Mikroskopie I. (Thema 33.) SZILVIA BARKÓ 2016

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1 Mikroskopie I. (Thema 33.) SZILVIA BARKÓ 2016

2 Titel 33. I. Klassifizierung der mikroskopischen Methoden. II. Lichtmikroskop. Bildentstehung des Mikroskops. Haupterfordernisse der Bildentstehung. III. Auflösungsvermögen (Airy-Scheibchen, Abbe Prinzip, Beugungsgrenze). Numerische Apertur. Immersionsmedium. IV. Phasenkontrasmikroskopie. V. Rasterkraftmikroskopie. VI. Elektronenmikroskopie.

3 I. Klassifizierung der mikroskopischen Methoden. Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Rasterkraftmikroskopie Grundlage der Beobachtung Licht Elektronenstrahl Kraft/Topographie Grundlage der Bildentstehung Gestreutes Licht Durchdringende/Reflektierte Elektronen Änderung der Position des Laserstrahles Auflösungsgrenze 200nm/20nm 0,1nm 0,1nm Probe Lebend und fixiert Nur fixiert Lebende und fixierte Vorteile Einfach Sehr detailiertes Bild Wirkliche topografische Bilder Schnell Beste Auflösung Kraft ist auch messbar Vorbereitung nicht immer nötig Weniger Artefakte Nachteile Schwaches Auflösungsvermögen Kein lebender Organismus Sehr geräuschsensitiv

4 II. Lichtmikroskop. Bildentstehung des Mikroskops. Haupterfordernisse der Bildentstehung. Das einfachste optische Instrument ist unser Auge, es besteht vereinfacht aus einer Linse und der Netzhaut, auf der der zu beobachtende Gegenstand abgebildet wird. Eine Lupe (Brennglas) ist eine einfache konvexe Linse mit kleiner Brennweite.

5 Objektive sind optische Systeme, die ein reales Bild eines Objektes erzeugen. Sie sind zumeist aus mehreren Einzellinsen oder Spiegeln zusammengesetzt. Die Größe des erzeugten Bildes hängt von der Brennweite der Linse und von der Lage des Objektes ab.

6 III. Auflösungsvermögen: Abbe Prinzip d = λ NA Objektiv + NA Kondensor Der Kondensor bewirkt, dass das Licht als Strahlkegel auf das Präparat auftrifft und nicht als Zylinder wie bei zentraler Beleuchtung. d = λ 2n sinα Abbe-Denkmal in Jena mit der Auflösungsformel im oberen Bereich Das Abbe-Kriterium ist absolut, es kann mit klassischer Mikroskopie nicht überwunden werden.

7 Numerische Apertur. Immersionsmedium. NA=n sin a n = Brechungsindex des Mediums (Luft, Öl, Wasser) a = halber Öffnungswinkel des Objektives Luft als Medium zwischen Objektiv und Deckglas: NA maximal 1. Ansonsten ist der Öffnungswinkel zu flach und es kommt zur Totalreflexion des Lichts am Deckglas. Damit die Totalreflexion an der Phasengrenze zwischen Deckglas und Medium verhindert wird: wird ein Medium verwendet, welches in etwa den selben Brechungsindex aufweist wie Glas. Dies ist in den meisten Fällen Immersionsöl.

8 Beispiel Lösung mit der besten Parameter: d = λ 2 n sinα = 400nm 2 1,5 sin70 = 172,26 nm

9 III. Auflösungsvermögen: Das physikalische Modell für die Beugung ist das Huygenssche Prinzip Es besagt, dass jeder Punkt einer Wellenfront als Ausgangspunkt einer neuen Welle, der so genannten Elementarwelle, betrachtet werden kann. Maximum 2. Ordnung Maximum 1. Ordnung Maximum 0. Ordnung Maximum 1. Ordnung Maximum 2. Ordnung Zu erwartendes Bild entsprechend der Strahlenoptik Tatsächliches Bild Konstruktive Interferenz Destruktive Interferenz

10 Auflösungsvermögen: Airy-Scheibchen, Rayleigh-Kriterium Es ist die Fähigkeit eines optischen Instrumentes Objektdetails getrennt abbilden zu können. Es ist in eineinem gewissern Abstand zwischen den 2 Punkten nötig, um diese zwei Punkte als 2 getrennte Strukturen sehen zu können. Rayleigh-Kriterium: zwei Beugungsscheibchen (Airy-Discs), die sich noch gerade trennen lassen, wenn das Minimum des ersten mit dem Maximum des zweiten zusammenfällt, also sich die beiden Maxima 0. Ordnung gerade nicht mehr überschneiden. 2 Airy Scheibchen aufgelöst 1 Airy Scheibchen - Beugungsbild 2 Airy Scheibchen - nicht aufgelöst Maxima 0. Ordnung überschneiden sich nicht Maxima 0. Ordnung überschneiden sich

11 Sekundäres Bild Primäres Bild (Ort des Spalts) Die Objektöffnung ist zu klein um die gebeugten Strahlen aufzunehmen Kein primäres Bild Das Zwischenbild hat keine Struktur Mindenstens die Beugunsmaxima 1. Ordnung sollen ins Objektiv fallen!!!

12 Mikroskop-Arten Lichtmikroskop Elektronenmikroskop Rasterkraftmikroskop Hellfeld Dunkelfeld Phasenkontrast Polarisationkontrast Interferenzkontrast Fluoreszenmikroskop Rasterelektronenmikroskop Transmissionselektronenmikroskop

13 Hellfeldmikroskopie Iris pseudacorus(sumpfschwertlilie) Die einfachste und grundlegendste Methode im Lichtmikroskop. Befindet sich kein Objekt im Strahlengang, so treffen die Lichtstrahlen ungestört ins Objektiv und man erhält ein gleichmäßig helles Bild. Epithelzelle und Mundbakterien

14 Kontrasterhöhung Kontrast: das Intensitäts- oder Helligkeits-Verhältnis von zwei Bereichen eines Bildes. zb. der Helligkeitsunterschied zwischen der aufgelösten Struktur und dem Hintergrund. Bei dunklem Hintergrund hingegen bewirkt eine geringfügige Erhöhung der Struktur-Intensität eine massive Steigerung des Kontrastes. Man kann die Struktur klar und deutlich sehen.

15 Kontrasterzeugung durch: Absorption: Hellfeld, UV-Mikroskopie, Färbung mit Hellfeldfarbstoffen Lichtbrechung: Dunkelfeld Phasenverschiebung: Phasenkontrast, Polarisation, DIC Lichtreflexion: Auflichtmikroskopie Leuchtendes Objekt: Fluoreszenz

16 IV. Phasenkontrastmikroskopie Sehr dünne und transparente Objekte können kein Licht absorbieren und erzeugen auch keine Veränderung der Amplitude. Amplitudenpräparat Phasenpräparat Beim Phasenkontrast werden Unterschiede in der Dichte von Strukturen dargestellt. Dabei werden Objekte mit höherer Dichte und damit höherem Brechungsindex (zb Zellkern) normalerweise dunkler abgebildet als Strukturen mit geringer Dichte und damit kleinerem Brechungsindex (zb Plasma). Aus diesem Grund eignen sich nur dünne, transparente oder nur schwach gefärbte Objekte für die Phasenkontrast-Mikroskopie.

17 V. Rasterkaftmikroskopie (Atomic Force Microscope = AFM) In einem Rasterverfahren wird die zu untersuchende Oberfläche Zeile für Zeile abgetastet. Dabei bewegt sich eine sehr fein konstruierte Messsonde (Cantilever) über die Probe oder umgekehrt. Für diese Bewegung sorgen Piezokristalle, die sich in Abhängigkeit von der angelegten Spannung ausdehnen oder zusammenziehen. Die Spitze der Sonde selbst ist nur wenige Atome dick. Deshalb kann sie kleinste Oberflächenänderungen registrieren. Die Auslenkung der Sonde wird über einen Laserstrahl sichtbar gemacht.

18 Streckung von einzelnen Molekülen mit AFM

19 Flexibilität der Biopolymere L P =Persistenzlänge L= Konturlänge Steife Kette L P >>L L P =1-6 mm Mikrotubuli Semiflexible Kette L P ~L L P = μm Aktin Filamente Flexible Kette L P <<L L P =9-16 nm Titin

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21 Anwendungen Kräfte: Intermolekulare Intramolekulare Elastizität Topographie

22 VI. Elektronenmikroskopie Zwischen- und Projektivlinsen weiten den Strahl auf => hohe Endvergrößerung Das von den Elektronen projizierte Bild kann nicht direkt wahrgenommen werden Daher verwendet man einen fluoreszierenden Leuchtschirm Vergrößerungen von ca. 100-fach bis ca fach sind einstellbar Quelle:

23 Zur Analyse können entweder die von der Objektoberfläche reflektierten Elektronen (=>REM) oder die transmittierten Elektronen (=>TEM) herangezogen werden. Quelle: Skript zum Praktikum Instrumentelle Analytik (IAA 2000

24 TEM - Voraussetzung Die optimale Schnittdicke der Ultradünnschnitte liegt bei 60-70nm (Mikrotome) Die Schnitte werden auf kleine Kupferringe (Grids) aufgelegt, die mit einer hauchdünnen Folie bezogen sind. Bei dieser Dicke können Elektronen den Schnitt passieren, gleichzeitig werden sie aber von den Strukturen im Schnitt stark genug gestreut, um ein Abbild erzeugen zu können. Die Probendicke richtet sich nach der Ordnungszahl der Atome, aus denen die Probe besteht der Höhe der Beschleunigungsspannung der gewünschten Auflösung Im TEM muss ein hohes Vakuum erzeugt werden => keine Wechselwirkung von Elektronen mit Gasmolekülen => Vorbereiten der Proben nötig (Kontrastierung mit Schwermetallen und/oder Entwässerung)

25 TEM - Voraussetzung Erinnerung: Schnelle Elektronen haben eine sehr viel kleinere Wellenlänge als sichtbares Licht =>höhere Beschleunigungsspannung => kleinere Wellenlänge => größerer Impuls => bessere Auflösung Je höher die Ordnungszahl und je niedriger die Beschleunigungsspannung sind, desto dünner muss die Probe sein. De Broglie-Beziehung: λ = h p = h m v

26 TEM - Nachteile Die aufwändige Vorbereitung der Proben kann zu Artefakten führen => Strukturen, die nichts mit dem eigentlichen Objekt zu tun haben und die Auswertung der Bilder erschweren können. Ein weiteres Problem ist die Schädigung der Proben durch den Elektronenstrahl z.b. durch Erwärmung oder Wegstoßen ganzer Atome nach Kollision mit den schnellen Elektronen Einschluss von Fremdatomen aus dem Vakuum in die Probe. Da die Proben im Vakuum betrachtet werden müssen, kann kein lebendes Material untersucht werden. Elektronenmikroskope, insbesondere TEMs, sind außerdem sehr teuer in Anschaffung und Unterhalt.

27 Danke für Ihre Aufmerksamkeit!