Aus der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum

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1 Aus der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum Vergleichende Untersuchung zur Effektivität eines Kombinationsimpfstoffes gegen Haemophilus parasuis und Mycoplasma hyopneumoniae und eines monovalenten Impfstoffes gegen Mycoplasma hyopneumoniae bei Schweinen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Claudia Meistermann aus Bakum Hannover 2006

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Th. Blaha 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Th. Blaha 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K.-H. Waldmann Tag der mündlichen Prüfung: 11. Juli 2006 Diese Arbeit wurde durch Mittel der Firma Fort Dodge, Würselen gefördert. Für die Unterstützung dieses Versuchsvorhabens möchte ich mich bedanken.

3 für Johanna und Henrike

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literaturübersicht Haemophilus parasuis Allgemeine Eigenschaften Ätiologie und Pathogenese Allgemeine Einordnung Morphologie Wachstumsbedingungen Biochemische Eigenschaften Virulenzfaktoren Epidemiologie Klinische Symptomatik Pathologie Diagnostik Differentialdiagnosen Immunität Immunantwort Prophylaxe durch Impfung Bekämpfung Erregerkontrolle / Erregereradikation Medikamentelle Therapie Ko-Infektionen mit anderen Erregern des Schweines Mycoplasma hyopneumoniae Ätiologie und Pathogenese Epidemiologie Klinische Symptomatik Pathologie Diagnostik Immunität... 51

6 Immunantwort Prophylaxe durch Impfung Bekämpfung Erregerkontrolle Medikamentelle Therapie Erregereradikation Material und Methoden Beschreibung des Versuchbetriebes Infektionsstatus des Versuchsbetriebes Vakzinen Versuchsvakzine Kontrollvakzine Versuchsgruppen Datenerfassung und auswertung Serologie Untersuchung auf Antikörper gegen H. parasuis Serovar 4 und Untersuchung auf Antikörper gegen M. hyopneumoniae Durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme Futterverwertung Durchschnittliche Mastdauer Mortalität Therapeutische Maßnahmen / Tierbehandlungsindex (TBI) Beurteilung von Lungen nach der Schlachtung / Lungenscore AutoFOM-Daten Statistische Methoden Ergebnisse Allgemeines Serologie Durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme Futterverwertung Durchschnittliche Mastdauer Mortalität... 77

7 4.7 Therapeutische Maßnahmen / Tierbehandlungsindex (TBI) Lungenscore AutoFOM-Werte Diskussion Allgemeines Serologie Mastleistung Mortalität Therapeutische Maßnahmen / Tierbehandlungsindex (TBI) Lungenscore / AutoFOM-Werte Schlussfolgerung Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang...129

8 Verzeichnis der Abkürzungen A. Actinobacillus Abb. Abbildung AGPT Agargelpräzipitationstest AK Antikörper B. Bordetella BALF Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit ca. circa DCE DNA Cell Equivalence DNA Desoxyribonukleotid Acid E. Escherichia ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay EP Enzootische Pneumonie H. Haemophilus IFT Immunfluoreszenztest IHA Indirekte Haemagglutination ISTME Infektiöse septikämische thrombotisierende Meningo-Enzephalitis Kda Kilodalton kg Kilogramm km Kilometer KMZ Körpermassezuwachs LPS Lipopolysaccharide LT Lebenstag LW Lebenswoche M. Mycoplasma MHDCE Mycoplasma Hyopneumoniae DNA Cell Equivalence mg Milligramm mm Millimeter m Mikrometer NAD Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid NADP Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat nm Nanometer OD Optische Dichte OMP Oberflächenmembranproteine P. Pasteurella PCR Polymerase Chain Reaction p.i. post infectionem PHV-1 Porcines Herpesvirus 1 PRCV Porcines Respiratorische Coronavirus PRRS Porcine Reproduction and Respiratory Syndrome Virus S. Streptococcus s.o. siehe oben

9 SEW segregated early weaning SPF spezifiziert-pathogen-frei St. Staphylococcus Tab. Tabelle TBI Tierbehandlungsindex u. und u. a. unter anderem z.b. zum Beispiel

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11 Einleitung 11 1 Einleitung In der modernen Schweineproduktion haben Erkrankungen des Respirationstraktes neben den Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes immer mehr an Bedeutung gewonnen. Atemwegserkrankungen führen aufgrund von vermindertem Zuwachs, schlechter Futterverwertung, erhöhter Mortalität und hohen Behandlungskosten zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Infektionen mit Haemophilus (H.) parasuis sind in der Schweineproduktion weit verbreitet, wobei nicht nur die typische Polyserositis in Form der Glässerschen Krankheit auftritt, sondern der Erreger zunehmend auch an respiratorischen Erkrankungen beteiligt ist. Es lässt sich zudem seit einigen Jahren eine weltweite Zunahme der Glässerschen Krankheit beobachten (LOPEZ et al. 2004; MÜLLER et al. 2004; OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Die Gründe hierfür scheinen die intensiven Haltungsbedingungen, das Zusammenbringen von Aufzuchtferkeln und Mastschweinen aus verschiedenen Herkünften und ein frühes Absetzen der Ferkel zu sein. Die Glässersche Krankheit kann in allen Betriebsarten auftreten, wobei Bestände mit hohem Gesundheitsstatus (High-health- oder SPF-Betriebe) oftmals stärker betroffen sind (RAPP-GABRIELSON 1999; VOS 2004). Faktorenerkrankungen bzw. Krankheitsgeschehen eines gesamten Bestandes stehen immer mehr im Vordergrund. Beim diagnostischen Vorgehen werden demzufolge auch häufig mehrere Erreger gefunden, und es ist bedeutsam, Ergebnisse richtig einzuschätzen und pathogene Erreger herauszufinden. Vor allem bei Erkrankungen des Respirationstraktes scheinen Ko-Infektionen mit anderen Erregern häufig zu Problemen zu führen. Im Rahmen der Bekämpfung von Infektionskrankheiten bei Schweinen hat die Immunprophylaxe innerhalb der vergangenen Jahre einen erheblichen Stellenwert eingenommen. Die Anwendung von Impfstoffen ist ein erfolgreicher Weg zur Reduzierung der Antibiotikaanwendungen. Eine gesicherte Diagnostik bezüglich beteiligter Erreger und das Wissen um die Epidemiologie des Erregers ist jedoch unabdingbare Voraussetzung für erfolgreiche immunprophylaktische Maßnahmen. Aus ökonomischen und tierschützerischen Gründen kann es sinnvoll sein, zwei Impfungen zu kombinieren, um die Belastung der Ferkel durch eine Vakzination zu minimieren und die Arbeitsbelastung innerhalb eines Betriebes zu reduzieren.

12 12 Einleitung Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Effektivität des Kombinationsimpfstoffes Suvaxyn M.hyo-Parasuis unter Feldbedingungen zu prüfen. Durchgeführt wurde der Versuch im Raum Weser-Ems in einem Sauenbestand mit eigener Ferkelaufzucht und anschließender Mast, in dem der Erreger H. parasuis endemisch vorkommt. Die an der Studie beteiligten Tiere wurden auf zwei Impfgruppen (Kombinationsimpfung gegen H. parasuis und M. hyopneumoniae und Monoimpfung gegen M. hyopneumoniae) aufgeteilt. Die Effektivität der Impfung wurde aus den Produktionsparametern während der Ferkelaufzucht und der Mast und dem Vorkommen von Lungenveränderungen zum Zeitpunkt der Schlachtung abgeleitet. Die humorale Reaktion auf die Impfung wurde anhand einer serologischen Verlaufsuntersuchung verfolgt.

13 Literatur 13 2 Literaturübersicht 2.1 Haemophilus parasuis Allgemeine Eigenschaften Haemophilus (H.) parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit. Unter der Glässerschen Krankheit, auch Glässer`s disease, Transportkrankheit, Glässersyndrom oder porcine polyserositis and arthritis bezeichnet, versteht man eine fieberhafte, durch H. parasuis hervorgerufene Allgemeinerkrankung der Schweine, die klinisch durch Pleuritis, Perikarditis, Peritonitis, Arthritis und Meningitis gekennzeichnet ist. Die Affinität zu den Schleimhäuten und Meningen ist stark ausgeprägt, so dass die Bezeichnung als fibrinöse Serosen- und Gelenksentzündung das typische Krankheitsbild und zugleich die pathologischen Veränderungen charakterisiert. Die Glässersche Krankheit ist eine infektiöse Faktorenkrankheit, deren Auftreten und Verlaufsform entscheidend im Zusammenhang mit der Bestandsgröße, dem Infektionsdruck, den Temperaturschwankungen, dem Umstallungsstress und den spezifischen immunologischen Abwehrreaktionen sowie bestimmten biologischen Eigenschaften des Erregers stehen. Sie tritt in Abhängigkeit vom Wirken dieser Einflussfaktoren sporadisch oder insbesondere in größeren Beständen enzootisch mit einer hohen Morbidität auf. Der Erreger ist nur an das Schwein adaptiert. Die Krankheit ist weltweit verbreitet. Es wird über Fälle in den USA und Kanada (RADOSTITIS et al. 1963; RILEY et al. 1977; SMART 1987), Asien (ABE et al. 1982; MORIKOSHI et al. 1990), Australien (PEET et al. 1983; EAVES et al. 1989; BLACKALL u. PAHOFF 1995) und Europa (HJÄRRE 1957; LITTLE 1970; NIELSEN u. DANIELSEN 1975; KIELSTEIN 1985) berichtet. Die Erkrankung wurde erstmals von GLÄSSER (1910) als fibrinöse Pleuro- Perikardio-Peritonitis beschrieben und von der sogenannten Schweineseuche abgegrenzt. Wahrscheinlich wurde der Erreger das erste Mal von SCHERMER und EHRLICHER 1922 isoliert. HJÄRRE und WRAMBY (1943) identifizierten den Erreger

14 14 Literatur als Haemophilus suis, 1960 wurde er durch LECCE als Haemophilus influenza suis beschrieben. Die Bezeichnung wurde dann in Haemophilus parasuis geändert, da der Erreger im Gegensatz zu H. suis nicht den X-Faktor zum Wachstum benötigt, sondern nur V-Faktor-abhängig ist (BIBERSTEIN u. WHITE 1969; KILIAN 1976). Viele der zuerst als H. suis beschriebenen Isolate erwiesen sich später aufgrund verbesserter Methoden als H.-parasuis-Stämme Ätiologie und Pathogenese Allgemeine Einordnung Die Gattung Haemophilus wird nach BERGEY`s Manual of Determinative Bacteriology (1994) der Familie der Pasteurellaceae, den fakultativ anaeroben, sporenlosen, unbeweglichen, gramnegativen Stäbchen zugeordnet. Die Haemophilen bilden mit den Gattungen Actinobacillus und Pasteurella die sogenannte HAP-Gruppe. Sie sind Schleimhautbesiedler und hinsichtlich ihrer Kultivierungsbedingungen recht anspruchsvolle chemoorganotrophe Erreger. Für die Angehörigen der Gattung Haemophilus ist eine enge Adaptation an die Wirtsspezies charakteristisch. Bakterien dieser Gattung sind durch folgende gemeinsame Kriterien charakterisiert (KILIAN u. BIBERSTEIN 1984): - gramnegatives Färbeverhalten - kokkoid- bis stäbchenförmig mit Neigung zu Pleomorphismus und Filamentbildung, Größe 0,2-0,5 x 0,5-2,5 m - Unbeweglichkeit - aerobes oder fakultativ anaerobes Wachstum - Abhängigkeit von bestimmten Wachstumsfaktoren - Nitratreduktion - Oxidase- und Katalasereaktionen variieren zwischen den Stämmen - Fermentativer Abbau von Kohlenhydraten - Vorkommen als Parasiten auf mukösen Membranen von Mensch und Tier

15 Literatur 15 Eine Übersicht zu den Vertretern der Gattung enthält folgende Tabelle: Tab. 1: Übersicht zu den Haemophilus-Arten Spezies Wirt Vorkommen / Krankheitsbild H. parasuis Schwein Glässersche Krankheit H. paragallinarum Huhn Hühnerschnupfen (Coryza contagiosa) H. paracuniculus Kaninchen isoliert aus Darm, Pathogenität unklar H. haemoglobinophilus Hund Normalflora des unteren Genitaltrakts, Pathogenität unklar H. somnus Rind ISTME, Aborte, Pneumonien H. somnus Schaf Septikämie, Mastitis, Nebenhodenentzündung H. influenzae Mensch Meningitis, respiratorische Infektionen H. ducreyi Mensch Ulcus molle H. aegypticus Mensch Konjunktivitis H. piscium Forelle Ulcerdisease Morphologie Entsprechend den Merkmalen der Gattung Haemophilus handelt es sich bei den vom Schwein isolierten H.-parasuis-Arten um gramnegative, meist kokkoide, unbewegliche Stäbchen mit gelegentlicher Fadenbildung und oftmals ausgeprägter Pleomorphie (GUNNARSON 1980). Die Erscheinung der Pleomorphie verstärkt sich mit dem Alter der Kultur und hängt von der Zusammensetzung des Nährmediums ab. Diese Erscheinung kann demnach nicht als Kriterium für die Identifizierung genommen werden. Die Pleomorphie verstärkt sich mit zunehmendem Alter der Kultur und ist vom Nährmedium abhängig (KILIAN 1976). H. parasuis zeigt eine Neigung zur Dissoziation, schon BAKOS et al. (1952) beschrieben eine R- und eine S-Form. Bei bestimmten Dissoziationsformen kann es

16 16 Literatur zu einer Kapselbildung kommen, die z.b. durch eine Kapselfärbung sichtbar gemacht werden kann. Die Kapselbildung führt zu verschiedenen Kolonieformen (BAKOS 1955): - Bei der M-Form (mukoid) sind die Kolonien groß und schleimig, trüb und konfluierend, und weisen eine glänzende Oberfläche auf. Bakterien in der M- Form besitzen eine vollständige Kapsel. - Die S-Form (smooth) zeichnet sich durch kleine, feine, nicht konfluierende Kolonien aus. Die S1-Form besitzt noch teilweise eine Kapsel, die S2-Form besitzt keine Kapsel mehr. - Kolonien der R-Form (rough) sind groß, mit teilweise gezackten Rändern. Sie besitzen keine Kapsel. Ein Wechsel von der M- in die S-Form, die relativ stabil ist, ist im Gegensatz zum Wechsel von der S- zur R-Form irreversibel. BAKOS (1952) stellte keinen wesentlichen Zusammenhang zwischen Herkunft der Stämme und ihrer Morphologie fest. Im Gegensatz dazu kam MÜNCH (1993) zu dem Schluss, dass Isolate von an Glässerscher Krankheit erkrankten Tieren auf Kochblutagar hauptsächlich kleinere Kolonien ausbilden, hingegen bei Stämmen von Tieren ohne klinische Erscheinungen gehäuft mittelgroße grau-weiße Kolonien entstehen. Es wurde dabei kein Zusammenhang zwischen der Temperatur bei Anzüchtung und der Koloniemorphologie festgestellt Wachstumsbedingungen Hinsichtlich seiner Wachstumsbedingungen gehört H. parasuis zu den anspruchsvollen Mikroorganismen. Charakteristische Merkmale der Gattung Haemophilus sind die spezifischen Wachstumsfaktoren (X und V), die bei einer aeroben Anzüchtung notwendig sind. Diese Eigenschaft dient zugleich der Gattungsbestimmung und der Differenzierung der einzelnen Hämophilusarten. Der X-Faktor ist das Protoporphyrin IX, in einigen

17 Literatur 17 Fällen auch das Eisen enthaltende Protohäm. Die Quellen des X-Faktors, der thermostabil ist, sind Blut und Blutderivate einschließlich Hämin. H. parasuis ist in der Lage Porphyrin aus δ-aminolävulinsäure zu bilden, somit ist es von der exogenen Häminzuführung (X-Faktor) unabhängig (BIBERSTEIN u. WHITE 1969). Einige Haemophilusarten wie z.b. H. influenzae und H. haemoglobinophilus sind nicht zur enzymatischen Umwandlung von δ-aminolävulinsäure befähigt und benötigen eine exogene Zufuhr von Hämin. Der V-Faktor wird als Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) oder als NAD-Phosphat (NADP) beschrieben. Er ist thermolabil, im Hefeextrakt und gering auch im Blut enthalten und für die Oxidationsvorgänge der Zellen notwendig. H. parasuis ist zur Durchführung seiner Oxidoreduktionsprozesse auf exogenes NAD, den V-Faktor, angewiesen. Dieser wird z.b. durch Hitzebehandlung aus den Blutzellen freigesetzt, was in der Routinediagnostik in Form des sogenannten Schokoladenagar zur Anwendung kommt (BAKOS 1955). Auf Grund seines hohen NAD-Gehaltes hat sich hier vor allem Pferdeblut bewährt. Weiterhin nutzt man die NAD-Überproduktion einiger Bakterienarten im sogenannten Ammen- oder Satellitenphänomen. Als Ammenkeime werden benutzt: - Staphylokokken (NICOLET 1981) - E. coli und Mikrokokken (NIELSEN u. DANIELSEN 1975) - Pseudomonaden (SHIFRINE u. BIBERSTEIN 1960) Nach ca. 24 Stunden sind neben der Amme winzige glasige, später gräulich glänzende Kolonien erkennbar. Ihre Ausmaße verkleinern sich mit dem Abstand zur Amme. Selektivmedien zur Unterdrückung von Begleitkeimen können verwendet werden (CRAWFORD et al. 1969). LITTLE (1970) empfiehlt den Zusatz von Bacitracin und Kristallviolett, und NICOLET (1981) verwandte Bacitracin und Cloxacillin. NAD kann aber auch durch Zusetzen von Hefeextrakten zur Verfügung gestellt werden (JORGENSEN et al. 1987). Der Abbau von NAD zu Nicotinamid erfolgt bei H. parasuis über konventionelle Enzyme. Als günstigste Bebrütungstemperatur werden 37 C angesehen. H. parasuis ist mikroaerophil, sein Wachstum wird durch eine CO 2 -Spannung von 5-10 % verbessert.

18 18 Literatur Biochemische Eigenschaften Neben den Wachstumsfaktoren ist eine weitere Differenzierung von H. parasuis durch Untersuchung des Hämolyseverfahrens und des biochemischen Verhaltens möglich. Nach KIELSTEIN (1990) ist H. parasuis eindeutig durch folgende Eigenschaften charakterisiert: V-Faktorenabhängigkeit, fehlende Urease-, Hämolysin- und Indolbildung sowie positive Katalase- und Maltosereaktion; die Kohlenhydrate Arabinose, Lactose und Xylose werden nicht gespalten. In diesen Eigenschaften bestehen keine Unterschiede zwischen Stämmen, die aus verschiedenen Organen oder Tieren mit unterschiedlichem Krankheitsbild isoliert wurden. Es wurde somit kein Zusammenhang zwischen Virulenz und Biochemie festgestellt. Die Hämophilus-Art Taxon C ist im Gegensatz zu allen anderen Hämophilus-Arten schwer zu charakterisieren, da hierfür lediglich der Ausfall der Maltose- und Arabinose-Reaktion herangezogen werden kann. Die Stämme der sogenannten minor group unterscheiden sich von H. parasuis in der Ureasebildung (KILIAN 1976). Diesen Stämmen konnte bisher kein klinisches Bild zugeordnet werden (BRANDRETH u. SMITH 1986; ROSENDAL et al. 1984) Virulenzfaktoren Über Virulenzfaktoren von H. parasuis ist noch wenig bekannt. In der Literatur wird u. a. von der Kapsel, von Fimbrien, den Proteinmustern, wie Oberflächenmembranproteine (OMP), Lipopolysaccharide (LPS) und dem Polypeptidmuster, sowie der Enzymausstattung als Virulenzfaktoren berichtet. Kapsel Viele Bakterien sind von einem extrazellulären Material umgeben, das als Kapsel bezeichnet wird. Diesen Strukturen kommt in erster Linie die Funktion der Adhäsion an inerten und auch lebenden Oberflächen, der Adhäsion von Nährsubstraten, aber auch einer Barrierefunktion zu. Weiterhin dienen Kapseln dem Schutz vor der

19 Literatur 19 Infektion mit Bakteriophagen, vor Phagozytose und anderen Clearancemechanismen. Erste Untersuchungen über das Vorhandensein einer Kapsel bei H. parasuis wurden schon früh von CHANDLER (1939) beschrieben. BAKOS (1955) brachte dies mit den verschiedenen Kolonieformen in Verbindung. Der Kapselnachweis erfolgt neben verschiedenen Färbemethoden (KIELSTEIN et al. 1992), der Präzipitation mit Cetavlon und dem Hitzetest sowie der Iridiszenzmethode (MOROZUMI u. NICOLET 1986) vor allem mit Hilfe des Akriflavintests. Die Vielzahl der genutzten Methoden und deren technische Grenzen bedingen vermutlich die widersprüchlichen Aussagen über den Zusammenhang von Virulenz und Bekapselung. In verschiedenen Studien wird über zwei Arten einer Hämophilusinfektion, die von der Kapselbildung abhängen soll, berichtet. KILIAN (1984) unterscheidet bei H. influenzae zum einen eine akute, pyogene und meist invasive Infektion mit H. influenzae als primär pathogenem Erreger, wobei stets eine Kapsel vorhanden ist; zum anderen eine vorwiegend chronische Infektion, in welcher H. influenzae scheinbar eine sekundäre Rolle spielt. Diese Stämme sind unbekapselt und werden häufig auch bei gesunden Menschen isoliert. LITTLE (1971) beschreibt ebenfalls eine solche Einteilung bei der H.- parasuis-infektion beim Schwein. KIELSTEIN und ROSNER (1992) konnten unbekapselte Stämme aus Schweinen mit Glässerscher Krankheit statistisch gesichert häufiger nachweisen als aus gesunden Schweinen. Sie sehen somit die fehlende Bekapselung als einen Hinweis auf Virulenz von Feldisolaten. Anheftungsfaktoren (Fimbrien) Fimbrien sind fädige Gebilde an der Bakterienoberfläche, die aus Proteinen aufgebaut sind. Fimbrien, häufig auch als Pili oder F-Adhäsine bezeichnet, werden von allen gramnegativen und einigen grampositiven Bakterien gebildet. Eine Voraussetzung für das Entstehen von Infektionen ist die Haftung der Erreger an der Schleimhaut. Diese fimbrienbedingte Adhäsionsfähigkeit wird durch die Testung des Hämagglutinationsvermögens untersucht (GRUND et al. 1990). Die Agglutinationsfähigkeit gegenüber einzelnen Tierspezies ist zwischen den Stämmen sehr unterschiedlich (BAKOS 1955). MÜNCH (1993) beobachtete bei Pneumonie-

20 20 Literatur Isolaten keine Agglutination von Hammelerythrozyten und stellte bei Isolaten aus Fällen von Glässerscher Krankheit selten eine Agglutination von Pferde-, Kälber- und Meerschweinchenerythrozyten fest. Unterschiedliche Hämagglutinationsmuster beschreibt auch SCHROER (1992). Er fand im Gegensatz zu MÜNCH (1993) bei Pulmonal- und Glässer-Stämmen eine hohe Agglutinationsrate gegenüber Meerschweinchenerythrozyten. An frisch isolierten, auf Kochblutagar angezüchteten H.-parasuis-Stämmen konnte SCHROER (1992) durch elektronenmikroskopische Untersuchungen einen dichten Fimbrienrasen feststellen. Dieser ging nach mehrmaliger Subkultivierung verloren. Oberflächenmembranproteine (OMP) Die Zellwand gramnegativer Bakterien ist aus drei Schichten aufgebaut. Sie besteht zum einen aus einer zytoplasmatischen Membran, die die äußere Begrenzung des Zytoplasmas bildet und aktive Transportsysteme, Enzyme der Atmungskette sowie des Zitratzyklus enthält (SCHNAITMAN 1970); zum zweiten aus einer dünnen Peptidoglykanschicht, die zur Aufrechterhaltung der Form und der Stabilität der Zelle dient; und drittens aus der für gramnegative Bakterien typischen äußeren Membran (SELTMANN 1982). Die äußere Membran verleiht der Bakterienoberfläche eine starke Hydrophilie und bietet Schutz vor Phagozytose und Komplementsystem (DONALDSON et al. 1974). Außerdem stellt sie eine Permeabilitätsbarriere für viele Antibiotika dar und ist für Prozesse des Stoffaustausches verantwortlich. Wichtige Bestandteile der äußeren Membran sind die Außenmembranproteine (outer membrane proteins OMP). Auf Grund der Menge ihres Vorkommens unterscheidet man Haupt (major)- und Neben (minor)-proteine. Sie sind für die Ausbildung von Pathogenität und Virulenz von großer Bedeutung. Lipopolysaccharide (LPS) Auch Lipopolysaccharide sind Bestandteil der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien. Die LPS stellen eine Permeabilitätsbarriere gegenüber bestimmten Arzneimitteln, Antibiotika oder Detergenzien dar, schützen die Zelle vor den Abwehrmechanismen des Wirtes, insbesondere der Phagozytose, und können

21 Literatur 21 als Rezeptoren für Phagen dienen. Sie bestehen aus drei Regionen: 1. aus der O- spezifischen Seitenkette, 2. der Kernzone und 3. dem Lipid A. Das Lipid A ist das endotoxische Zentrum der LPS. Es wird bei Tod oder Replikation aus der Bakterienoberfläche freigesetzt und kann dann im Wirt zirkulieren. Die LPS können nach verschiedenen Methoden isoliert werden (WESTPHAL u. JANN 1965). Polypeptidmuster Erste Angaben zum Polypeptidmuster von Hämophilusspezies sind von NEUMANN und HINZ (1977) bekannt. Sie beobachteten sowohl zwischen als auch innerhalb einer Bakterienspezies starke Differenzen im Proteinmuster und hielten es deshalb für eine Speziesidentifizierung für ungeeignet. NICOLET et al. (1980) konnten jedoch in der SDS-PAGE unter standardisierten Bedingungen reproduzierbare, speziesspezifische Polypeptidmustertypen für A. pleuropneumoniae und H. parasuis erstellen. Das Ergebnis wurde durch unterschiedliche Wachstumsbedingungen nicht beeinflusst. Auch ZUCKER (1993) konnte keinen Einfluss auf die Ausprägung des Polypeptidmusters durch Kultivierungszeit, -temperatur und Sauerstoffspannung feststellen. ROSNER und KIELSTEIN (1991) konnten keine eindeutige Beziehung zwischen den Proteinmustern von Ganzzell-Lysaten, dem Serotyp, der Virulenz sowie der Kapselausbildung nachweisen. Enzymausstattung Neuraminidase ist ein potentieller Virulenzfaktor bei anderen Arten der Pasteurellaceae. LICHTENSTEIGER und VIMR (1997) beobachteten eine Produktion von Neuraminidase in über 90 % der Feldisolate. Dieses Enzym kann gemeinsam mit den Enzymen Permease und Aldolase zur Virulenz beitragen, da es Kohlenhydrate der Wirtszellen benötigt. Durch die neuraminidase-bedingte Abnahme von Neuraminsäure kann es zu einer Demaskierung von Rezeptoren, die für die Kolonisation und Invasion der Wirtszelle benötigt werden, kommen. Ebenso kann es mit dem Abwehrsystem des Wirtes interferieren, indem die Viskosität des Schleimes abnimmt (CORFIELD 1990; LICHTENSTEIGER u. VIMR 1997).

22 22 Literatur Epidemiologie Seit einigen Jahren lässt sich weltweit eine deutliche Zunahme der Glässerschen Krankheit beobachten (LOPEZ et al. 2004; MÜLLER et al. 2004; OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Die Gründe hierfür scheinen die intensiven Haltungsbedingungen, das Zusammenbringen von Aufzuchtferkeln und Mastschweinen aus verschiedenen Herkünften sowie ein frühes Absetzen der Ferkel zu sein. Darüber hinaus kommen weitere Erreger, wie das Virus des Porzinen Respiratorischen und Reproduktiven Syndroms (PRRSV) oder das Porzine Circovirus Typ 2 (PCV-2), als Kofaktoren in Betracht (OLIVEIRA et al. 2004; OLIVEIRA u. PIJOAN 2002, 2004). Die Glässersche Krankheit kann in allen Betriebsarten auftreten, wobei Bestände mit hohem Gesundheitsstatus (High-health- oder SPF-Betriebe) oftmals stärker betroffen sind (RAPP-GABRIELSON 1999; VOS 2004). Bei Untersuchungen der verschiedenen Erreger bei Lungenentzündungen in Norddeutschland wurde H. parasuis in einem Drittel (31,3 %) der Fälle aus Lungen isoliert, im Bronchialtupfer konnte H. parasuis in 67,5 % der untersuchten Tiere nachgewiesen werden; in Nasentupfern (54 %) und in bronchioalveolärer Lavage (56,1 %) war der Erreger bei über der Hälfte der untersuchten Tiere zu finden (NIENHOFF 2005). Allerdings kann davon ausgegangen werden, dass nicht alle Tiere auch eine H.-parasuis-Infektion durchgemacht haben, da bei dieser Studie sämtliche zur Sektion anstehenden Tiere eines Untersuchungsinstitutes beprobt wurden. Andere Studien berichten über die Isolation von H. parasuis aus gesunden Schweinen (Kielstein et al. 1994; MØLLER u. KILIAN 1990). Unter experimentellen Bedingungen liegt die Morbidität bei 50 bis 75 % (teilweise über 90 %) und die Mortalität bei etwa 10 % (VOS 2004; WIEGAND et al. 1992). Die Übertragung der Infektion erfolgt aerogen. Nach NICOLET (1981) ist aber auch der indirekte Infektionsweg, z. B. über Schleim, nicht auszuschließen. Krankheitsfördernd sind Transport (daher auch die Bezeichnung Transportkrankheit ), Umstallen, Zusammenbringen von Tieren unterschiedlicher Herkunft, Einstallung von Tieren aus H.-parasuis-negativen Beständen, Fütterungswechsel, schlechtes Stallklima oder allgemeine Stresssituationen. Die Wahrscheinlichkeit,

23 Literatur 23 dass sich Ferkel von Jungsauen sehr früh infizieren, ist größer als bei pluriparen Tieren, da im Kolostrum von Jungsauen häufig geringere Mengen an Antikörpern gebildet werden und sie somit eine schlechtere Immunitätsausbildung haben (DONE 1999). Infektionen mit anderen bakteriellen Erregern, wie Bordetella bronchiseptica, begünstigen die Ansiedlung von H. parasuis in der Lunge (BROCKMEIER 2004). Nach Ansiedlung im Nasen-Rachen-Raum und einer septikämischen Phase verbreitet sich der Erreger im Organismus. Eine besondere Affinität besteht zu den serösen Häuten. H. parasuis kann im oberen Respirationstrakt bei neugeborenen Ferkeln schon wenige Stunden nach der Geburt nachgewiesen werden (PIJOAN u. OLIVEIRA 2003). Bei einer experimentellen Infektion (VAHLE et al. 1995) lässt sich der Erreger zwölf Stunden p.i. in der Nase und 36 Stunden p.i. im Blut nachweisen. Vermehrte Flüssigkeitsbildung im Peritoneum, in der Pleura und im Perikard zeigt sich zwölf Stunden nach der Infektion. Nach 36 Stunden bilden sich in den Körperhöhlen Fibrinfäden, und auch in den Gelenken lässt sich fibrinöses Exsudat finden. Nach epizootiologischen Erhebungen in zahlreichen Schweinebeständen unterschiedlicher Größenordnung beschreiben KIELSTEIN et al. (1986) verschiedene Krankheitsverläufe der Glässerschen Krankheit: Zum einen treten sporadische Erkrankungen einzelner Tiere oder ganzer Würfe auf, die häufig im Zusammenhang mit dem Absetzen, dem Transport oder mit starken Stalltemperaturschwankungen stehen. Zum anderen treten akute Enzootien mit Befall mehrerer Würfe oder mehrerer Tiere in Buchten oder ganzen Stalleinheiten auf, die meist nicht mit erkennbaren Umweltbelastungen in Zusammenhang stehen und nach kurzen Zeitperioden wieder erlöschen. Der Erreger ist im Bestand jedoch weiterhin nachweisbar. Außerdem kommen immer wiederkehrende Enzootien mit einer hohen Morbidität vor, die vor allem in der Saugferkel- und Läuferphase auftreten. Trotz Einhaltung von Hygienestandards dauern diese Enzootien über Monate hinweg an und erfordern einen hohen Behandlungsaufwand. Diese Verlaufsform ist nicht nur mit

24 24 Literatur dem Auftreten von Stresssituationen erklärbar, es müssen vielmehr auch mögliche Erregerpassagen mit Virulenzveränderungen, ein hoher Infektionsdruck sowie eine unzureichende Immunitätsausbildung gerade in größeren Anlagen berücksichtigt werden. Zusätzlich zu diesen drei Verlaufsformen hat H. parasuis auch bei respiratorischen Erkrankungen eine ätiologische Bedeutung, vor allem bei Pneumonien mit Pleuritis, möglicherweise auch bei Rhinitiden. Potentiell pathogene Stämme von H. parasuis können häufig auch von gesunden Schweinen bzw. in gesunden Schweinebeständen von den Schleimhäuten des Nasen-Rachenraumes und der Trachea isoliert werden (healthy carrier). Naive Tiere können sich in der Aufzucht anstecken (PIJOAN u. OLIVEIRA 2003). Die Glässersche Krankheit gehört somit in die Gruppe der infektiösen Faktorenkrankheiten (KIELSTEIN et al. 1994). Eine H.-parasuis-Infektion kann in relativ naiven Herden, wie z. B. SPF-Herden oder in Herden mit SEW-Verfahren, wesentlich problematischer verlaufen als in konventionellen Betrieben. PIJOAN und OLIVEIRA (2002) haben eine Hypothese aufgestellt, um diesen Sachverhalt zu klären. In naiven Sauenherden verläuft demnach die Kolonisation der Saugferkel mit dem Erreger sehr langsam. Wenn diese Ferkel abgesetzt werden, ist nur eine geringe Anzahl der Tiere infiziert. In konventionellen Herden verläuft die Infektion bei den Saugferkeln wesentlich schneller, da es zu Kreuzinfektionen durch die Sauen und durch ältere Ferkel im Bestand kommt. Ferkel, die isoliert aufgezogen werden, können sich nur durch andere Ferkel der gleichen Gruppe infizieren. Dieses wird sehr langsam geschehen, so dass bei den meisten Ferkeln die Infektion so spät stattfindet, dass kein maternaler Schutz mehr vorhanden ist und die Krankheit so drastischer verläuft. Nicht-pathogene Stämme, die häufig im oberen Respirationstrakt der Sauen gefunden werden, besiedeln sehr schnell die Tonsillen, den Nasen-Rachenraum und die Trachea der Saugferkel. Bei potentiell pathogenen Stämmen verläuft die Besiedlung wesentlich langsamer, da diese Erreger wahrscheinlich bei säugenden Sauen nur in geringer Menge vorhanden sind. Infolge der Ausbildung maternaler Antikörper sind diese Ferkel weitgehend vor einer systemischen Infektion geschützt.

25 Literatur 25 Maternale Antikörper konnten von PIJOAN und OLIVEIRA (2003) bis zur sechsten bis achten Lebenswoche nachgewiesen werden. Die Abnahme der maternalen Antikörpertiter steht im Zusammenhang mit einer Zunahme der Mortalität, die meistens in der vierten bis sechsten Woche nach dem Absetzen beginnt. In Herden mit niedrigen maternalen Antikörpertitern beginnt das Krankheitsgeschehen schon spät in der Saugferkelphase oder früh in der Aufzucht. KIELSTEIN et al. (1994) haben jedoch in Infektionsversuchen herausgefunden, dass bei Verwendung virulenter Stämme weniger die Infektionsdosis für die Pathogenese der Infektion von Bedeutung ist, als vielmehr die individuellen Unterschiede in der Infektionsabwehr und die für das einzelne Individuum unterschiedlich belastenden Umweltfaktoren. So fanden sie heraus, dass die aerogene Übertragung grundsätzlich möglich ist. Jedoch wurden die pathologisch-anatomischen Organveränderungen nach intratrachealer Applikation nicht beeinflusst, die Ferkel waren also in der Lage, auch sehr hohe Infektionsdosen abzuwehren, was auf eine hohe Abwehrkapazität der Lunge eines gesunden Ferkels hinweist Klinische Symptomatik Erkrankungen verursacht durch H. parasuis sind in der Schweineproduktion weit verbreitet, wobei nicht nur die typische Polyserositis auftritt, sondern der Erreger zunehmend auch an respiratorischen Erkrankungen beteiligt ist. Am stärksten betroffen sind Ferkel vier bis sechs Wochen nach dem Absetzen oder Läufer kurz nach Einstallung in die Mast (OLIVEIRA u. PIJOAN 2002; ZIMMERMANN et al. 2004). Die Inkubationszeit beträgt fünf bis sieben Tage (BAEHLER et al. 1974), bei experimenteller Infektion nur 24 Stunden (NEIL et al. 1969; JANETSCHKE et al. 1977). Die Infektion kann verschiedene Verlaufsformen nehmen. Bei akutem Verlauf sind Apathie, Anorexie und Temperaturerhöhung bis 42,5 C zu beobachten. Plötzliche Todesfälle können in Verbindung mit einer Septikämie vorkommen.

26 26 Literatur Die typische Verlaufsform der fibrinösen Polyserositis, Polyarthritis und fibrinöspurulenten Meningitis geht mit Inappetenz einher. Auffällige klinische Symptome hängen von der Lokalisation der entzündlichen Veränderungen ab. Es kann zu Lahmheiten, umfangsvermehrten Gelenken, kyphotischer Rückenlinie, Schmerzäußerungen sowie zentralnervösen Symptomen, wie Inkoordination, Zittern, Festliegen und Ruderbewegungen teilweise in Seitenlage, kommen (RAPP- GABRIELSON 1999; VOS 2004; ZIMMERMANN et al. 2004). Bei Befall der Meningen kommt es außerdem zu Krampfanfällen und Nystagmus (LITTLE u. HARDING 1971; KIELSTEIN 1985). Palpatorisch sind Füllung und Fluktuation der Gelenke, insbesondere der Tarsalgelenke, diagnostizierbar (RITZMANN u. HEINRITZI 2005). In schweren Fällen können Zyanosen an Ohren, Rüsselscheibe und Gliedmaßen sowie Konjunktivitiden auftreten (ZIMMERMANN et al. 2004). Pneumonische Erscheinungen, wie Husten, Niesen, Dyspnoe und verstärkte abdominale Atmung, treten gleichzeitig oder als separates Krankheitsbild auf. Die Auskultation der Lunge ergibt häufig Reibegeräusche. Als seltene klinische Symptomatik wurden eine Panniculitis an den Ohren sowie eine Myositis und Fasciitis im Bereich der Nackenmuskulatur beschrieben (HOEFLING 1991), außerdem können Aborte bei Sauen und chronische Lahmheiten bei Zuchtebern vorkommen (RAPP-GABRIELSON 1999). Der milde Verlauf mit Husten, Dyspnoe oder Lahmheiten geht oft in ein chronisches Stadium, gekennzeichnet durch Gewichtsverlust, rauem Haarkleid und Kümmern über (RITZMANN u. HEINRITZI 2005). Bei älteren Schweinen und in endemisch infizierten Betrieben kann die klinische Symptomatik auf den Respirationstrakt beschränkt bleiben (OLIVEIRA u. PIJOAN 2002).

27 Literatur Pathologie Bei der Sektion der meist gut genährten Tiere finden sich gummiartige Ausgüsse der Gelenke und gelblich-trübe Flüssigkeitsansammlungen im Pleural- und Peritonealraum, die serösen Häute sind mit einer bis zu 1,5 mm dicken Fibrinschicht bedeckt. Außerdem lassen sich katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien finden. TARASENOK (1982) stellte während einer H.-parasuis-Infektion in einem Großbestand umfassende pathologisch-anatomische Untersuchungen an. Bei der Sektion von 26 bis 106 Tage alten Läufern wurden an diesen eine serofibrinöse Pleuritis, Perikarditis und Peritonitis festgestellt. Arthritiden traten relativ selten auf, bei der akuten Form wurde vermehrt synoviale Flüssigkeit festgestellt, gleichzeitig fand man große Mengen serösen Exsudates im Perikard, in der Pleura und im Peritoneum. Im Gegensatz dazu wurde bei einem subakuten und chronischen Krankheitsverlauf weniger Exsudat, aber mehr Fibrin festgestellt. Auch die Arthritiden kamen hierbei häufiger vor. Bei der akuten Verlaufsform findet man bei der pathologischen Untersuchung makroskopisch eine fibrinöse Pleuritis, Perikarditis, Peritonitis und Polyarthritis sowie eine purulente Meningoencephalitis. Neben vorwiegend fibrinösen und serofibrinösen Ergüssen kommen auch eitrige Verlaufsformen vor (NICOLET 1981). In selteneren Fällen kann eine Infektion zu einem akuten septikämischen Geschehen führen, wobei es zu einer Zyanose, subkutanem und pulmonalem Ödem und plötzlichem Tod ohne die typischen serösen Entzündungen kommen kann (RILEY et al. 1977; PEET et al. 1983). Beschrieben wurden auch seltene Fälle von Fasciitis und Myositis (HOEFLING 1991), sowie eine purulente Rhinitis (VAHLE et al. 1995). JANETSCHKE et al. (1977) führten Untersuchungen zur Pathologie und Histologie einer experimentellen H.-parasuis-Infektion bei SPF-Ferkeln durch. Die verendeten bzw. am 7. bis 10. Tag p.i. gemerzten Tiere zeigten eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie, wobei häufig nur lobuläre Bezirke betroffen waren. Gleichzeitig traten oft charakteristische Pleuraveränderungen in Form von fibrinöser bis fibrinöseitriger Pleuritis in großen Teilen der Brusthöhle auf. Zusammenfassend stellten die

28 28 Literatur Autoren fest, dass die Lungenveränderungen bei experimenteller Infektion mit H. parasuis sehr variabel und nicht charakteristisch sind, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass nicht immer die gleichen Isolate verwendet wurden. SOLANO-AGUILAR et al. (1999) beschreiben eitrig-katarrhalische Bronchopneumonien, die vor allem in den kranialen und medialen Lungenlappen lokalisiert sind. Mikroskopisch sieht man eine fibrinöse Exsudation mit geringgradiger Beteiligung neutrophiler Granulozyten und einer geringen Anzahl Makrophagen (VAHLE et al. 1995). Im Bereich der Hirn- und Rückenmarkhaut lassen sich dagegen hochgradig neutrophile Granulozyten finden. Die Fibrinbeteiligung ist im Zentralen Nervensystem gering- bis mittelgradig. Sind Husten, Atembeschwerden und hochgradige, periphere Kreislaufstörungen am Krankheitsgeschehen beteiligt, findet man eine hochgradige Zyanose, sowie Lid- und Ohrödem. Hirn- und Rückenmarkhäute lassen schon makroskopisch eine sulzige Imbibition neben fibrinös-eitrigen Auflagerungen erkennen. Bei der chronischen Verlaufsform kommt es zur adhäsiven Pleuritis, Perikarditis und Peritonitis. Mikroskopisch findet man korrespondierende fibröse Synechien (SCHULZ 1991). Wird H. parasuis aus der Schleimhaut gesunder Tiere isoliert, kommt es trotzdem zu einer Reduzierung der Anzahl der Zilien, man findet neutrophile Granulozyten und Plasmazellinfiltrationen (VAHLE et al. 1997) Diagnostik Die Diagnosestellung der Glässerschen Krankheit erfolgt auf der Grundlage der Anamnese, klinischer Symptome und pathologischer Untersuchungen. Erste Hinweise ergeben sich aufgrund des klinischen Bildes sowie anhand der makroskopisch sichtbaren pathologisch-anatomischen Veränderungen. Diese umfassen eine serofibrinöse bis fibrino-purulente Entzündung der serösen Häute in

29 Literatur 29 Form von Polyarthritis, Peritonitis, Pleuritis mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie sowie Perikarditis und Meningoenzephalitis. Der Nachweis erfolgt durch eine mikrobiologische Untersuchung. Hierfür eignen sich Tupfer von fibrinösen Auflagerungen, Bauchhöhlenflüssigkeit, Synovia oder Liquor. Trotz typischer klinischer Symptomatik und entsprechender pathologischanatomischer Veränderungen lässt sich H. parasuis aufgrund seiner Empfindlichkeit und der häufigen Überwucherung durch andere Keime nicht immer nachweisen (RAPP-GABRIELSON 1999; VOS 2004). Bei antibiotisch vorbehandelten Tieren gelingt der Nachweis nicht (OLIVEIRA u. PIJOAN 2002). Auch andere Faktoren, wie z. B. Chronizität der Erkrankung, nehmen Einfluss auf die Nachweisrate. Sie verbessert sich, wenn Material von frisch euthanasierten, unbehandelten Schweinen statt von verendeten Tieren gewonnen wird. Idealerweise werden Proben von Perikard, Pleura, Peritoneum, Gelenken und aus Meningen genommen (OLIVEIRA 2004). Eine Isolierung des Erregers aus dem Respirationstrakt lässt nicht unbedingt auf eine systemische Infektion rückschließen, da H. parasuis im oberen Respirationstrakt auch als kommensaler Besiedler vorkommen kann (OLIVEIRA 2004). Die Isolierungshäufigkeit nimmt parallel zum zeitlichen Abstand vom Eintritt des Todes des Tieres bis zur Untersuchung ab (KIELSTEIN et al. 1984).

30 30 Literatur Abb. 1: Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Glässersche Krankheit (nach RITZMANN und HEINRITZI 2005) Eine Charakterisierung von H. parasuis kann durch die Unterscheidung in Serotypen und Genotypen erfolgen. Dazu sind verschiedene Verfahren beschrieben worden. Im Allgemeinen werden die serologischen Tests als widersprüchlich und ungenau eingeschätzt (DONE 1999). In der Literatur sind verschiedene Methoden zur serologischen Typisierung von H. parasuis beschrieben, die in Abhängigkeit vom verwendeten Testsystem und Antigen zu unterschiedlichen Einteilungen führen. Von BAKOS et al. (1952) wurde eine serologische Typisierung von H. parasuis in die Serovare A, B, C und D auf der Grundlage der Langsamagglutination (LA) entwickelt. Als Antigen für diesen Test werden Ganzzellen aus Bakteriensuspension sowie Antiseren gegen diese Ganzzellen verwendet. Die vier Bakos-Typen wurden durch SCHIMMEL et al. (1985) um weitere drei Serovare ergänzt, die Jena 1, 2 und 3 genannt werden.

31 Literatur 31 Das Klassifikationssystem von MOROZUMI und NICOLET (1986a) beruht auf der Verwendung hitzestabiler löslicher Bakterienextrakte sowie serotypspezifischer Kaninchenhyperimmunseren im Agargelpräzipitationstest (AGPT). Sie konnten so weitere sieben Serovare beschreiben, die von KIELSTEIN (1991) um weitere sieben Gruppen sowie von RAPP-GABRIELSON und GABRIELSON (1990) um weitere vier nicht näher bezeichnete Serovare ergänzt wurden. Mit beiden genannten Serotypisierungsverfahren werden unterschiedliche Antigenstrukturen erfasst, so dass nur teilweise Zusammenhänge zwischen den Bakos- und den Morozumi- Nicolet-Typen besteht. Nach vergleichenden Untersuchungen von KIELSTEIN und RAPP-GABRIELSON (1992) können somit 15 Serovare unterschieden werden. Dieses Kielstein-Rapp-Gabrielson-Schema, welches auf hitzestabilen Antigenen getestet mit dem Agargelpräzipitationstest (AGPT) basiert, ist der international anerkannte Test zur Serotypisierung von H. parasuis. Die Serovare variieren in ihrer Pathogenität und treten regional unterschiedlich auf. In den meisten Ländern dominiert Serovar 5, gefolgt von Serovar 4 und 13. Ein hoher Anteil an nachweisbaren H.-parasuis-Isolaten lässt sich jedoch nicht typisieren. Das gleiche Vorkommen von mehreren Serovaren in einem Bestand und sogar in einem Tier ist möglich (KIRKWOOD et al. 2001; RAPP-GABRIELSON 1993 u. 1999). Allerdings wurde in allen Studien ein sehr hoher Anteil nicht typisierbarer Serotypen festgestellt. In den USA und Kanada lag dieser Anteil bei 15 % (RAPP- GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), in Deutschland bei 26 % (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), in Spanien bei 29 % (RUBIES et al. 1999) und in Australien bei 41 % (RAFIEE u. BLACKALL 2000). Dieser hohe Anteil nicht typisierbarer Serotypen zeigt, dass die Möglichkeit einer noch höheren Anzahl von Serotypen gegeben ist (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992; RAFIEE u. BLACKALL 2000). H.-parasuis-Stämme aus dem oberen Respirationstrakt sind meist von geringer Pathogenität und können auch bei klinisch gesunden Schweinen isoliert werden. Als apathogen werden die Stämme 3, 6, 7, 8, 9 und 11 eingeschätzt (KIELSTEIN et al. 1992; OLIVEIRA u. PIJOAN 2002).

32 32 Literatur Eine weitere Methode zur Serotypisierung von H.-parasuis-Isolaten ist die indirekte Haemagglutination (IHA), bei der erhitzte Bakterienzellen als Antigen für Schaferythrozyten verwendet werden (MINIATS et al. 1991a). Häufig wurden negative und sehr variable Ergebnisse erzielt, und die Autoren MINIATS et al. (1991) halten die IHA für unzuverlässig und für die Serotypisierung ungeeignet. KHYALI und MITTAL (2002) konnten dagegen im Vergleich zur Immundiffusion, bei der etwa 30 % der Isolate nicht typisierbar war, mit der indirekten Haemagglutination 90 % der Isolate typisieren, ohne dass Kreuzreaktionen aufgetreten sind. DEL RÍO et al. (2003) konnten mit der indirekten Haemagglutination 91 % der Isolate serotypisieren, mit der Immundiffusion 63 %. Sie empfehlen die IHA als nützliche Methode zur sensitiven und spezifischen Serotypisierung von H. parasuis. Die Serotypisierung von H. parasuis kann außerdem mit dem Koagglutinationstest durchgeführt werden. DEL RÍO et al. (2003) beschreiben den Koagglutinationstest als einfach, spezifisch und sensitiv, allerdings werden häufig Kreuzreaktionen beobachtet, dass er nicht zur Serotypisierung für H. parasuis empfohlen wird. Für den Nachweis von Antikörpern gegen H. parasuis in Serum oder Kolostrumproben können ELISA-Verfahren (Enzyme Linked Immunnosorbent Assay) angewendet werden (MINIATS et al. 1991a; SOLANO-AGUILAR et al. 1999). MÜLLER (2004) hat für seine Untersuchungen einen indirekten spezifischen ELISA zum Antikörpernachweis gegen H. parasuis Serotyp 5 verwendet. Extrakte dieses Agens wurden als Antigen genutzt. SOLANO-AGUILAR et al. (1999) benutzten einen ELISA, der als Antigen formalininaktivierte Bakterienzellen nutzte, um maternale Antikörpertiter und die humorale Antwort der Ferkel nach einer Impfung zu testen. Sie fanden bei den Ferkeln schon im Alter von fünf Tagen eine Antikörperbildung als Reaktion auf die Impfung. Eine weitere Methode zum Antikörpernachweis ist der Komplementfixationstest. NIELSEN (1993) konnte mit diesem Verfahren innerhalb einer Woche zirkulierende Antikörper nach einer Infektion mit H. parasuis nachweisen, aber auch bei dem Komplementfixationstest kommt es zu Kreuzreaktionen zwischen den einzelnen Serotypen. TAKAHASHI et al. (2001) benutzten diesen Test, um Antikörpertiter bei

33 Literatur 33 einem Infektionsversuch zu bewerten. Sie fanden Antikörpertiter 19 Tage nach der zweiten Vakzination. Neben den verschiedenen Serotypisierungsverfahren kann zur Identifizierung von H. parasuis auch eine Genotypisierung durchgeführt werden. Von OLIVEIRA et al. (2001) wurde ein PCR-Verfahren (Polymerase Chain Reaction) angewendet, um die Genauigkeit und Schnelligkeit in der H.-parasuis-Diagnostik zu verbessern. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion ist es möglich, Nukleotidsequenzen enzymatisch zu amplifizieren. Das Prinzip der PCR beruht auf der Fähigkeit von bestimmten zellulären Enzymen, sogenannten Polymerasen, DNA zu verdoppeln. Die hierfür verwendeten Primer waren hoch spezifisch für den Nachweis von H. parasuis. Die PCR kann auch im Fall eines negativen bakteriologischen Ergebnisses herangezogen werden, da Antigene sowohl aus Bakterienkulturen als auch direkt aus Probenmaterial nachgewiesen werden können (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Als Material für die PCR dienen veränderte Organe, Synovia, Liquor oder Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF). Die PCR gilt als gute Screeningmethode zur Beurteilung der einzelnen Betriebe. Als Modifikationen der konventionellen PCR wurden die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR, die nested-pcr, die Real-time PCR und die Amplifikationsfragmentlängenpolymorphismus (AFLP)-PCR entwickelt. Die ERIC-PCR ist eine molekularbiologische Methode, mit deren Hilfe man stammspezifische Fingerabdrücke produzieren kann, die den Vergleich und die Differenzierung der verschiedenen Stämme ermöglichen (OLIVEIRA u. PIJOAN 2001). Sie erlaubt Untersuchungen zur Epidemiologie von H. parasuis innerhalb und zwischen den Herden und verbessert die Charakterisierung der verschiedenen H.- parasuis-isolate. In Studien konnte nachgewiesen werden, dass erhebliche genetische Unterschiede innerhalb der verschiedenen Serovare vorliegen (OLIVEIRA et al. 2004). OLIVEIRA et al. (2004) haben die Reproduzierbarkeit der Methoden der AFLP- und der ERIC-PCR miteinander verglichen und sind zu dem Ergebnis gekommen, dass beide Verfahren gute Methoden zur Genotypisierung sind. Der Nachteil der ERIC-PCR ist allerdings die schlechte Reproduzierbarkeit der

34 34 Literatur Ergebnisse. Die Ergebnisse der AFLP sind abhängig von den benutzten Restriktionsenzymen und den Parametern der Amplifikation. Bei der nested-pcr wird DNA aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe nachgewiesen. Dieser Nachweis ist für die Routinediagnostik wichtig, da auf diese Weise viele Proben aufbereitet werden können. Eine weitere Alternative der H.-parasuis-Diagnostik ist die Immunhistochemie. H. parasuis konnte aus Proben von experimentell infizierten Schweinen nachgewiesen werden. Ebenso wird der Nachweis von inaktivierten Erregern aus dem Zytoplasma phagozytierender Zellen ermöglicht (AMANO et al. 1994; SEGALES et al. 1997). Es können allerdings Kreuzreaktionen mit A. pleuropneumoniae auftreten, wenn polyklonale Antikörper für den Nachweis verwendet werden Differentialdiagnosen Differentialdiagnostisch von einer H.-parasuis-Infektion abzugrenzen sind alle bakteriellen Erreger, die eine septikämische Bakteriämie verursachen, wie z.b. Streptococcus suis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus suis, Salmonella Choleraesuis und Escherichia coli. Häufig sind plötzliche Todesfälle der einzige Hinweis auf ein Erkrankungsgeschehen. In diesem Fall müssen die Ödemkrankheit, verursacht durch E. coli, und Meningitiden durch S. suis ausgeschlossen werden. Die Symptome einer Polyserositis müssen von einer Mycoplasma-hyorhinis-Infektion und die einer Polyarthritis von einer Mycoplasma-hyosynoviae-Infektion abgegrenzt werden. Purulente Arthritiden kommen aufgrund von Streptokokken oder Arcanobacter pyogenes in Betracht. Klinisch sind diese Krankheitsbilder kaum zu unterscheiden. Mycoplasmen sind ähnlich schwer anzuzüchten wie H. parasuis, so dass bei negativem bakteriologischem Befund eine Untersuchung mittels PCR angezeigt ist. Bei Verlauf mit zentralnervösen Erscheinungen müssen insbesondere Streptokokken-Meningitis und Enterotoxämie berücksichtigt werden. S. suis kann aus

35 Literatur 35 Liquor oder bei euthanasierten Tieren aus dem Gehirn isoliert werden. Die Enterotoxämie verläuft ohne Gelenkbeteiligung, klinisch fallen Lidödeme auf. Ist am Krankheitsgeschehen eine eitrige Bronchopneumonie beteiligt, müssen alle bakteriellen und viralen Erreger, die an respiratorischen Erkrankungen beteiligt sein können, ausgeschlossen werden (RAPP-GABRIELSON 1999) Immunität Immunantwort Auf Grund der epitheliochorialen Plazentation der Sau kommen die Ferkel praktisch gammaglobulinfrei zur Welt. Sie sind auf den passiven Immunglobulintransport via Kolostrum in den ersten Stunden nach der Geburt angewiesen. Hinsichtlich des Gehaltes und der Zusammensetzung der Gammaglobuline in der Sauenmilch sind Schwankungen zwischen den Individuen, der Laktation und dem Sauenalter beobachtet worden (KLOBASA u. BUTLER 1987). PIJOAN und OLIVEIRA (2003) haben maternale Antikörper bei Ferkeln noch zwischen der sechsten und achten Lebenswoche nachgewiesen. Die Immunität, die über die kolostralen Immunglobuline vakzinierter Sauen an die Ferkel übertragen wird, ist serovarspezifisch (RAPP- GABRIELSON et al. 1997). Die maternale und die natürliche Immunität sind kritische Faktoren bei der Kontrolle einer H.-parasuis-Infektion (NIELSEN u. DANIELSEN 1975, SCHIMMEL et al. 1992). Die Antikörperbildung, also die humorale Immunität ist wegen des septikämischen Verlaufs der Erkrankung wahrscheinlich der Hauptfaktor im Immunmechanismus (RAPP-GABRIELSEN 1999). Die antigenen Eigenschaften von H. parasuis sind in verschiedenen Untersuchungen der Immunantwort gegen phänotypische Marker, wie OMP, LPS und Kapselprotein, getestet worden. MINIATS et al. (1991b) benutzten einen Immunoblotassay, um die Beziehung zwischen der humoralen Antwort geimpfter Ferkel und dem Schutz durch die Impfung zu beurteilen. Sie fanden heraus, dass nur die Anwesenheit von