobei bisher nur eine Stelle bei H4 (K20) bekannt ist.

18 Einleitung 18 Methylierte Histone werden sowohl in aktiv transkribierten Genen, wie auch in stillen Regionen gefunden. Zum einen wurde die H3-K4-Methylierung in aktiven Genen, die H3-K9-Methylierung hingegen in inaktiven Genen beobachtet (Übersicht in (Kouzarides, 2002), wobei der Methylierungsstatus eine weitere wichtige Rolle spielt. So konnte gezeigt werden, dass trimethyliertes K4 in H3, in aktiven Genen und dimethyliertes K4 in aktiven und inaktiven Genen zu finden ist (Santos-Rosa et al., 2002). Die Methylierung von Argininen in H3 und H4 ist mit transkriptionsaktiven Bereichen assoziiert und erleichtert die weitere Acetylierung (Zhang and Reinberg, 2001). Ubiquitinierung von Histonen hat einen positiven Effekt auf die Transkription, wohingegen Sumoilierung von H4 eine Rolle bei der transkriptionellen Repression spielt (Shiio and Eisenman, 2003; Zhang, 2003). Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4 Darstellung der posttranslationalen Modifikation von H3 und H4. Dargestellt ist die Aminosäuresequenz der N-terminalen Arme. Acetylierung ist als grünes, Phosphorylierung als weißes und Methylierung als gelbes Symbol dargestellt. (Aus (Strahl and Allis, 2000) Die Histon-Modifikationen verändern also die Wechselwirkung von Histonen und DNA auf elektrostatischer Ebene, wie beispielsweise für die Acetylierung und Phosphorylierung gezeigt werden konnte. Andererseits ist dies nicht zu verallgemeinern, da dieselbe Modifikation (z.b. Methylierung) zum einen mit aktiven und zum anderen mit inaktiven Genen in Zusammenhang gebracht werden konnte. Dies führte zur sogenannten Histon-Code-Hypothese, die besagt, dass sich die Histonmodifikationen nicht ausschließlich auf die Chromatinstruktur auswirken. Vielmehr werden durch die Modifikationen Regulatoren rekrutiert, die ihrerseits die Chromatinstruktur weiter verändern. (Strahl and Allis, 2000; Jenuwein and Allis, 2001). In Abbildung 1.7 sind die bisher bekannten kombinatorischen Modifikation dargestellt und, wenn bekannt, die Proteine/Proteinkomplexe die diese Modifikation spezifisch erkennen, und die dadurch implizierte Funktion (Abbildung 1.7, weitere Übersicht in (Khorasanizadeh, 2004).

19 Einleitung 19 Abbildung 1-7 Die histone-code -Hypothese Dargestellt sind verschiedene gefundene posttranslationale Modifikationen, ihre Funktion und die Rekrutierung von Protein-Komplexen. CENP-A ist eine Zentromer-spezifische H3 Form.(Wolffe, 1995) (aus (Strahl and Allis, 2000) Gesamtheitlich werden alle kombinatorischen Modifikationen der Histone und die dadurch implizierte Funktion als Epigenetik bezeichnet. Hier fließt auch die DNA-Methylierung an CpG-Inseln ein. Methylierung an Histonen und DNA führt auch zu dem sogenannten genomic-imprinting, Modifikationsarten, die von Generation zu Generation weitervererbt werden (Bird et al., 1998) (Lachner and Jenuwein, 2002); (Lachner et al., 2003) Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine Einen weiteren Einfluß auf die Chromatinstruktur stellt die Einlagerung von Nicht-Histon-Proteinen dar. Zur Gruppe der Nicht-Histon-Proteine zählen alle Proteine, die an Chromatin binden, aber nicht zur Klasse der Histone gehören, wie z.b Transkriptionsfaktoren, Polymerasen und Topoisomerasen, deren Mengen vom Zelltyp abhängig sind. Eine Gruppe der Nicht-Histon-Proteine, die in verschiedenen Zelltypen ubiquitär und in konstanten Menge zu finden sind, sind die klassischen High-Mobility- Group-(HMG)-Proteine. Sie erhielten ihren Namen durch ihre hohe gelelektrophoretische Mobilität (10-30 kda). Die Einteilung erfolgt aufgrund ihrer DNA-Bindemotive (Bustin, 2001).

20 Einleitung 20 Die Gruppe der klassischen HMG-Proteine setzen sich aus den HMGBs (alter Name:HMG-1/-2), den HMGAs (alter Name: HMG-I/-Y) und HMGNs (alter Name: HMG-14/-17) zusammen (siehe Abbildung 1-8). Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine Die Familie der klassischen HMG-Proteine und die HMG-Motiv-Proteine mit neuer und alter Nomenklatur. Das funktionelle Motiv, das die Klassenzugehörigkeit bestimmt, ist angegeben HMGB (HMG-1/-2) Die HMG-1-Domäne (HMG-Box) ist das funktionelle Motiv der größten Unterfamilie der HMG-Proteine. HMGB-Proteine weisen zwei unabhängige HMG-1-Domänen (HMG1 A und B Box) auf, die für die sequenzunspezifische DNA-Bindung verantwortlich sind. Eine saure Domäne im C-terminalen Bereich vermittelt Proteininteraktionen und modelliert die DNA-Bindung. Die HMG-1- Domäne besteht aus etwa 80 Aminosäuren, die eine gedrehte L-förmige, homolog gefaltete Domäne aus drei α-helices bildet. Die Konservierung der HMG-1-Domänen beruht eher auf dieser Struktur als auf der Aminosäuresequenz. Die DNA-Bindung erfolgt ausschließlich an der kleinen Rinne der DNA durch interkalierende, hydrophobe Aminosäuren. Dies führt zu einer teilweisen Entwindung der DNA und dadurch zu einer Erweiterung der kleinen Rinne. Die HMGB-Proteine binden mit einer geringen Spezifität an B-

21 Einleitung 21 Form DNA, haben allerdings eine hohe Affinität für ungewöhnliche DNA- Formen, wie kreuzförmige, gebogene und supergecoilte DNA. Die Bindung an relaxierte Plasmid-DNA führt in vitro zu einer Einführung von Supercoils. HMGB-Proteine können durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden, führen in diesen Bereichen zu DNA-Strukturveränderungen, die eine Transkriptionserleichterung darstellen, und verlassen dann diese Stelle wieder. Deshalb werden die HMGB-Proteine als Architektur-Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-Chaperone bezeichnet. Durch ihre hohe Mobilität im Zellkern werden sie auch an architekt for hire bezeichnet. Interaktionen, sowohl mit Proteinen als auch mit DNA, sind immer transient und von sehr kurzer Dauer. HMGB spielen so wie die HMGAs eine Rolle in der Enhancosome Ausbildung, jedoch sind bis jetzt nur einige B-Enhancosomen bekannt, was durch die transiente Bindung erklärt werden könnte. (entnommen aus (Agresti and Bianchi, 2003). Für die V(D)J-Rekombination konnte in vivo gezeigt werden, dass die HMGvermittelte DNA-Biegung eine Erleichterung darstellt (Aidinis et al., 1999). In vitro konnte für HMGB1 nachgewiesen werden, dass durch die DNA-biegende Eigenschaft das Nukleosomen-Sliding durch ACF/CHRAC erleichtert wird (Bonaldi et al., 2002) HMGA (HMGY/I) Die humanen HMGA-Proteine bestehen aus vier Mitgliedern, HMGA1a, HMGA1b HMGA1c und HMGA2, und zeichnen sich durch die Anwesenheit von drei identischen, jedoch unabhängigen DNA-bindenden AT-Hooks und einem sauren C-terminalen Bereich aus. Das positiv geladene AT-Hook-Motiv besteht aus neun Aminosäuren, wobei die Aminosäuren Prolin-Arginin-Glycin-Arginin- Prolin die Kernsequenz bilden, die von einer bestimmten Anzahl an Lysinen und Argininen umringt wird, was wiederum einen Einfluss auf die Bindung ausübt (Reeves and Nissen, 1990; Aravind and Landsman, 1998). Die Kernsequenz ist in allen AT-Hook-Proteinen evolutionär hoch konserviert. Eine Bindung mit dem AT-Hook erfolgt an der kleinen Rinne der DNA und führt zu Strukturveränderungen des gebundenen Bereiches. Die bevorzugte Bindung erfolgt an AT-reiche DNA-Sequenzen (AA(T/A)T). Wie die HMGBs auch, binden die HMGAs bevorzugt an ungewöhnliche DNA-Formen, wie kruziform, supergecoilte, gebogene und nukleosomale DNA-Formen. Durch eine Bindung von HMGA-Proteinen werden die DNA-Bereiche je nach Ausgangssituation gebogen, begradigt, aufgewunden oder Schleifen ausgebildet. In vitro können HMGAs, wie die HMGBs, auch Supercoils in relaxierte Plasmid-DNA einführen. Strukturveränderungen durch HMGAs sind ATP-unabhängig und erfolgen im Gegensatz zu den HMGBs nicht durch Interkalation. Es wird vermutet, dass die Veränderung durch das gleichzeitige Binden der drei AT-Hooks hervorgerufen wird. HMGA-Proteine sind an der Formierung von sogenannten

22 Einleitung 22 Enhancosomen beteiligt und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Expression von Genen. Sie können verschiedene Funktionen in diesen Enhancosomen ausüben, die teilweise durch Protein-Protein-Interaktion, aber hauptsächlich durch HMGA-DNA Interaktion, die zu einer DNA-Biegung führt, vermittelt werden. Das am besten untersuchte Beispiel ist der IFN- (Interferon)β-Promotor, wobei viele weitere Enhancosomen bekannt sind (Übersicht in (Reeves and Beckerbauer, 2001). Durch die Beteiligung der HMGA-Proteine an der Transkriptionskontrolle, der Chromatinarchitektur, der DNA-Strukturveränderung und vielen anderen Prozessen, sind die HMGA-Proteine hoch-multifunktionelle Proteine in der Zelle HMGN (HMG14 / -17) Die dritte HMG-Familie sind die HMGNs. Sie binden über die Nukleosomen- Bindungsdomäne (NBD) an Chromatin. Die NBD erstreckt sich über etwa 30 Aminosäuren und ist zweigeteilt. Der N-terminale Bereich ist hoch konserviert und an Argininen angereichert, wobei der C-terminale Teil reich an Prolinen und Lysinen ist. Mit dieser Domäne erkennen die HMGN-Proteine die Struktur des Nukleosomenkerns (146 bp). Die HMGN-Familie besteht aus HMGN1 und HMGN2. Beide stimulieren die Transkription und die Replikation von Chromatin, doch nicht von proteinfreier DNA. Dies wird durch eine Dekompaktierung der Chromatinstruktur erreicht, wobei der Mechanismus noch nicht genau verstanden ist. Es konnte gezeigt werden, dass der C-terminale, saure Bereich von HMGN mit den N-terminalen Armen von H3 interagieren kann und dass diese Interaktion essenziell ist, da an trypsiniertes H3 die Bindung von HMGN sehr schwach ist. Interessant ist auch, dass die HMGN-Proteine offensichtlich wie H1 an die Ein- und Austrittstelle der DNA im Nukleosom binden und dadurch mit H1 um die Bindestelle konkurrieren. Eine Stimulation von Transkription und Rekombination könnte dann damit erklärt werden, dass HMGN H1, das inhibitorisch wirkt, vom Nukleosom verdrängt und die Wechselwirkung zwischen Histonoktamer und DNA auflockert. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass HMGN-Proteine in aktiv proliferierenden Zellen durch den ganzen Zellkern in vielen Foci lokalisiert sind, sich aber in transkriptionsinaktiven Zellen in dem interchromosomalen Bereich befinden (Bustin, 1999). Neben den klassischen HMGs gibt es die sogenannten HMG-Motiv-Proteine die eine strukturelle Eigenschaft, wie HMG-Box, Nukleosomen-Bindemotiv oder AT- Hook aufweisen (siehe Abbildung 1-8). Bei den HMG-Motiv Proteinen handelt es sich um verschiedenste Proteine, die neben einem oder mehreren HMG- Motiven auch andere Motive besitzen. Diese Proteine kommen teilweise Zelltyp-spezifisch vor und sind nicht so verbreitet wie die klasischen HMG-

23 Einleitung 23 Proteine. Meist binden sie sequenzspezifisch an DNA oder dienen der Expression einer definierten Subklasse von Genen Chromatinremodeling Der Mechanismus des Chromatinremodelings stellt eine dritte Möglichkeit dar, die Chromatinstruktur zu verändern. Bei diesem Mechanismus wird die Chromatinstruktur ATP-abhängig von sogenannten Chromatinremodelingkomplexen verändert. Dabei handelt es sich um Multiproteinkomplexe (0,5 2 MDa), deren gemeinsames Merkmal eine ATPase-Untereinheit ist. Nach diesen ATPasen werden die Chromatinremodelingkomplexe in vier Familien unterteilt: Swi2, ISWI, MI-2 (CHD) und INO80 Familie (Shen et al., 2000; Varga-Weisz, 2001). Die ATPasen besitzen neben der ATP-Domäne noch weitere funktionelle Domänen. So besitzt die Swi2-ATPase eine zusätzliche Bromodomäne, die acetylierte Histone erkennt. Die Mi-2-ATPasen dagegen haben eine Chromodomäne, die an methylierte Histone bindet (Berger, 2002);(Varga-Weisz, 2001). Neben der ATPase-Untereinheit, setzen sich die verschiedenen Remodelingkomplexe aus unterschiedlichen akzessorischen Untereinheiten zusammen. ACF, der kleinste Komplex, besitzt neben der ATPase ISWI nur noch eine Untereinheit, Acf1. SWI/SNF hat mehrere zusätzliche Untereinheiten. Es wird vermutet, dass die unterschiedliche Zusammensetzung der Remodelingkomplexe deren Funktion und deren Aktionsort beeinflusst. Die Mechanismen der Remodelingkomplexe sind in vitro gut charaktersiert. So sind sie in der Lage, Histon-Oktamere auf kurzen DNA-Fragmenten zu verschieben. So könnten Regulatorelemente auf der DNA nukleosomenfrei gemacht werden. Von den ISWI-Komplexen ist bekannt, dass sie für eine regelmäßige Anordnung von Nukleosomen auf längeren DNA-Fragmenten verantwortlich sind ( Nukloesomen-Spacing ). Dies kommt wahrscheinlich auch durch die oben beschriebene Sliding -Aktivität zustande (Vignali et al., 2000). Im Gegensatz zu den in vitro Daten ist über die in vivo Funktion nur wenig bekannt. Für ACF konnte eine Beteiligung bei der Replikation in heterochromatischen Bereichen in der späten S-Phase gezeigt werden (Collins et al., 2002). Chromatinremodelingkomlexe sind aber nicht nur in die Genaktivierung, sondern auch in dem Verschließen oder Silencen von Chromatin beteiligt. Hier wäre z.b der NURD-Komplex zu nennen. Neben der MI-2 ATPAse und anderen Untereinheiten, hat dieser Komplex eine HDAC-Untereinheit, die Histone deacetylieren kann und dadurch zu einer unzugänglicheren Chromatinstruktur führt (Xue et al., 1998). In Microarray-Studien wurde gezeigt, dass etwa 5 % der Gene in Hefe durch die ATPase-Aktivität des SWI/SNF-Komplexes stimuliert, aber auch reprimiert werden können (Sudarsanam and Winston, 2000).

24 Einleitung 24 Aus diesen wenigen genannten Beispielen wird deutlich, dass die Regulation der Genexpression auf epigenetischer Ebene weit komplexer ist als bisher vermutet wurde. 1.4 Das DEK-Protein Entdeckung Das DEK-CAN Onkogen wurde 1992 bei Patienten mit einer Subform der akuten myeloiden Leukämie entdeckt (AML). Dieses Fusionsprodukt entsteht durch eine Chromosomentranslokation des 3`-Bereiches des CAN-Gens auf Chromosom 9, auf den 5`-Bereich des DEK-Gens auf Chromosom 6, die sich im Leseraster befindet. Durch diese Translokation t(6;9)(p23;q34) entsteht ein Fusionsprotein aus 350 Aminosäuren (1-350) von DEK und 1278 Aminosäuren des C-Terminus von CAN, das ein Molekulargewicht von 165 kda hat (von Lindern et al., 1990), (von Lindern et al., 1992). Bei CAN (Nup214) handelt es sich um eine Komponente des Kernporenkomplexes, daher ist es strikt in der Kernmembran lokalisiert, wohingegen das Fusionprotein DEK-CAN im Zellkern zu finden ist (Fornerod et al., 1995), (Hamaguchi et al., 1998) (Boer et al., 1998). Bei den AML-Patienten mit der DEK-CAN-Fusion bleibt je ein Allel unbeeinflusst und es werden höhere Mengen an DEK-Transkript im Vergleich zu dem DEK-CAN-Transkript beobachtet. Die Präsenz des Fusionsproteins DEK-CAN ist oft die einzige karyotypische Abnormalität bei diesen Patienten, deshalb wurde hier die transformierende Aktivität vermutet und DEK selbst als Protoonkogen eingestuft. Weitere Studien zeigten jedoch, dass die Translokation t(6;9) in AML sehr selten vorkommt. Thiede et al. konnten unter 979 AML-Patienten nur zehn mit dieser Translokation finden. Jedoch wiesen 90% der DEK-CAN-Patienten eine Mutation in der FLT3-Kinase (FMS-Tyrosin- Kinase) auf, wohingegen dies in nur 20 % der anderen untersuchten AML- Patienten zu finden war (Thiede et al., 2002). Die Mutation führt zu einer konstitutiv erhöhten Kinaseaktivität. Die FLT3-Kinase ist in der cytoplasmatischen Membran lokalisiert und dient als Rezeptor für verschiedene Wachstumssignale. Sie ist daher in verschiedene Signaltransduktionswege involviert und scheint bei der Aufrechterhaltung der Proliferation und bei der Entgegenwirkung der Differenzierung in diesen leukämischen Zellen eine wichtige Rolle zu spielen (Libura et al., 2003). Eine Überexpresion von DEK- CAN in U937 myeloiden Vorläuferzellen konnte die Ausdifferenzierung dieser Zellen nicht verhindern (Boer et al., 1998). Die Expression von DEK-CAN in transgenen Mäusen führte nicht zur Ausbildung einer Leukämie (Grosveld, 2002). Daher scheint eher die Mutation in der FLT3-Kinase und nicht die Präsenz von DEK-CAN zu einer Transformation zu führen, wobei man nicht ausschließen kann, dass DEK-CAN in bestimmten Transformationsstadien eine Rolle spielt. Es bleibt daher fraglich, ob DEK wirklich ein Protoonkogen ist.

25 Einleitung Eigenschaften DEK ist ein sehr häufiges Kernprotein ( Kopien/Zelle), das in allen höheren Eukaryoten gefunden wird (Pflanzen, Pilze, Tiere), aber nicht in Hefe vorkommt. Die DEK-Proteine unterschiedlicher Spezies weisen homologe Bereiche auf, die in den unterschiedlichen Spezies in der Länge variieren (Abbildung 1-9). Humanes DEK hat ein Molekulargewicht von 43 kda und enthält 375 Aminosäuren. Dahingegen ist DEK aus D. melanogaster 612 Aminosäuren lang, aus X.laevis nur 300 Aminosäuren lang. DEK-Proteine der verschiedenen Organismen weisen alle eine SAF- oder SAP-Box auf (Aravind and Koonin, 2000; Kipp et al., 2000). Diese konservierte, 35 Aminosäuren lange DNA-Bindedomäne erstreckt sich bei menschlichem DEK von Aminosäure 149 bis 187 (Abbildung 1-9). Des Weiteren findet man eine Kernlokalisationssequenz ( ) und vier saure Bereiche, die sich jeweils von Aminosäure 30-49, , und erstrecken. Durch Yeast-Two-Hybrid-Analysen und Far-Western-Studien konnte eine Multimerisierungsdomäne, die sich von Aminosäure erstreckt, identifiziert werden (Kappes et al., 2004; Scholten, 2004). Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins Das menschliche DEK-Gen ist auf Chromosom 6 (6;p23) lokalisiert und enthält 11 Exons. Der DEK-Promotor weist die Eigenschaften eines Haushaltsgens auf (CCAATT-Box, unmethylierte CpG-Inseln, keine TATA-Box) und wird potenziell über die Faktoren NF-Y und YY1 reguliert (Sitwala et al., 2002). Die DEK- Expression ist in allen untersuchten Geweben sehr stark und in vielen Krebsarten wird DEK überexprimiert, wohingegen die DEK-Expression in ausdifferenzierten Zellen eher schwach ist (Boer et al., 1998; Kondoh et al., 1999; Kroes et al., 2000; Makita et al., 2002; Savli et al., 2002; Sanchez- Carbayo et al., 2003; Daibata et al., 2004; Evans et al., 2004). Bisher sind keine

26 Einleitung 26 Spleissvarianten und regulatorische Elemente, die die Stabilität oder die Translationseffizienz der DEK-mRNA beeinflussen könnten, bekannt. DEK wurde in vielen humanen Autoimmunkrankheiten als Antigen gefunden. In einer Untersuchung von Dong et al. (2000) wurden DEK-Antikörper in juveniler rheumatoider Arthritis (JRA, 40 % der Patienten), im systemischen Lupus erythematodes (SLE, 25% der Patienten), in der Sytemsklerose und in weiteren Autoimmunkrankeiten gefunden. Die Produktion von DEK-Antikörpern scheint auf eine erhöhte Anwesenheit von IFNγ (Interferon) zurückzuführen zu sein (Dong et al., 2000) Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten DEK ist ausschließlich im Nukleus lokalisiert. Durch Zellfraktionierungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Hauptfraktion von DEK mit 250 mm NaCl aus isolierten Kernen extrahieren lässt. DEK weist damit ein Verhalten auf, wie es für andere Chromatinproteine beschrieben ist (z.b (Ritzi et al., 1998). Sedimentationsanalysen von freigesetzten Chromatinfragmenten zeigten tatsächlich, dass DEK in vivo Zellzyklus-unabhängig mit Chromatin assoziiert ist (Kappes et al., 2001). DEK ist sowohl mit Metaphase-Chromosomen und mit mitotischem Chromatin assoziiert (Fornerod et al., 1995; Kappes et al., 2001; Krithivas et al., 2002; Scholten, 2004). Die DEK-Protein-Menge ändert sich im Zellzyklus nicht. Eine Assoziation mit hetero- und euchromatischen Bereichen konnte gezeigt werden, jedoch wurde eine fünffache Anreicherung in Euchromatin gefunden (Kappes et al., 2001). Mit zwei verschiedenen Methoden der Kernmatrix-Präparation konnte eine Assoziation von DEK mit dieser Struktur nachgewiesen werden (Kappes, 2000). DEK ist, wie viele andere Chromatin-assozierte Kernproteine, hoch mobil, unterliegt folglich einer schnellen Dissoziation und Wiederbindung an Chromatin. Dies wurde durch FRAP-(flueorescence recovery after photobleaching) Analysen von transient exprimierten GFP-(green fluorescent protein) DEK gezeigt (Scholten, 2004). Es wurden aber auch DEK-Populationen gefunden, die über Minuten hinweg einen stabilen Komplex ausbilden. Eine kleinere Population von DEK ist in vivo mit RNA assoziiert (Kappes et al., 2001). Einige Gruppen konnten eine Interaktion von DEK mit dem EJC-(exon-exonjunction) Komplex nachweisen (Le Hir et al., 2000; Le Hir et al., 2001) (McGarvey et al., 2000). Es stellte sich allerdings heraus, dass die gefundene Interaktion auf einer Kreuzreaktion des verwendeten Antikörpers beruhte (Reichert et al., 2002). Weitere Studien in unserem Labor bestätigten die Kreuzreaktion (Scholten, 2004).

27 Einleitung Topologieveränderung und DNA-Bindung Alexiadis et al. (2000) zeigten, dass natives, über konventionelle Säulenchromatographie gereinigtes DEK in Anwesenheit von Topoisomerase I die superhelikale Dichte von SV40-Minichromosomen verändert. Diese Topologieveränderung wurde zuerst nur an Chromatin-Substraten beobachtet (Alexiadis et al., 2000). In weiteren Arbeiten von Waldmann et al. konnte diese Topologieveränderung auch an proteinfreier DNA beobachtet werden (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass DEK fixierte, positive Supercoils in proteinfreie DNA einführt und zu einer Reduktion von negativen Supercoils in SV40 Minichromosomen führt. Der Mechanismus der Topologieveränderung ist bisher noch nicht genau verstanden, ein Nukleosomenverlust konnte jedoch ausgeschlossen werden (Alexiadis et al., 2000). In elektronenmikroskopischen Studien konnte auch ein Wrapping-Machanismus ausgeschlossen werden, wie für die Histone gezeigt. Jedoch wurde eine leichte Längenzunahme beobachtet. Durch die Präsenz von interkalierenden Aminosäuren (Phenylalanine) inmitten der potenziellen DNA- Bindedomäne SAF-Box, kann die Interkalation von DEK nicht ausgeschossen werden. Alle bisher beschriebenen Arbeiten identifizierten DEK als sequenzunspezifisches DNA-Bindeprotein. Die Gruppe von Markovitz allerdings beschrieben eine Sequenzspezifität von DEK für eine Sequenz aus dem HIV-2 Promotor (pets-site) und für eine Sequenz aus MHC-II Genen (Fu et al., 1997; Faulkner et al., 2001; Adams et al., 2003). In identischen Experimenten von Waldmann et al. konnte diese sequenzspezifische Bindung von DEK an die pets-site nicht gezeigt werden (Waldmann et al., 2003). Vielmehr wurde gefunden, dass DEK strukturspezifisch an supergecoilte und kruziforme DNA bindet (Waldmann et al., 2003). Diese Eigenschaft verbindet DEK mit Architekturproteinen. Die Bindung von DEK an Chromatinsubstrate in vitro führt zu einer drastischen Kompaktierung und dadurch zu einer verminderten Zugänglichkeit für Restriktionsenzyme, Mikrokokken-Nuklease und Replikationsproteine (Alexiadis et al., 2000), (Waldmann et al., 2003). Alexiadis et al. wiesen eine Assoziation von DEK mit SV40 Chromatin in vitro nach und konnten in Far-Western-Studien zeigen, dass DEK mit den Histonen H2A und H2B in vitro interagiert (Alexiadis et al., 2000). Allerdings konnte in weiteren Experimenten keine Interaktion von DEK mit rekombinanten Histonen gezeigt werden (Scholten, 2004). Wird DEK zusammen mit proteinfreier DNA inkubiert und im Elektronenmikroskop analysiert, findet man zum einen intermolekulare Wechselwirkungen zwischen DEK und DNA, die zu Schleifenbildungen führen und zum anderen kann man erkennen, dass DEK in einer geordneten Art und