The world leader in serving science. Hygienemonitoring mit dem BAX - Kit Listeria spp.

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1 The world leader in serving science Hygienemonitoring mit dem BAX - Kit Listeria spp.

2 Gliederung Einleitung Das BAX -PCR System Das PCR-Protokoll Hygienemonitoring mit dem neuen BAX -Kit Listeria spp. Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rrna 2

3 Die BAX -PCR BAX -System BAX -Kits + 3

4 BAX -PCR- Testkits Verfügbare Tests: Salmonella Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes 24 h Genus Listeria Genus Listeria 24 h Cronobacter (Enterobacter) sakazakii E. coli O157:H7 Hefen und Schimmelpilze Staphylococcus aureus Real-Time Campylobacter jejuni/coli/lari Real-Time Jedes Kit enthält 96 Tests: PCR Reaktionsgefäße mit alle PCR-Reagenzien Protease und Lysis-Puffer Genus Listeria Hygienemonitoring Reverse Transkriptase 4

5 Vorteile der BAX -PCR Einfache, unkomplizierte Durchführung Wenige manuelle Arbeitsschritte (< 1 min/probe) Automatische Auswertung Kürzere Analysezeiten 5

6 Probenmaterial Lebensmittel Fleisch/Fisch Schokolade Sonstige Proben Umgebungsproben Futtermittel Aromen Milch und Milchprodukte Gewürze Feinkost Getreide u. a. Lebensmittel 6

7 Gliederung Einleitung Das BAX -PCR System Das PCR-Protokoll 7

8 BAX - Protokoll (Kultur + PCR) Probe Anreicherung Zelllyse PCR Detektion + Analyse Pipettierschritte Keine DNA-Aufreinigung nötig DNA-Polymerase Primer Nukleotide Supplemente Fluoreszenzfarbstoff / Sonde Komplett automatische Interne Detektion Positivkontrolle und Analyse Kein Mastermix erforderlich Ja/Nein-Antwort zur Anwesenheit des Keims Lyophisierte Paralellanalyse Reagenzien Salmonella, E. coli, E. sakazakii, L. monocytogenes sehr geringes Kontaminationsrisiko 8

9 Nachweis von Salmonellen DIN EN ISO 6579:2003 Horizontales Verfahren Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser) Bebrütung:18±2 h bei 37 C 0,1 ml Kultur in 10 ml RVS-Bouillon 1 ml Kultur in 10 ml Mkttn-Bouillon 24±3 h bei 41,5 C 24±3 h bei 37 C Ausstreichen Bestätigen Bioch. Bestätigung 4 24h XLD-Medium + festes Medium nach Wahl 24±3 h bei 37 C charakteristische Kolonien von jeder Platte auf Nähragar 24±3 h bei 37 C Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 5 Tagen Serologische Bestätigung 9

10 Nachweis von Salmonellen aus Fleischproben mit der BAX PCR: Einfache Probenbearbeitung da keine DNA-Extraktion erforderlich ist Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser) Bebrütung: 18±2 h bei 37 C BAX -PCR Ergebnisse nach ~ 23 Stunden 10

11 Nachweis von L. monocytogenes DIN EN ISO :2005 Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser) Bebrütung: 24±3 h bei 30 C 0,1 ml der Kultur in 10 ml Fraser-Bouillon; Bebrütung: h bei 35 C 37 C Ausstreichen Ausstreichen auf Listerien-Agar nach Ottaviani und Agosti (Oxoid CM 1084) und ein zweites festes Medium nach Wahl Bebrütung h bei 37 C Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSYEA h bei 37 C Bestätigen Bestätigungsreaktionen: Gramfärbung Katalase Hämolyse CAMP-Test Rhamnose / Xylose Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6 Tagen 11

12 Nachweis von L. monocytogenes mit der BAX -PCR: Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser) Bebrütung: 24±3 h bei 30 C 100 µl in 9,9 ml MOPS-BLEB; Bebrütung: bei 35 C 37 C Einstufige Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in LEB-Bouillon) Bebrütung: > 24 h bei 30 C BAX -PCR Ergebnisse nach ~ 29 bis 41 Stunden 12

13 BAX -PCR Kits zum Nachweis von L. (monocytogenes) 2- stufige Anreicherung QB0610C (QB0609C) ½Fraser MOPS-Bleb 2,5 d 23 h, 30 ºC 22h, 35 ºC 1 - stufige Anreicherung QB8135C (QB8125C) LEB 1,5 d 24h, 37 ºC #QUA 18/05-07/08 NEU keine Anreicherung QB2912C Probennahme 8 h 4 h, 30 ºC 13

14 Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Taxonomie Umbenennung von Enterobacter sakazakii in eine neue Gattung Cronobacter spp. nov. Die Gattung Cronobacter umfasst die fünf Arten: C. sakazakii C. muytjensii C. dublinensis C. turicensis Cronobacter genomspecies 1 Von allen Arten geht eine Infektionsgefahr aus. 14

15 Nachweis von Enterobacter sakazakii DIN ISO TS 22964:2006 Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in Peptonwasser) Bebrütung:18±2 h bei 37 C 0,1 ml der Kultur in 10 ml mlst / Vancomycin; Bebrütung: 24 ±2 h bei 44 C Ausstreichen Ausstreichen auf selektivem chromogenen Agar ESIA (Alternative: DFI) Bebrütung 24 ± 2h bei44 C Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSA 48 ± 4h bei25 C Bestätigen Bestätigungsreaktionen: gelbes Pigment biochemische Charakterisierung (Microbact, RapID, API) Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6 Tagen 15

16 Nachweis von Enterobacter sakazakii mit der BAX PCR Anreicherung Probe homogenisieren (1:10 in mlst / Vancomycin) Bebrütung: bei 44 C 10 µl in 500 µl in BHI; Bebrütung: 3 h bei 37 C BAX -PCR Ergebnisse nach ~ 28 Stunden 16

17 ISO 6888:1 versus Bax-PCR Staphyloccous aureus Feste Probe 1:10 verd. 2 x 0,1 ml 10 g Probe in 90 ml Giolitti-Cantoni h, 37 ºC 2 Baird-Parker-Platten 24 +/- 2 h bei ºC Koloniezahl notieren 24 +/- 2 h bei ºC 5 verdächtige Kolonien in BHI Ergebnis: bis zu 4 d 24 +/- 2 h bei ºC Koagulasetest: 0,1 ml + 0,3 ml Kaninchenplasma 4-6h, ºC, wenn neg. weitere 24 h Inkubation < 24 h neg. und pos. Ergebnis 17

18 Hefen und Schimmelpilze (ISO DIS ) versus BAX -PCR Probe 1:10 Peptonwasser DRBC > 500 KbE/g 44 h, 25 ºC 5 d bei 25ºC Kolonienzählung 5 h 2,5 d pos. und neg. Ergebnis 18

19 Internationale Zertifikate AOAC International Official Method Salmonella # ; L. monocytogenes # AOAC-RI Performance Tested Method Salmonella #100201; L. monocytogenes #070202; L. spp #030502, 8 h Listeria ; E. coli O157:H7 #10401, E. coli O157:H7 MP # Campylobacter lari/coli/jejuni # 40702; S. aureus # USDA-FSIS Adoption Salmonella #MLG 4C.00; L. monocytogenes #MLG 8A.00, E. coli O157:H7 #MLG 5A.00 Health Canada Certification Salmonella #MFLP-29; L. monocytogenes #MFLP-28, L. spp. #MFLP-15e E. coli O157:H7 #MFLP-30; Enterobacter sakazakii #MFLP-27 AFNOR Certification Salmonella #QUA 18/3-11/02 NordVal Certification Salmonella # Brazil MAPA Official Reference Method Salmonella #MLG4C-01, L. monocytogenes #MLG 8A-01 Japanese Ministry of Health, Labour and Welfare Listeria sp.; L. monocytogenes 19

20 Gliederung Hygienemonitoring mit dem neuen BAX -Kit Listeria spp. Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rrna 20

21 Mögliche Kontaminationsquellen von Lebensmitteln 1. Kontaminierte Rohstoffe 2. Kontamination während der Verarbeitung 21

22 Hygienemonitoring 22

23 Die Gattung Listeria als Hygieneindikator L. grayi L. innocua L. ivanovii* L. seeligeri* L. welshimeri* L. monocytogenes* Ubiquitäre Verbreitung * Bei Infektionen beim Menschen nachgewiesen 23

24 Gliederung Hygienemonitoring mit dem neuen BAX -Kit Listeria spp. Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rrna Protokoll Inklusivität/Exklusivität Sensitivität 24

25 Reverse Transkriptase-PCR RNA DNA 25

26 70 S Ribosomen der Bakterien 30 S Untereinheit 21 Proteine + 16S rrna (~1540 bp) 50 S Untereinheit 34 Proteine + 5 S rrna (120 bp) 23 S rrna (~2900 bp) = Proteine (35%) = rrna (65%) rrna bis zu 15% der Zelltrockenmasse 26

27 Listeria sp.-kit Hygienemonitoring Normale PCR RT- PCR mit rrna als Target Etliche tausend Ribosomen/Zelle 27

28 Gliederung Hygienemonitoring mit dem neuen BAX -Kit Listeria spp. Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rrna Protokoll Inklusivität/Exklusivität Sensitivität 28

29 Schematische Darstellung des Protokolls DuPont Qualicon Wipe sterile DuPont Qualicon Wipe sterile Vortexer Agenz 2 Agenz 1 Vortexen und 35 min bei 37 C inkubieren. Danach mit Verdünnunspuffer verdünnen, 30 µl Lysat zu PCR-Gefäß geben und RT-PCR starten 29

30 BAX - Protokoll Hygienemonitoring Listeria sp. Zelllyse Stoffwechsel Zelllyse Reverse Transkriptase-PCR Detektion + Analyse 4 h, 30 C DNA-Polymerase Primer Nukleotide Supplemente Fluoreszenzfarbstoff Kontroll-DNA+Primer Reverse Transkriptase Ergebnis liegt nach 8 h vor 30

31 Ergebnisdarstellung nach < 3 h 31

32 Gliederung Hygienemonitoring mit dem neuen BAX -Kit Listeria spp. Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rrna Protokoll Inklusivität/Exklusivität Sensitivität 32

33 Inklusivität / Exklusivität Inklusivität (58 Isolate der Gattung Listeria) = 100% L. grayi L. innocua L. ivanovii L. seeligeri L. welshimeri L. monocytogenes Exklusivität (52 Nicht-Listeria-Isolate) = 100% 33

34 Sensitivität BAX System Q7 BAX System Classic KbE/ ml Puffer Spezies L. grayi subsp. grayi 0/4 0/4 L. grayi subsp. murayi 0/4 0/4 L. innocua 3/4 3/4 L. ivanovii L. monocytogenes L. seeligeri L. welshimeri Nachweisgrenze = < 10 1 KbE / ml (~ Zellen) 34

35 USDA-FSIS- Methode zum Nachweis von Listeria spp. auf Oberflächen 2 min 225 ml UVM ~100 cm 2 22 h, 30 C 100 µl zu 10 ml Fraser 48 h, 37 C MOX (100µl) Ergebnisse liegen erst nach bis zu 6 d vor 48 h, 37 C MicroID 35

36 Kulturmethode versus BAX -RT-PCR (Edelstahl) 100 µl BHI-Suspension auf 100 cm 2, h bei RT getrocknet BAX -System Q7 BAX -System Classic USDA/ FSIS n BAX pos. Best. Pos Bax Pos Best. Pos Ref. Pos L. ivanovii 5,6*10 4 / 100 cm Negativkontrolle L. monocytogenes 2 * 10 4 / 100 cm Negativkontrolle

37 Zusammenfassung BAX -RT-PCR-Kit Listeria spp. zum Hygienemonitoring Das bewährt einfache Protokoll der BAX -PCR ist nur geringfügig modifiziert Detektion über Schmelzkurvenanalyse Kein Anreicherungsschritt erforderlich Inklusivität/Exklusivität = 100 % Nachweisgrenze = 10 KbE/ ml Ergebnisse liegen bereits nach 8 h vor 37

38 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit 38