Biochemische Untersuchungsmethoden für Pharmazeuten Skript WS 2015/2016

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1 Biochemische Untersuchungsmethoden für Pharmazeuten Skript WS 2015/2016 Seite 1 von 59

2 Inhalt ALLGEMEINES... 3 Anmerkungen zur Auswertung und Gruppeneinteilung... 3 Regeln für das molekularbiologische Arbeiten und Verhalten im Praktikum... 3 Beschriftung von Reaktionsgefäßen... 3 Schematischer Ablauf des Praktikumteils Nukleinsäureanalytik... 4 Versuch 1: Herstellen eines DNA Größenstandards... 5 Versuch 1A: Restriktionsverdau... 7 Versuch 1B: Überprüfung des Reaktionsfortschritts auf Agarosegel... 7 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren... 8 Versuch 2A: DNA-Isolation aus Zellkultur (Mensch)... 9 Versuch 2B: UV-Spektrometrie - Bestimmen der optimalen Wellenlänge zur DNA-Analyse Versuch 2C: Quantitative Analyse der genomischen DNA (Mensch) Versuch 2D: Agarosegelelektrophorese (qualitative Analyse der gen. DNA) Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3A: Isolation von Plasmid DNA aus E. coli Versuch 3B: Quantifizierung der Plasmid DNA mit UV-Spektrometrie Versuch 3C: Restriktionsverdau mit blunt end Restriktionsenzym Versuch 3D: Überprüfen des Restriktionsverdaus auf einem Agarosegel Versuch 3E: Reinigung des blunt end Vektors Versuch 3F: Erzeugen von T-Überhängen Versuch 3G: Reinigung des T-Vektors Versuch 4: Polymerase Chain Reaction (PCR) Versuch 4A: Gradienten-PCR Temperatur Versuch 4B: Gradienten-PCR MgCl 2 -Konzentration Versuch 4C: Reinigung des PCR-Produkts Versuch 5: Klonierung Versuch 5A: Bestimmen des Insert/Vektor Verhältnisses Versuch 5B: Ligation Versuch 5C: Vorbereitungen für die Transformation Versuch 5D: Inaktivierung der T4 DNA-Ligase Versuch 5E: Herstellen kompetenter Zellen und chemische Transformation Versuch 5F: Insert-Analyse Versuch 6: Sequenzanalyse Versuch 6A: Alignment Versuch 6B: Analyse der CYP2C19 Polymorphismen Versuch 7: Genotypisierung von CYP2C Versuch 7A: DNA-Isolation aus Mundschleimhautzellen Versuch 7B: Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse am LightCycler Versuch 8: DNA-Schmelzpunktanalyse Versuch 9: Quantitative PCR (qpcr) Versuch 9A: Programmierung des LightCycler Versuch 9B: Probenvorbereitung für die qpcr Versuch 10: Rekombinante Proteine - Expression in E. coli Versuch 10A:Proteinexpression in Escherichia coli Versuch 10B: Herstellen des löslichen Proteinextrakts von E. coli Versuch 10C: Nickel-Affinitätschromatographie von His-tag-Proteinen Versuch 10D: Nachweis von Proteinen mittels Bradford-Test Versuch 10E: Trennung von Proteingemischen durch SDS-PAGE Versuch 10F: Western Blot Versuch 11: Isolation von Cholesterol aus Hühnerei Versuch 11A: Cholesterolisolation Versuch 11B: Cholesterolbestimmung Versuch 12: Enzymkinetik mit β-galactosidase aus E. coli Literatur Anhang: Übersicht zur Probenlagerung am Ende der Versuchstage Seite 2 von 59

3 Allgemeines ALLGEMEINES Anmerkungen zur Auswertung und Gruppeneinteilung Es ist wichtig, über alle handwerklichen Schritte im Labor vor Ort ein sehr genaues Protokoll zu führen. Nur so kann ein troubleshooting im Nachhinein vielleicht die Ursache für ein nicht geglücktes Experiment aufdecken, bzw. ein Experiment noch im Labor während der weiteren Durchführung gerettet werden. Als Vorbereitung auf die einzelnen Experimente sind Hausaufgaben zu lösen, die im Protokoll=Auswerteformular nicht mehr aufgeführt werden müssen, aber u.a. die Grundlage für die Abschlussklausur darstellen. In den Protokollen sind nur die Ergebnisse darzustellen und zu diskutieren, eine Einleitung zu den Versuchen ist nicht gefordert; bei der Durchführung müssen nur Änderungen oder Ergänzungen zur Anleitung in diesem Skript aufgeführt und diskutiert werden. Jede 4er-Gruppe fertigt ein gemeinsames Protokoll an. Da vier Leute an diesem Schriftstück arbeiten, ist die Erwartungshaltung hinsichtlich Rechtschreibung, Grammatik, Inhalt und wissenschaftlicher Formate besonders hoch! Jeder Fehler, der von Ihrer Seite unentdeckt geblieben ist und erst durch den Assistenten aufgedeckt werden muss, führt zu Punktabzug! Zwar sind Sie in Vierergruppen eingeteilt, doch werden nicht alle Versuche gemeinsam durchgeführt: Manche Versuche werden einmal von vier Personen gemeinsam durchgeführt, manche viermal von jedem Gruppenmitglied, manche zweimal von je zwei Mitgliedern. Die entsprechenden Angaben finden hinter der Durchführung zu jedem Versuch (1x4, 4x1 oder 2x2). Dreiergruppen entscheiden selbst, ob sie einen Versuch zweimal oder nur einmal durchführen möchten. Regeln für das molekularbiologische Arbeiten und Verhalten im Praktikum In den Praktikumsräumen ist das Rauchen, Essen und Trinken verboten! Geräte dürfen erst nach Einweisung benutzt werden! Werden Geräte ohne Einweisung bedient, haftet der Student für eventuelle Schäden! Arbeitsplatz täglich mit 70 % Alkohol desinfizieren! Gebrauchte Glaswaren spülen und zum Trocknen aufhängen! Platten und Lösungen, die nicht mehr gebraucht werden (auf den Regalen, im Wärmeschrank etc.) sofort entsorgen! Abfälle entsprechend der Vorschriften sammeln und entsorgen! Im Zweifel die Assistenten fragen! Spitzenkästen nach jedem Versuchstag wieder mit Pipettenspitzen ergänzen! Dazu unbedingt Handschuhe tragen (die Spitzen in diesem Praktikum werden nicht autoklaviert). Pipetten nach jedem Versuchstag mit 70% EtOH feucht abwischen! Vor dem Verlassen des Praktikums prinzipiell Hände waschen! Nach direktem Kontakt mit Mikroorganismen Hände desinfizieren! Hausaufgabe: Warum verwendet man im Molekularbiologielabor nukleasefreies und destilliertes Wasser? Warum werden bei enzymatischen Reaktionen die Enzyme in aller Regel erst am Schluss zugegeben? Beschriftung von Reaktionsgefäßen Im Molekularbiologiepraktikum kommen hauptsächlich kleine Reaktionsgefäße ( Eppi ) mit einem Fassungsvermögen von 0,2 ml 2 ml zum Einsatz. Die Beschriftung soll während eines Versuchstags nur vereinfacht durch ein Kürzel mit einem wasserfesten Stift geschehen, z. B. wenn die Gefäße nur für einen Zwischenschritt (Zentrifugation etc.) genutzt werden und danach weggeworfen werden. Werden diese Gefäße zur Aufbewahrung des wertvollen Inhalts jedoch über mehrere Tage verwendet, so müssen sie ausführlich und unmissverständlich beschriftet werden: Datum, Inhalt, gegebenenfalls Konzentration, Gruppennummer. Eddingstifte sind dafür nicht geeignet, da die Schrift mit der Zeit verwischt; verwenden Sie in solchen Fällen in kleines Stück Papier (sauber ausgeschnitten und beschriftet), das mit Tesafilm an dem Eppi befestigt wird. Vor Verlassen des Labors wird die ordentliche Beschriftung von den Assistenten überprüft dies kann besonders gegen Feierabend zu Tränen führen wirklich! Vor dem Beimpfen mit Bakterien muss jedes Kulturgefäß und jede Platte genau beschriftet werden. Dabei wird entlang des Rands auf Plattenboden geschrieben, um einer Verwechslung durch Vertauschen der Plattendeckel vorzubeugen. Wichtige Angaben sind: Nährmedium, Name des Mikroorganismus, Vektor, Insert, Datum, Name oder Gruppennummer des Experimentators, (Bezeichnung des Versuchs). Seite 3 von 59

4 Allgemeines Schematischer Ablauf des Praktikumteils Nukleinsäureanalytik λ-dna size marker DNA-Isolation aus eukaryot. Zellkultur Grundlagen der UV- Spektrometrie Plasmid-Isolation aus E. coli Versuchstag 1 Size marker Restriktionsverdau Quantität: UV- Spektrometrie Quantität: UV- Spektrometrie Qualität: Agarosegel- Elektrophorese Qualität: Agarosegel- Elektrophorese Linearisierung: Restriktion zu blunt end Versuchstag PCR (Temperatur, MgCl2) Qualität: Agarosegel- Elektrophorese Reinigung des Blunt end Plasmids Versuchstag 3 Addition von T-Überhang Reinigung des PCR-Produkts Reinigung des T-Vektors Versuchstag 4 Ligation Qualität: Agarosegel- Elektrophorese Herstellen Kompetenter Transformation E. coli Versuchstag Kolonie-PCR Insertanalyse Versuchstag Sequenzanalyse Einen ähnlichen Überblick über das Vorgehen in diesem Kurs finden Sie auch auf der ersten Seite hier: weiterführende Info: Seite 4 von 59

5 Versuch 1: Herstellen eines DNA Größenstandards Versuch 1: Herstellen eines DNA Größenstandards Versuch 1A: Restriktionsverdau (Tag 1) Versuch 1B: Überprüfung des Reaktionsfortschritts auf Agarosegel (Tag 2) Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese (Versuch 2 D) werden DNA-Fragmente nach Größe aufgetrennt, indem sie mit Hilfe eines elektrischen Felds durch ein Molekularsieb aus Polysacchariden gedrückt werden. Dabei wandern kleine DNA-Fragmente schneller durch das Gel als große. Neben dieser relativen Größenbestimmung kann die Fragment-Größe auch absolut bestimmt werden: Um einem unbekannten DNA-Fragment eine bestimmte Größe [bp] zuordnen zu können, muss auf jedem Gel mindestens eine Spur für einen Größenstandard reserviert werden, der DNA-Fragmente von bekannter Größe beinhaltet. Durch Vergleich der Laufstrecke mit einem Fragment bekannter Größe lässt sich damit dem unbekannten Fragment sehr einfach eine ungefähre Größe zuordnen. Diese (wenn auch nur ungefähre) Größenbestimmung spielt auch heute noch eine sehr bedeutsame Rolle im Molekularbiologielabor, da sich daran rasch Erfolg oder Misserfolg eines Experiments abschätzen lässt. Größenstandards ( molecular size markers ) können von verschiedenen Firmen in allen denkbaren Varianten käuflich erworben werden, sie können allerdings auch sehr einfach in Eigenregie hergestellt werden: Durch gezielten Abbau von λ-dna mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII werden DNA-Fragmente bestimmter Größe erzeugt. Diese DNA-Fragmente werden auf einem Agarosegel nach Größe getrennt und zur Größenbestimmung anderer DNA-Fragmente eingesetzt. Seite 5 von 59

6 Versuch 1: Herstellen eines DNA Größenstandards Hausaufgaben (Tag 1): Aus welchen Organismen stammen EcoRI bzw. HindIII? Welche natürliche Funktion haben sie in diesen Organismen? Welche Sequenzen erkennen und schneiden diese beiden Enzyme? Wie viele Basenpaare enthält das Genom des Bakteriophagen Lambda? Wie viele Gene? Warum wird die wirtseigene DNA nicht von den Restriktionsenzymen angegriffen? Bestimmen Sie die Fragmentgrößen, die durch Verdau der λ-dna mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII entstehen. Machen Sie sich dazu mit dem frei im Netz verfügbaren Programm NEB cutter von New England Biolabs vertraut. Eine Sammlung von Software-Applikationen in der Molekularbiologie: Verdauen Sie im NEB cutter (das Icon mit der Schere) zunächst λ-dna mit allen Enzymen. Im Ergebnisfenster gibt es dann die Option Custom digest Costum digest : Klicken Sie EcoRI und HindIII an Digest List fragments oder view gel Füllen Sie die Tabelle 1 aus! ad add! ad= bis zu dem angegebenen Volumen auffüllen. add= das angegebene Volumen hinzufügen. Bestimmen Sie die geeigneten Reaktionsbedingungen (Temperatur, Puffer). Die Anforderungen der einzelnen Enzyme finden Sie hier: Das Puffersystem von NEB wurde kürzlich verändert, im Praktikum werden zum Teil noch die "alten" Puffer eingesetzt, orientieren Sie sich daher auch an "previous Version of Activity/Performance Chart", wenn Sie die Bedingungen für ein bestimmtes Enzym ermitteln! Hier können Sie die Pufferzusammensetzungen vergleichen: Lernen Sie dabei intensiv mit diesen oder ähnlichen Angaben umzugehen; insbesondere hinsichtlich Schnittstelle, Art der Überhänge und Reaktionsbedingungen: Literatur: Richard J. Roberts (2005) How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 102, (ein historischer Rückblick, keine Klausurrelevanz) Richard J. Roberts et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Research 31, (Die erste Seite genügt, um Schreibweise und Formatierung der Namen von Restriktionsenzymen zu verstehen und im Protokoll umzusetzen) Seite 6 von 59

7 Versuch 1: Herstellen eines DNA Größenstandards Versuch 1A: Restriktionsverdau Bevor Sie beginnen: Machen Sie ein Foto von Ihrem Arbeitsplatz! So muss der Arbeitsplatz auch aussehen, wenn Sie am Abend das Labor verlassen möchten! 37 C Brutschrank; EcoRI, HindIII, λ-dna, Reaktionspuffer (NEB2 nach dem alten Puffersystem), 10x Blaumarker (50% Glycerol, 0,8% Bromphenolblau, 1 mm EDTA; 10x bedeutet, dass der Blaumarker vor dem Auftragen auf ein Agarosegel zusammen mit der DNA-Probe und evtl. Wasser 1:10 verdünnt wird) Durchführung (2x2 Personen): Beschriften Sie insgesamt fünf 1,5 ml Eppis (mit Papier) mit λ EcoRI/HindIII, Gruppennr., Datum und zusätzlich mit "R" für das Eppi, in dem die Enzymreaktion stattfindet und mit "A0, A5, A15, A60" für vier Eppis, in denen Sie Aliquote der Reaktion nach bestimmten Reaktionszeiten (0-60 min) bis zum nächsten Versuchstag aufbewahren. Legen Sie in den Eppis A0 A60 jeweils 1,5 µl H 2 O bidest. und 0,5 µl Blaumarker (10x) vor (stoppt die Enzymreaktion und bereitet die Proben für die Gelelektrophorese vor). Berechnen Sie die Volumina der Reagenzien für ein Gesamtreaktionsvolumen von 90 µl (Tab. 1) und vermischen Sie die Reagenzien in dem Eppi R, aber noch ohne Enzyme! Negativkontrolle: vor Zugabe der Restriktionsenzyme gut mischen und 3 µl in das Eppi A0 überführen, mit dem Blaumarker durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vermischen Tab. 1 DNA-Größenstandard: Reaktionsansatz zum Restriktionsverdau von λ-dna mit EcoRI und HindIII Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration bzw. Menge λ-dna 0,3 mg / ml 4,5 µg Reaktionspuffer 10-fach? (x-fach) (welcher?) EcoRI 25 Units / µl 10 Units HindIII 20 Units / µl 10 Units H 2 O dest, nukleasefrei ad 90 µl Volumen [µl] Restriktionsenzyme zugeben, gut mischen und bei 37 C inkubieren Nach 5 min, 15 min, 60 min Inkubation jeweils 3 µl (= 150 ng) in die entsprechenden (A5, A15, A60) Eppis überführen, gut mit dem Blaumarker vermischen und zunächst am Platz bei RT lagern. Lagerung über Nacht bei 4 C für Auswertung mittels Agarosegelelektrophorese am nächsten Versuchstag! Versuch 1B: Überprüfung des Reaktionsfortschritts auf Agarosegel 1,5% TAE-Agarosegel (2x 12 Taschen), Blaumarker Durchführung (2x2 Personen beladen je ein Gel mit 2x12 Taschen): Entnehmen Sie dem Eppi R, in dem der Reaktionsverdau über Nacht fortgeschritten ist, vier Proben von 0,5 µl, 1 µl. 2 µl bzw. 3 µl und mischen Sie diese in vier separaten Eppis ( R0,5, R1, R2, R3 ) mit 0,5 µl Blaumarker und füllen Sie das Volumen mit H 2 O bidest. auf 5 µl auf. Siehe Versuch 2C: Tragen Sie die Proben A0-A60 und R0,5-R3 komplett (je 5 µl) auf ein TAE-Agarosegel auf (Gelkammer mit 2 x 12 Taschen). Tragen Sie auch 3 µl (150 ng) einer Positivkontrolle (Größenstandard vom Assistenten) auf. Anhand des Gelfotos können Sie den Erfolg des Restriktionsverdaus überprüfen: Falls Ihre AüN-Probe komplett verdaut ist, geben Sie 8 µl Blaumarker zum Eppi R und beschriften Sie dieses nun mit Größenstandard, λ EcoRI/HindIII, Gruppennr., Datum und der DNA-Konzentration [ ng / µl ]. Die DNA- Konzentration verändert sich durch Zugabe des Blaumarkers (bitte berücksichtigen!) Auswertung 1B: Siehe Auswertungsformular. Die Zuordnung der theoretischen Fragmentgrößen zu den tatsächlich auf dem Gel sichtbaren Banden muss spätestens am Versuchstag 3 zweifelsfrei geklärt sein! Seite 7 von 59

8 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Versuch 2A: Nukleinsäurenisolation aus Zellkultur (Mensch) (Tag 1) Versuch 2B: DNA-Analyse mit UV-Spektrometrie (Tag 1) Versuch 2C: Quantitative Analyse der genomischen DNA (Mensch) (Tag 1) Versuch 2D: Qualitative Analyse mit Agarosegelelektrophorese (Tag 2) Am Beginn des molekularbiologischen Arbeitens steht die Isolation der Nukleinsäuren. Nukleinsäuren können aus verschiedensten Quellen wie Blut, Gewebe, Zellkulturen, Haarwurzeln oder auch aus fossilen Knochen gewonnen werden. Dabei stellen die unterschiedlichen Quellen und die unterschiedlichen Zielsetzungen zur weiteren Verwendung der isolierten Nukleinsäuren unterschiedliche Anforderungen an das Isolationsprotokoll. Im Versuchsteil 2A erlernen Sie die DNA-Isolation mittels Phenol/Chloroform-Extraktion. Mit dieser Standardmethode erhalten Sie in der Regel DNA in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung in einer anschließenden Polymerasekettenreaktion. Alternativ vertreiben heutzutage viele Hersteller DNA-Isolationskits, die auf den Einsatz von gesundheitsschädlichem Phenol/Chloroform verzichten und Nukleinsäuren über die selektive Bindung an eine Anionenaustauscher- oder Silicamatrix reinigen. Qualität und Quantität der isolierten DNA sollen in den anschließenden Versuchsteilen 2B- 2D bestimmt werden: Hierbei entscheidet sich, ob die von Ihnen isolierte DNA für die Verwendung in der Polymerasekettenreaktion (Versuch 4) geeignet ist: DNA-Moleküle werden durch mechanischen Scherkräfte fragmentiert oder von DNAsen in sehr kleine Bruchstücke zerlegt, welche sich je nach Größe des gewünschten PCR-Produktswomöglich nicht mehr mittels PCR amplifizieren lassen. Weiterhin kann die isolierte DNA in zu geringer Konzentration vorliegen oder durch Proteine und andere Stoffe verunreinigt sein, die die DNA-abhängige DNA-Polymerase hemmen können. Im Folgenden gibt die Agarosegelelektrophorese (2D) Aufschluss über Größe, die UV- Spektrophotometrie (2C) Aufschluss über Menge und Reinheit der isolierten DNA. DNA-Isolation Genomgrößen Mit diesem Spektrophotometer werden Sie arbeiten Manual für die Gelelektrophoresekammern Seite 8 von 59

9 Versuch 2A: DNA-Isolation aus Zellkultur (Mensch) Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Hausaufgaben (Tag 1): Zeichnen Sie einen Ausschnitt einer DNA-Doppelhelix mit der Sequenz AG inklusive Wasserstoffbrückenbindungen. Erläutern Sie die stoffliche Zusammensetzung der Biomembran. Zeichnen Sie die Strukturformel von Phosphatidylcholin. Bestimmen Sie den vollen Namen und die Strukturformel von SDS. Erklären Sie anhand einer Skizze dessen Wirkung auf Proteine bzw. Biomembranen. Erklären Sie Struktur und Funktion von Cadherin-Proteinen! Warum wird dem Lysepuffer EDTA zugesetzt und der ph 8,0 eingestellt? Welche Stoffe werden durch Phenol/Chloroform extrahiert? Füllen Sie Tabelle 2 aus! Ca. 5*10 6 Zellen (aus menschlicher Zellkultur) in einem 15 ml Falconröhrchen, 55 C Brutschrank, Tischzentrifuge für 2 ml Eppis, Pasteurpipette, Gilson-Pipetten, Bunsenbrenner; OmniRuptor Ultraschallhomogenisierer, 1 M Tris/HCl, ph 8,0, 0,5 M EDTA, 10% SDS (sodium dodecylsulfate), 20 mg/ ml Proteinase K, Isopropanol, (3 M NaAc, ph 5,2), 70% Ethanol, steriles H 2 O bidest, 25:24:1 Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1 Chloroform/Isoamylalkohol (in beiden Mischungen kann Chloroform auch durch Dichlormethan ersetzt werden) Durchführung (zu Beginn 1x4, dann 4x 1 Person ab Schritt 3): 1. Schritt: Puffer Die angegebenen Puffermengen reichen für acht Gruppen eines Versuchstages und müssen daher pro Versuchstag nur einmal angesetzt werden. Bereiten Sie 1,8 ml Resuspendierungspuffer und 36 ml Lysepuffer vor (Tab. 2). Tab. 2 DNA-Isolation aus menschlichen Zellen: Zusammensetzung von Resuspendierungsund Lysepuffer. Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration Volumen [µl] Resuspendierungspuffer EDTA 0,5 M 100 mm Tris/HCl, ph 8,0 1 M 100 mm H 2 O monodest ad 1,8 ml Lysepuffer SDS 10% 0,5% EDTA 0,5 M 100 mm Tris/HCl, ph 8,0 1 M 10 mm H 2 O monodest ad 36 ml 2. Schritt: Rohextrakt: Den 2. Schritt = Zellaufschluss und Herstellung des Rohextrakts soll eine 4er-Gruppe gemeinsam durchführen. Resuspendieren Sie 5*10 6 gefrorene Zellen in 200 µl Resuspendierungspuffer durch Auf- und Abpipettieren, bis die Suspension perfekt homogen erscheint. Geben Sie 4 ml Lysepuffer zu und mischen Sie durch kräftiges Vortexen (mindestens 1 min). Geben Sie 100 µg Proteinase K (20 mg / ml ) zu. Vortexen. Überführen Sie nun je 1 ml Probe in vier 2 ml Eppis. Die vier Proben sollen zum Zellaufschluss unterschiedlich weiter behandelt werden: 1. Inkubation bei Raumtemperatur (30 Minuten mit gelegentlichem Vortexen), 2. Inkubation bei 55 C (30 Minuten mit gelegentlichem Vortexen), 3. Zellaufschluss mit Ultraschall (OmniRuptor Pulse 50%, Power ca. 30, Time 15 sec) 4. Zellaufschluss mit Ultraschall (OmniRuptor Pulse 50%, Power ca. 30, Time 1 min) Seite 9 von 59

10 3. Schritt: Phenol/Chloroform-Extraktion Von nun an bearbeitet jeder Studierende 1 ml des Rohextrakts eigenständig. Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Unbedingt mit Handschuhen und Schutzbrille und unter dem Abzug arbeiten! Handschuhe bieten nur einen Spritzschutz! Das im Folgenden anfallende Phenol, Chloroform werden in entsprechenden Abfallbehältern (halogenierte Kohlenwasserstoffe) unterm Abzug gesammelt: Leeren Sie Eppis in den organischen Müll aus, lassen Sie die Eppis offen unter dem Abzug abdampfen! Legen Sie 1 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 mit einer eigens vom Assi bereitgestellten Gilson-Pipette vor und geben Sie je 1 ml Rohextrakt zu. Verschließen Sie das Eppi gut und testen Sie mit Filterpapier, ob das Eppi auch dicht verschlossen ist. Mischen Sie die beiden Phasen ordentlich für mindestens 2 min. Trennen Sie die Phasen in einer Tischzentrifuge bei 7000 rpm, 5 min Nehmen Sie den Überstand vorsichtig aber möglichst vollständig mit einer blauen Gilson-Pipette ab und überführen Sie ihn in ein frisches 2 ml Eppi Geben Sie ein gleiches Volumen Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 zu und wiederholen Sie die in der Phenol/Chloroformextraktion angegebenen Schritte mit einer wichtigen Änderung: Dieses Mal darf keinesfalls untere oder Interphase überführt werden! Deswegen überführen Sie nur 600 µl des Überstandes in ein frisches 2 ml Eppi. Vor dem Ausfällen der DNA das Eppi unbedingt den Assistenten zeigen (Qualitätskontrolle). 4. Schritt: Ausfällen der DNA Überschichten Sie die Probe vorsichtig mit 0,75 Volumenanteilen Isopropanol (auf die oft übliche Zugabe von Natriumacetat zum Fällen von DNA kann in diesem Experiment verzichtet werden). Mischen Sie die Phasen durch langsames Umdrehen (30-50 Mal) und beobachten Sie dabei die Vorgänge an der Grenzfläche: Die DNA fällt in Fäden aus! Die DNA kann durch Zentrifugieren und/oder Angeln mit einem Glashaken gewonnen werden: Glashaken herstellen (nur, falls Sie tatsächlich ausgefallene DNA mit bloßem Auge erkennen können): Die Spitze einer Pasteurpipette in der Bunsenbrennerflamme verflüssigen und durch die Schwerkraft zu einem Haken formen. Die DNA mit dem Glashaken angeln und am Glashaken 5 min in 70% Ethanol waschen: Legen Sie dafür ca. 1 ml 70% Ethanol in einem 2 ml Eppi vor und stellen Sie den Glashaken mit der DNA hinein. Keine Angst, die DNA lässt den Glashaken nicht los (nur in seltenen Fällen ). Die DNA am Glashaken ca. 10 min im 55 C-Brutschrank trocknen lassen: Markieren Sie dazu den Glashaken am Übergang von dickem Ende und Spitze und stellen sie ihn mit dem dicken Ende in einen dafür vorgesehenen Ständer im Brutschrank 100 µl H 2 O dest, nukelasefrei in einem 2 ml Eppi vorlegen und darin die DNA vom Glashaken lösen (ca. eine Minute rühren). Um die Ausbeute zu erhöhen, wird DNA, die sich nicht am Glashaken befindet, durch Zentrifugieren ( rpm, 5 min) pelletiert. Den Überstand vorsichtig mit einer blauen Pipettenspitze abnehmen, 1 ml 70% Ethanol auf das Pellet geben und das Eppi 2x vorsichtig umdrehen, so dass das Ethanol alle Gefäßwände berührt hat. Das Eppi 5 min am Platz stehen lassen. Das Eppi bei rpm 5 min lang zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer blauen Pipettenspitze abnehmen. Restliche Flüssigkeit per quick-run (3 sec) am Eppiboden sammeln und danach mit weißer Pipettenspitze vollständig entfernen. Das Eppi nun 10 min offen in den 55 C-Brutschrank stellen, um restliches Ethanol zu verdampfen. 100 µl H 2 O dest, nukelasefrei zum Pellet geben und das Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lösen. Beschriften Sie die Eppis akkurat mit einem Stück Papier, nachdem Sie die DNA-Konzentration (Versuch 2C) bestimmt haben: Gen. DNA Mensch, Haken oder Pellet, Konzentration, Gruppennummer, Datum Lagern Sie die DNA-Proben bei 4 C. Auswertung 2A: Siehe Auswertungsformular. Seite 10 von 59

11 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Versuch 2B: UV-Spektrometrie - Bestimmen der optimalen Wellenlänge zur DNA-Analyse Hausaufgaben (Tag 1): Weshalb absorbieren Nukleotide bzw. Proteine UV-Licht? Welche ist die haploide Genomgröße des Menschen in Basenpaaren [bp]? Bestimmen Sie das durchschnittliche Gewicht eines Basenpaares aus der Literatur. Berechnen Sie selbst wie viel pg DNA in einer einzigen Zelle enthalten sind! Beweisen Sie, dass die DNA-Stränge einer einzigen Zelle zusammengenommen etwa 2 m lang sind. JASCO V-630 Spektrophotometer, Software: Spectra Manager, 2 UV-geeignete Küvetten, λ-dna (0,3 mg / ml ), BSA (bovine serum albumin, 20 mg / ml ), destilliertes Wasser Durchführung: Bereiten Sie je 500 µl folgender drei Arbeitslösungen vor: λ-dna (10 µg / ml ), BSA (200 µg / ml ) und ein Gemisch beider Stoffe (Endkonzentration 10 µg / ml DNA und 200 µg / ml BSA) Nehmen Sie die Absorptionsspektren von λ-dna (10 µg / ml ), BSA (200 µg / ml ) und dem Gemisch beider Stoffe (10 µg / ml DNA, 200 µg / ml BSA) jeweils im Wellenlängenbereich von 240 nm bis 300 nm auf. Speichern Sie die Spektren. Starten Sie den Computer und öffnen Sie das Programm JascoSpectra Manager. Wählen Sie in der linken Programmleiste mit einem Doppelklick Spectra Measurement (Abb. 1, blau markiert + blauer Pfeil) aus, um das Programm zur Aufnahme einer Spektrumsmessung über ein Wellenlängenintervall bei konstanter Temperatur zu starten. Abb. 1: Ansicht der Spectra Manager Fensters. Das Spectra Measurement Programm (blauer Pfeil) ist in Versuch 2B zu verwenden, Temperature Programming Measurement (roter Pfeil) wird in Versuch 8 verwendet werden. Seite 11 von 59

12 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Es öffnet sich das Kontrollfenster für das Spectra Measurement Programm (Abb. 2). Abb. 2: Bedienung des Spectra Measurement Programms. Im oberen Teil des Fensters (Abb. 2, violetter Pfeil) sehen Sie die aktuell eingestellte Wellenlänge in nm sowie die gemessene Absorption. Die Parameteranzeige (Abb. 2, roter Pfeil) zeigt Ihnen die aktuell verwendeten Einstellungen an. Besonderes Augenmerk ist hierbei auf die Temperaturanzeige des Sample-Holders (Abb. 2, grüner Pfeil) zu legen. Kontrollieren Sie die Temperaturanzeige gelegentlich, um Fehlfunktionen des Geräts rechtzeitig zu bemerken und informieren Sie im Falle unerwarteter Messwerte einen Betreuer. In der oberen Leiste ist für das Experiment nur die Kategorie Measure (Abb. 2, blauer Pfeil) wichtig. Wählen Sie unter Measure die Option Parameters, um die Messparameter einzustellen wie in Abb. 3 vorgegeben: Abb. 3: Einstellung der Parameter für die Spektrenmessung. Stellen Sie die Parameter entsprechend der Abbildung ein. Geben Sie in den mit einem roten Pfeil markierten Sample name Spektrum + Ihre Gruppennummer und bei Operator Ihre Gruppennummer ein. Seite 12 von 59

13 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Füllen Sie nun beide Küvetten mit ca. 400 µl destilliertem Wasser und stellen Sie die Probenküvette (verschlossen mit Deckel) in den vorderen sowie die Referenzküvette in den hinteren Probenhalter. Die Referenzküvette verbleibt während beider Versuchsteile mit Wasser gefüllt im hinteren Probenhalter. Nach Schließen der Probenkammerabdeckung und des Gerätedeckels können Sie durch einen Klick auf Auto Zero (Abb. 2, schwarzer Pfeil rechts) die aktuell gemessene Absorption (auf Experimentalaufbau und Küvetteneigenschaften zurückzuführen) gleich 0 setzen. Unter Measure Baseline nehmen Sie nun eine Grundlinie auf, die von der später folgenden Messung mit den Proben automatisch abgezogen wird. Nachdem die Grundlinienmessung abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Probenküvette aus dem vorderen Probenhalter, entleeren sie diese und füllen Sie 400 µl der λ-dna-lösung (10 µg / µl ) ein. Verschließen Sie danach die Küvette und stellen Sie diese in den vorderen Probenhalter. Nun verschließen Sie Probenkammerabdeckung und Gerätdeckel und wählen im Programmfenster Measure Sample um das Spektrum aufzunehmen. Wiederholen Sie die Messung mit BSA (200 µg / ml ) und der DNA-Protein-Mischung. Nach erfolgreicher Aufnahme des Spektrums öffnet sich automatisch das Fenster Spectra Analysis (Abb. 4): Abb. 4: Spectra Analysis Fenster zur Bestimmung des Peaks des Spektrums. Wählen Sie Processing Peak Processing Peak find aus, um die Wellenlänge der maximalen Absorption der Proben zu bestimmen. Auswertung 2B: Werten Sie die Spektren noch im Labor wie folgt aus: Bestimmen Sie jeweils die Wellenlängen mit der maximalen Absorption für DNA bzw. BSA. Bestimmen Sie für reine λ-dna und für die DNA-BSA-Mischung das Absorptionsverhältnis OD 260 / OD 280. Leiten Sie für die reine λ-dna eine lineare Beziehung zwischen Absorption (A) und DNA-Konzentration (c) ab, d.h. bestimmen Sie x in der Gleichung A*x=c. Vergleichen Sie x mit dem Literaturwert! Bestimmen Sie anhand dieser Beziehung die scheinbare DNA-Konzentration in der DNA-BSA-Mischung. Welchem Bruchteil [%] entspricht die tatsächlich enthaltene DNA-Menge? Versuch 2C: Quantitative Analyse der genomischen DNA (Mensch) Gilson-Pipette P10, Nanophotometer (Implen oder WPA), isolierte DNA aus Versuch 2A Durchführung (4x 1 Person): Notieren Sie sich genau das verwendete Photometer und zugehörige Software-Programm! Verwenden Sie 4 µl destilliertes Wasser als blank. Jeder Studierende vermisst die Proben der selbst isolierten genomischen DNA: Geben Sie 4 µl der DNA- Lösung auf die Label Guard Messzelle. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblase gebildet hat. Setzen Sie den Deckel mit Lid-Faktor 10 korrekt auf. Bestimmen und notieren Sie die Absorption OD 260, OD 280 und den Quotienten OD 260/280. Die Messzelle und Deckel einfach mit einem fusselfreien Tuch abwischen; am Ende des Tages zusätzlich noch mit destilliertem Wasser putzen. Auswertung 2C: Siehe Auswertungsformular. Seite 13 von 59

14 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren Versuch 2D: Agarosegelelektrophorese (qualitative Analyse der gen. DNA) Hausaufgaben (Tag 2): Wie unterscheidet sich Agar von Agarose? Skizzieren Sie die Monomere von Agarose. Welchen Effekt hat die Agarosekonzentration bei der Trennung der DNA-Moleküle? Was bedeutet Interkalation? Fertigen Sie eine Skizze an! Wie kann man sich die kanzerogene Wirkung von Ethidiumbromid erklären? Pro 4er-Gruppe einen USB-Stick und Laptop mitbringen! Wissenswertes zum Umgang mit und zur Entsorgung von Ethidiumbromid Waage, Gelkammer, Kamm, Spacer, Spannungsgerät; Bilddokumentation (BioDoc-IT, LTF), Agarose, TAE- Puffer (40 mm Tris/HAc, ph 8, 0, 1 mm EDTA), Blaumarker (50% Glycerol, 0,8% Bromphenolblau, 1 mm EDTA), Ethidiumbromid (EtBr Stammlösung 1 mg / ml ) Durchführung (2x 2 Person): Vorsicht Siedeverzug: Schutzbrille, Isohandschuhe Vorsicht konzentriertes Ethidiumbromid: Handschuhe, Assistentenaufsicht Anfangs bereiten zwei Gruppen zwei Flaschen mit je 200 ml Gellösung vor (Schritt 1). Im Laufe des Praktikums müssen verbrauchte Lösungen von anderen Gruppen neu angesetzt werden. Jede Gruppe braucht zwei Midi-Gelkammern mit 2 x 12 Spuren (Abb. 5)! 1. Schritt: Agarosegel vorbereiten Bereiten Sie in zwei Glasflaschen je 200 ml einer 1,5% (w/v) Agaroselösung vor: Legen Sie 200 ml TAE- Puffer vor und geben Sie die entsprechende Menge Agarose zu. Lösen Sie die Agarose durch Kochen in der Mikrowelle. Überprüfen Sie durch vorsichtiges Schwenken, ob die Agarose vollständig gelöst ist. Lösung min bei RT abkühlen lassen, gelegentlich schwenken. Zu beiden Flaschen je 20 µl EtBr (Stammlösung: 1 mg / ml ) zugeben und beide Lösungen bei 55 C lagern. 2. Schritt: Agarosegel gießen Gelkammer und zwei Kämme (je 12 Zähne) in Gelgießschiene einsetzen, auf ca. 55 C abgekühltes Agarosegel etwa 4 mm dick eingießen (, so dass der Boden gerade bedeckt ist). Gelkammer bis zum Erhärten des Gels nicht bewegen. Die restliche noch flüssige Agarose weiter bei 55 C lagern. 3. Schritt: Proben vorbereiten A) genomische DNA Genomische DNA ist nach vier verschiedenen Methoden isoliert worden. Der Einfluss der Isolationsmethode auf die Qualität der DNA soll auf den Agarosegelen untersucht werden: dazu bereitet jeder Student von seiner höchst konzentrierten DNA-Probe (entweder Glashaken oder Pellet) verschiedene Verdünnungen (G1-G5) für das Auftragen vor: Erstellen Sie dazu fünf verschiedene Verdünnungen (je 20 µl Endvolumen): 75 ng / µl, 25 ng / µl, 2,5 ng / µl, 250 pg / µl, 25 pg / µl. Beschriften Sie fünf Eppis mit G1-G5 und legen Sie darin je 8 µl der entsprechenden DNA-Verdünnung vor (G1 enthält die größte DNA-Menge, G5 die geringste). Mischen Sie die DNA mit 1 µl H 2 O und 1 µl Blaumarker. B) Restriktionsverdau Bereiten Sie auch die Proben des Größenstandards vor (Versuch 1B)! Seite 14 von 59

15 Versuch 2: Isolation und Analyse von Nukleinsäuren 4. Schritt: Agarosegel beladen und Elektrophorese starten Kamm aus Gelkammer entfernen und gut abspülen. Gelkammer in Laufkammer einsetzen und mit TAE- Puffer auffüllen, etwa 1 mm über das Gel. Proben mit ruhiger Hand in die Taschen pipettieren (Vorsicht nicht zu tief in die Tasche eintauchen, also nicht durch das Gel stechen!). Jede 2er-Gruppe belädt genau wie in Abb. 5 angegeben ein mit Ethidiumbromid versetztes Gel mit: Jeweils 5 µl A0-A60 und R0,5-R3 (Versuch 1) (Wie viel DNA [ng] tragen Sie auf?) jeweils 5 µl aus G1-G5 (Versuch 2) (Wie viel DNA [ng] tragen Sie auf?) 3 µl Größenstandard (150 ng), der hier vom Assistenten ausgeteilt wird und auch als Positivkontrolle für den selbst angesetzten Größenstandard (Versuch 1) dient. Obere Reihe (Versuch 1) Tasche Probe A0 A5 A15 A60 λ R3 R2 R1 R0,5 Untere Reihe (Versuch 2 DNA von Person 1 und Person 2) Tasche Probe G1 G2 G3 G4 G5 λ G1 G2 G3 G4 G5 + Abb. 5 Genomische DNA aus menschlichen Zellen: Beladungsschema des mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels. Die Spuren G1-G5 werden mit unterschiedlichen Mengen und unterschiedlichen Proben genomischer DNA beladen. Die Spuren A0-A60 und R werden mit den Proben des eigenen Größenstandards beladen. Die Spur λ wird mit 150 ng Größenstandard vom Assistenten (λ DNA geschnitten mit EcoRI/HindIII) beladen. Die Orientierung von Plus- und Minuspol sind rechts angegeben. Die dunkelblauen Balken zeigen die angestrebte Laufweite des Blaumarkers an. Elektroden nach reiflicher Überlegung anlegen. Spannung einstellen: ~10 V / cm Gellänge. Nach Rücksprache mit dem Assistenten können Sie den Lauf beenden (, wenn der Blaumarker ca. 3/4 des Gels durchlaufen hat). 5. Schritt: Agarosegel dokumentieren Gele zusammen mit dem Plastikschlitten, auf dem das Gel gegossen wurde, zur Geldokumentationsanlage transportieren und das Bild aufnehmen. Dazu brauchen Sie einen virusfreien USB-Stick und einen Laptop pro Gruppe zur Auswertung vor Ort! Auswertung 2D: Siehe Auswertungsformular. Seite 15 von 59

16 Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3A: Isolation von Plasmid DNA aus E. coli (Tag 1) Versuch 3B: Quantifizierung der Plasmid DNA mit UV-Spektrometrie (Tag 1) Versuch 3C: Restriktionsverdau mit blunt end Restriktionsenzym (Tag 2) Versuch 3D: Überprüfen des Restriktionsverdaus auf einem Agarosegel (Tag 3) Versuch 3E: Reinigung des blunt end Vektors (Tag 3) Versuch 3F: Erzeugen von T-Überhängen (Tag 3) Versuch 3G: Reinigung des T-Vektors (Tag 4) DNA-Fragmente werden aus verschiedenen Gründen in (unterschiedliche) Vektoren kloniert, z.b. zum Erstellen einer Genbank, zur Expression von rekombinanten Proteinen oder zur einfachen Lagerung und Verfügbarkeit des DNA-Fragments. Inzwischen existiert eine Vielzahl anwendungsbezogener Vektoren und entsprechender E. coli Wirtsstämme, die käuflich erworben werden können. T-Vektoren sind besonders für das Klonieren von PCR-Produkten geeignet und werden meist in PCR cloning kits verkauft, so z.b. pgem T-Vektor (Promega) oder pdrive (Qiagen). In diesem Versuchsteil soll ein solcher Klonierungsvektor für PCR Produkte ausgehend von pbluescript II SK (Stratagene) in mehreren Schritten selbst hergestellt werden. Die Güte Ihres Vektors zeigt sich aber erst nach Ligation und Transformation in E. coli (Versuche 5 und 6). Hausaufgaben (Tag 2): Was versteht man unter einem Klonierungsvektor? Was unter einem Expressionsvektor? Welche funktionellen Elemente befinden sich auf einem Klonierungsvektor, z.b. pbluescript? Erklären Sie deren Funktion! Besorgen Sie sich aus dem Internet die Vektorkarte und die komplette Sequenz des pbluescript II SK Plasmids (Stratagene)! Erklären Sie den Begriff T-Vektor (oder T/A-cloning )! Bestimmen Sie alle Restriktionsenzyme in der multiple cloning site von pbluescript SK II, die glatte Enden erzeugen! Bestimmen Sie zu diesen ebenfalls die geeigneten Reaktionsbedingungen und die zugehörigen NEB-Puffer (New England Bioloabs)! Literatur: Francisco Bolivar, Raymond L. Rodriguez, Patricia J. Greene,Mary C. Betlach, Herbert L. Heyneker, Herbert W. Boyer (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles II. A multipurpose cloning system. Gene 2, (summary und introduction genügen) Seite 16 von 59

17 Versuch 3A: Isolation von Plasmid DNA aus E. coli Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Mit pbluescript II SK (Stratagene) transformierte E. coli SURE; GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) Durchführung (2x2 Personen): Orientieren Sie sich bei der Durchführung am Herstellerprotokoll und beachten Sie die zusätzlichen Hinweise in diesem Skript. Zusätzliche Hinweise zum Herstellerprotokoll: Start der Plasmidisolation: Die beiden 2-er Gruppen einer Laborbank teilen sich eine Zentrifuge und sollten die zwar kurzen aber häufigen Zentrifugationsschritte gemeinsam durchführen! Ernten Sie insgesamt 3 ml Zellen einer ÜNK durch Zentrifugieren: Geben Sie dazu 1,5 ml E. coli in ein 2 ml-eppi, zentrifugieren Sie 5 min bei rpm. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie erneut 1,5 ml E. coli zu und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie das überstehende Medium durch Abkippen, danach kurzes Zentrifugieren ("quick run") und nachfolgendes Abpipettieren möglichst vollständig. Folgen Sie nun sehr genau dem Herstellerprotokoll! Ende der Plasmidisolation: Eluieren Sie schließlich die Plasmid-DNA in 50 µl Elutionspuffer. Fahren Sie fort mit Versuch 3B und bestimmen Sie die DNA-Konzentration. Versuch 3B: Quantifizierung der Plasmid DNA mit UV-Spektrometrie Selbst isoliertes pbluescript Plasmid, H 2 O dest Durchführung (2x2 Personen): Bestimmen Sie die DNA-Konzentration des isolierten Plasmids (3A) im UV-Spektrophotometer. Beschriften Sie Ihre Plasmid-DNA akkurat ( pbluescript SK II, Konzentration, Gruppennummer, Datum ) und lagern Sie diese über Nacht bei 4 C. Auswertung 3B: Siehe Auswertungsformular. Seite 17 von 59

18 Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3C: Restriktionsverdau mit blunt end Restriktionsenzym pbluescript (Stratagene), blunt end Restriktionsenzym, NEB buffer System, 25 C oder 37 C Brutschrank, H 2 O bidest Durchführung (2x2 Personen): Überprüfen Sie mit der Pipette zunächst, wie viele µl Plasmid-DNA Ihnen zur Verfügung stehen! Schneiden Sie nun möglichst viel pbluescript Plasmid mit einem geeigneten Restriktionsenzym, unter geeigneten Reaktionsbedingungen in 50 µl-100 µl Reaktionsvolumen. Es ist sinnvoll, für die beiden Ansätze der Zweiergruppen unterschiedliche Enzyme zu verwenden. Beachten Sie auch, wenigstens 1 µg Plasmid-DNA pro Reaktion einzusetzen. Füllen Sie Tab. 3 aus und erklären Sie dem Assistenten Ihre Entscheidungen! Tab. 3 Produktion eines blunt end Vektors: Zusammensetzung des Restriktionsverdaus zur Erzeugung glatter Enden. Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration bzw. Menge pbluescript II SK (1-) 4 µg Reaktionspuffer 10-fach (welcher?) Restriktionsenzym (welches?) H 2 O bidest - ad 50 µl -(100 µl ) Volumen [µl] Beschriften Sie das Eppi ( pbluescript SK II, geschnitten mit Restriktionsenzym, Konzentration, Gruppennummer, Datum ) akkurat. Mischen und inkubieren Sie den Ansatz bei geeigneter Reaktionstemperatur über Nacht. Nach erfolgreichem Verdau lagern Sie die geschnitten Plasmide bei 4 C. Versuch 3D: Überprüfen des Restriktionsverdaus auf einem Agarosegel pbluescript II SK (Stratagene), geschnitten und ungeschnitten, 1,5% Agarosegel, Blaumarker, H 2 O bidest Durchführung (2x2 Personen): Überprüfen Sie die Restriktion auf einem 1,5% Agarosegel: tragen Sie dazu etwa 100 ng geschnittenes Plasmid neben 100 ng ungeschnittenem Plasmid und 150 ng Größenstandard auf. Zwei Vierergruppen einer Laborbox teilen sich dafür ein Gel mit je 12 Spuren! Auswertung 3D Siehe Auswertungsformular. Seite 18 von 59

19 Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3E: Reinigung des blunt end Vektors pbluescript II SK (Stratagene), geschnitten mit blunt end Restriktionsenzym, GeneJet PCR Purification Kit (Thermo Scientific), 2 ml und 1,5 ml Eppis, Tischzentrifuge, 55 C-Wärmeschrank; TE-Puffer, ph 7,5 (10 mm Tris, 1 mm EDTA), 70% EtOH Durchführung (2x2 Personen): Überführen Sie den (erfolgreichen) Restriktionsansatz in ein 1,5 ml Eppi und ergänzen Sie das Volumen auf 100 µl mit TE-Puffer, ph 7,5 Orientieren Sie sich nun bei der Durchführung am Herstellerprotokoll und beachten Sie die folgenden zusätzlichen Hinweise: Die Zentrifugationsschritte machen die beiden Gruppen einer Laborbox gemeinsam. Fassen Sie die Säule nicht direkt sondern nur zusammen mit dem Auffanggefäß an. Beachten Sie, die Membran der Säule bei den folgenden Pipettierschritten nicht zu verletzten. Eluieren Sie am Ende in 50 µl Elutionspuffer. Überprüfen Sie mit einer Pipette das Volumen des Eluats. Heben Sie das Auffanggefäß auf, es kann wieder verwendet werden. Beschriften Sie die Probe akkurat ( pbluescript SK II, geschnitten mit Restriktionsenzym, gereinigt, ungefähre Konzentration, Gruppennummer, Datum ), Volumen des Eluats usw. Lagern Sie den blunt end Vektor bei 4 C für Versuch 5A. Versuch 3F: Erzeugen von T-Überhängen pbluescript (Stratagene), geschnitten mit blunt end Restriktionsenzym und gereinigt, 10-fach PCR Puffer complete, dttp, Taq-DNA-Polymerase 0,2 ml Eppi, Thermocycler, steriles H 2 O bidest Durchführung (2x2 Personen): Mischen Sie folgende Reagenzien in einem 0,2 ml Eppi (Tab 4). Dieses Eppi nur mit Filzstift beschriften, nicht mit Papier und Tesa! Tab. 4 T-Vektor Produktion: Reaktionsansatz zur Erzeugung von T-Überhängen. Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration bzw. Volumen [µl] Menge pbluescript II SK Ca.? Ca.? * 10-fach PCR- 10-fach 1-fach Puffer (complete) dttp 10 mm 400 µm Taq-Polymerase 5 Units / µl 1 Unit H 2 O bidest - ad 30 µl * Halbes Volumen aus 3E Inkubieren Sie die Probe im Thermocycler bei 72 C für mindestens 45 min Lagern Sie das Produkt bei 4 C. Seite 19 von 59

20 Versuch 3: Herstellen eines T-Vektors Versuch 3G: Reinigung des T-Vektors T-Vektor, GeneJet PCR Purification Kit (Fermentas), 2 ml und 1,5 ml Eppis, Tischzentrifuge, 55 C- Wärmeschrank; TE-Puffer, ph 7,5, 70% EtOH Durchführung (2x2 Personen): Überführen Sie den T-Vektor in ein 1,5 ml Eppi und ergänzen Sie das Volumen auf 100 µl mit TE-Puffer, ph 7,5 Fahren Sie mit der Reinigung fort genau wie in Versuch 3E beschrieben. Um Zeit zu sparen, führen Sie diese Reinigung zusammen mit den Proben aus Versuch 4C durch. Eluieren Sie jeweils in 50 µl Elutionspuffer. Beschriften Sie das Eppi ( pbluescript SK II + T, Name des Restriktionsenzyms, mit welchem geschnitten wurde, ungefähre Konzentration, Gruppennummer, Datum ) Seite 20 von 59

21 Versuch 4: Polymerase Chain Reaction (PCR) Versuch 4: Polymerase Chain Reaction (PCR) Versuch 4A: Gradienten-PCR Temperatur (Tag 3) Versuch 4B: Gradienten-PCR MgCl 2 -Konzentration (Tag 3) Versuch 4C: Reinigung des PCR-Produkts (Tag 4) Die Polymerasenkettenreaktion dient der gezielten Vermehrung eines zuvor ausgewählten DNA-Abschnitts. Die flankierenden Bereiche des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts müssen bekannt (und im Genom einzigartig) sein und dienen den beiden Primern als spezifische Hybridisierungsstelle. Standard PCRs werden mit rekombinanter, hitzestabiler Taq-DNA-Polymerase durchgeführt und erzeugen Amplifikate bis zu 5 kb Länge. Für größere und/oder möglichst fehlerfreie Amplifikate müssen andere, eventuell modifizierte DNA-Polymerasen eingesetzt werden. In diesem Versuch amplifizieren Sie Abschnitte des CYP2C19 Gens. Dabei sollen Sie mittels Gradienten-PCR empirisch die optimale Annealing Temperatur sowie die optimale MgCl 2 -Konzentration für ein gegebenes Primerpaar bestimmen. In den darauffolgenden Versuchen soll das PCR-Produkt kloniert, sequenziert und am PC analysiert werden. Literatur: Randall K. Saiki, Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim (1985) Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 230, (aus historischen Gründen, nicht klausurrelevant) Seite 21 von 59

22 Versuch 4: Polymerase Chain Reaction (PCR) Hausaufgaben: (Tag 3) Aus welchem Organismus stammt die Taq-DNA-Polymerase? Ordnen Sie diesen Organismus im Stammbaum des Lebens ein! Aus wie vielen Aminosäuren und Domänen besteht die Taq-DNA-Polymerase? Wie schnell arbeitet die Taq-DNA-Polymerase [eingebaute dntps pro sec und Enzym]? Geben Sie Beispiele für proof-reading und non proof-reading Polymerasen! In welchen Funktionen unterscheiden sie sich? Zählen Sie alle Komponenten auf, die für eine erfolgreiche PCR notwendig sind und erklären sie deren Funktion! Brauchen DNA-Polymerasen Primer auch bei der natürlichen Replikation? Berechnen Sie die Anzahl der Produktmoleküle, die in einer PCR entstehen nach folgender Formel: N end = N start *(1+y) n N end : Anzahl Produktmoleküle nach der PCR N start : Anzahl Matrizenmoleküle bei Start der PCR (setzen Sie 100 ng genomische DNA ein und gehen Sie von einem single copy gene aus! Was ist ein single copy gene?) y: Effizienz der Taq-DNA-Polymerase (hier 0,7) n: Anzahl der Zyklen Skizzieren Sie die in der Probe vorhandenen DNA-Stränge (Art und Menge!) nach null bis drei Zyklen. Gehen Sie dabei von einem einzigen Startmolekül aus. Beachten Sie, dass Produkte unterschiedlicher Länge gebildet werden und erklären Sie anhand Ihrer Skizze, weshalb sich mit zunehmender Zyklenzahl eine bestimmte Länge durchsetzt. Wie oft kann eine Primersequenz von 20 Basen rein zufällig in einem menschlichen Genom von 3*10 9 bp vorkommen? Welche vereinfachenden Annahmen machen Sie für diese Berechnung? Füllen Sie die Tabellen 5 und 6a,b aus! Machen Sie sich mit der BLAST Software vertraut (kostenfreien Zugang finden Sie bei verschiedenen Anbietern im Internet, z.b. NCBI). Versuchen Sie an Hand der Sequenz der von Ihnen eingesetzten Primer herauszufinden, welches DNA-Fragment Sie amplifizieren werden. Welchen Namen und welche Funktion hat das Gen? Bestimmen Sie die komplette Sequenz (Exons und Introngrenzen bzw. relevante Intronsequenz, wenn ein Primer darin bindet! des zugehörigen Gens und fügen Sie sie in dieses Formular ein (Accession number angeben)! Markieren Sie auf dem Ausdruck die Primersequenzen durch Unterstreichen und bestimmen Sie die theoretisch erwartete Größe des PCR-Produkts! Durchsuchen Sie hierfür die angegebene Datenbank mit dem Gen-Namen! Klicken Sie sich bis zu diesem oder einem ähnlichen Fenster durch click sequence (Ansicht Exons und Introns komplett) evtl. click configure this page (um Ansichtsoptionen einzustellen) danach: öffnen Sie eine transcript ID in einem neuen Fenster und click auf exons (Exon-Ansicht mit Introngrenzen) evtl. click configure this page (um Ansichtsoptionen einzustellen) Fügen Sie nun die Sequenzdaten zusammen, wie in der Aufgabe beschrieben! Seite 22 von 59

23 Versuch 4: Polymerase Chain Reaction (PCR) Versuch 4A: Gradienten-PCR Temperatur 0,2 ml und 0,5 ml Eppis, Tischzentrifuge, Thermocycler T-Gradient (Biometra) oder Labcycler (Sensoquest), dntps, Reaktionspuffer (inklusive MgCl 2 ), genomische DNA, Taq-DNA-Polymerase (Bioron), steriles H 2 O bidest. Primerpaare (5 3 ): HSCYP2C19F4 ggc tgt aat tgt taa ttc gag a HSCYP2C19R4 gcc tga tct ata ttg gga tat tc HSCYP2C19F5 tat cat ctt tga ttc tct tgt cag HSCYP2C19R5 cct tga cct gtt aaa cat ccg Durchführung (2x2 Personen): Die beiden Zweiergruppen sollten einmal mit dem Primerpaar 4 und einmal mit dem Primerpaar 5 arbeiten! Wählen Sie eine selbst isolierte DNA aus Versuch 2 und verdünnen Sie diese genomische menschliche DNA auf ca. 100 ng / µl. Das benötigte Gesamtvolumen für die Versuchsteile 4A und 4B beträgt ca. 50 µl-100 µl. Beschriften Sie sechs 0,2 ml Eppis (nur mit Edding, nicht mit Tesa und Papier! Jede Vierer-Gruppe wählt eine andere Eppi-Farbe, so dass die Proben nicht mit der Gruppennummer beschriftet werden müssen. Farbe merken!): 1.4, 2.4, 3.4, 4.4, 5.4, 6.4, sowie n4 und p4 für die Negativ- bzw. Positivkontrolle. Die andere Zweier-Gruppe beschriftet: 1.5, 2.5 usw.) Legen Sie jeweils 1 µl genomische DNA (ca. 100 ng) in den Eppis 1-6 vor, 1 µl H 2 Obidest. im Eppi n und 1 µl Kontroll-DNA (vom Assistenten) im Eppi p. Auf den Boden pipettieren! Bereiten Sie in einem 0,5 ml Eppi einen Master-Mix für neun Reaktionen (à 20 µl) vor: Berechnen Sie die nötigen Volumina und pipettieren Sie die Reagenzien zusammen (Tab. 5). Wählen Sie ein Primerpaar aus und notieren Sie sich die Namen der von Ihnen eingesetzten Primer! Haken Sie zugegebene Reagenzien ab! Geben Sie noch nicht die Taq-DNA-Polymerase zu! Tab. 5 Temperaturgradienten PCR: Zusammensetzung des Master-Mix. Die Endkonzentrationen sind jeweils für das Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl zu berechnen, auch wenn der Mix zunächst nur auf 19 µl angesetzt wird. Reagenz Stammkonzentration bzw. Menge pro rxn Endkonzentration H 2 O bidest - ad 19 µl PCR-Puffer 10-fach 1-fach (complete) dntp-mix 2,5 mm je dntp 200 µm je dntp Primer forward 10 µm 250 nm Primer reverse 10 µm 5 pmol Taq-Polymerase 5 Units / µl 0,75 Units Vol. [µl] pro rxn Vol. [µl] für 9 rxn Geben Sie nach Absprache mit dem Assistenen die Taq-DNA-Polymerase (Bioron) zum Master-Mix, mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Öffnen Sie alle Eppis mit vorgelegter Matrize. Mischen Sie den Mastermix durch Auf-und Abpipettieren mit der auf 19 µl eingestellten Pipette und verteilen Sie danach jeweils 19 µl des Master-Mix auf die einzelnen Eppis mit der Template-DNA (1 µl). Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt somit 20 µl. Fangen Sie bei der Negativ-Kontrolle an und hören Sie bei der Positiv-Kontrolle auf! Pipettieren Sie in den Deckel, keinesfalls auf den Boden, dann brauchen Sie die Spitze nicht zu wechseln! Stellen Sie die Eppis in geeignetem Adapter in die Zentrifuge auf symmetrische Auslastung achten! Zentrifugieren Sie per quick run für ~5 sec die Flüssigkeit auf den Boden. Seite 23 von 59