Alloreaktivität vorhersagen

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1 Alloreaktivität vorhersagen Dipl. Biol. Michaela Wolf Transplantations- und Infektionsimmunologie, AG Prof. M. Sester, Campus Homburg 23. Jahrestagung des Arbeitskreises Nierentransplantation der Deutschen Gesellschaft für Urologie

2 Abstoßungsreaktionen Hyperakut (innerhalb von Minuten) Akut (innerhalb von Tagen/Wochen) Chronisch (innerhalb von Monaten/Jahren)

3 Hyperakute Abstoßung bei Vorkommen von präformierten zytotoxischen Antikörpern Kissmeyer-Nielsen et al. (1966) The Lancet

4 Präformierte HLA-Antikörper Präformierte HLA-AK können entstehen durch immunisierende Ereignisse: Schwangerschaft Bluttransfusion Transplantation

5 Antikörper-vermittelte akute Abstoßung Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

6 Präformierte Antikörper vorhersagen Humoral bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch Antikörper-Vorhersage mittels: Mikrolymphozytotoxische Tests CDC-Crossmatch Flow-Crossmatch Festphasen-Immunassays ELISA Luminex

7 Mikrolymphozytotoxischer Test CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min Komplementzugabe, Inkubation für 120 min Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

8 Mikrolymphozytotoxischer Test CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min Komplementzugabe, Inkubation für 120 min Keine Lyse der Lymphozyten negativ Lyse der Spender Lymphozyten positiv Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

9 Mikrolymphozytotoxischer Test CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min Komplementzugabe, Inkubation für 120 min Negatives Testergebnis IgM AK anwesend Keine Lyse der Lymphozyten negativ Lyse der Spender Lymphozyten positiv DTT Behandlung (30 min) Positives Testergebnis IgG AK anwesend

10 Fluoreszenzmikroskopische Auswertung CDC-Crossmatch negatives Testergebnis intakte Zellen positives Testergebnis lysierte Zellen

11 Altermann (2006) Histol Histopathol 21: Bewertung CDC-Crossmatch Anteil toter Zellen TERASAKI Score Bewertung 0-10% 1 negativ 11-20% 2 zweifelhaft positiv 21-50% 4 schwach positiv 51-80% 6 positiv % 8 stark positiv 0 nicht auswertbar

12 Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Komplementzugabe CDC-Crossmatch Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min + Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders

13 Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Komplementzugabe CDC-Crossmatch Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min + Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG

14 Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch Serum vom Empfänger Komplementzugabe CDC-Crossmatch Inkubation bei RT oder 37 C für 60 min + Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG Flow-Crossmatch

15 Mikrolymphozytotoxischer Test B-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I + II Antikörpern T-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I Antikörpern beide Crossmatches messen die humorale/antikörper-vermittelte- Antwort

16 Festphasen Assay ELISA (eher historisch) Luminex (aktuell)

17 HLA Klasse I Ag ELISA (eher historisch)

18 Empfänger-Serum ELISA (eher historisch) Non anti-hla AK Donor spezifische anti-hla Klasse I AK vom Empfänger Donor AK im Empfängerserum HLA Klasse I Ag

19 Empfänger-Serum ELISA (eher historisch) Non anti-hla AK Donor spezifische anti-hla Klasse I AK vom Empfänger Substrat - Farbumschlag Enzymgekoppelter antihuman Ig AK Donor AK im Empfängerserum HLA Klasse I Ag

20 Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie Anstelle von ELISA-Platte Mikropartikel (Beads mit 2-6 μm Durchmesser) Beads haben eigene Fluoreszenzen und sind mit gereinigten HLA-Antigenen beladen Nachweis: Quantifizierung der Mikropartikelbindung der Anti-HLA-AK des Testserums durch Fluorophor-markierte anti-human-igg-sekundärantikörper Luminex Messgerät hat zwei Laser: der erste erkennt die farbkodierten Beads der zweite die darauf gebundenen sekundären AK mit Fluorophor-Phycoerythrin Mikro-Bead mit HLA-Antigenen Antigen Detektions- AK AK im zu untersuchenden Serum

21 Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie Screening Test verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II Single Antigen-Test erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK Einsatz bei immunisierten Patienten Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet. Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.

22 Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie Screening Test verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II Single Antigen-Test erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK Einsatz bei immunisierten Patienten Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet. Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.

23 Exemplarisches Ergebnis einer Luminex Analyse Institut für Immunologie und Genetik, Labor Thiele, Kaiserslautern

24 Prinzip Luminex - Bewertungskriterien A. Konvalinka and K. Tinckam (2015) J Am Soc Nephrol 26:

25 Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag HLA-AK Testung vor Tx Präexistierende HLA-AK können entstehen durch : Schwangerschaft Bluttransfusion Transplantation HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus ( I > 5% PRA; HI > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen ( hohe AK-Titer)

26 Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag HLA-AK Testung vor Tx Präexistierende HLA-AK können entstehen durch : Schwangerschaft Bluttransfusion Transplantation HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus ( I > 5% PRA; HI > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen ( hohe AK-Titer) HLA-AK Testung bei Tx Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB ) Negatives Crossmatch Voraussetzung

27 Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB )

28 Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB )

29 Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag HLA-AK Testung vor Tx Präexistierende HLA-AK können entstehen durch : Schwangerschaft Bluttransfusion Transplantation HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatuses ( I > 5% PRA; HI > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen ( hohe AK-Titer) HLA-AK Testung bei Tx Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB ) Negatives Crossmatch Voraussetzung HLA-AK Testung nach Tx Gibt noch keinen optimalen Zeitpunkt zur AK Testung Im Median treten de novo Donor-spezifische HLA AK (dndsa) 3,8-68 Monate nach Tx auf Vorhandensein von dndsa führt zu signifikant reduziertem Tx-Überleben

30 Wahrscheinlichkeit des Transplantatüberlebens Loupy (2013) N Engl J Med 69: Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA) grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle Jahre nach Transplantation

31 Wahrscheinlichkeit des Transplantatüberlebens Loupy (2013) N Engl J Med 69: Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA) grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle Jahre nach Transplantation

32 Vorhersage T Zell vermittelter Abstoßungen? Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

33 präformierte T-Zellen vorhersagen Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch: Limiting-Dilution Analyse Proliferationsassay - CFSE Langzeit-Assays (Proliferation von mehreren Tagen)

34 präformierte T-Zellen vorhersagen Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch: Limiting-Dilution Analyse Proliferationsassay - CFSE Langzeit-Assays (Proliferation von mehreren Tagen) ELISPOT AlloFlow Kurzzeit-Assays (8-24h)

35 Anti-IFNγ AK ELISPOT

36 ELISPOT Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen

37 ELISPOT Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen Sezerniertes IFNγ

38 ELISPOT Ergebnisse nach 16-24h Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen Sezerniertes IFNγ Enzymgekoppelter Sekundär-AK Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413:

39 ELISPOT - Bewertung Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413:

40 ELISPOT - Outcome Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18:

41 AlloFlow Vollblut-Assay Spender Empfänger 500µl LiHep Blut 700µl LiHep Blut + a-cd45 APC Waschen Waschen Je 500µl Blut vom Empfänger und Spender Spenderblut + Empfängerblut a-cd28 a-cd49d 1ml 2h Brefeldin A 4h Durchflusszytometrische Analyse Vorteile: Vollblut-Assay Geringes Probenvolumen 8h Zeitdauer Wolf et al., unpublished

42 CD45 CD69 AlloFlow Vollblut-Assay IFN-γ Spender reaktive CD4 oder CD8 T-Zellen Empfänger IFN-γ IFN-γ Wolf et al., unpublished

43 % alloreaktiver CD8 T-Zellen % alloreactive CD8 T-cells CD8 8 Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen Keine mediane Reaktivität Moderate mediane Reaktivität hohe mediane Reaktivität DL Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten dialysis patients Wolf et al., unpublished

44 Überblick / Ausblick Methoden zur Vorhersage von präformierten AK vor einer Transplantation sind sehr gut geeignet, um antikörperdominierte Abstoßungsreaktionen zu verhindern Methoden zur Vorhersage der zellulären Alloreaktivität waren bisher aufwendig und daher ungeeignet für die klinische Routine In 5-10% kommt es nach Tx zu T-zellulär vermittelten Abstoßungen Multicenter-Studie zu AlloFlow klinisches Outcome

45 Lieben Dank für Ihre Aufmerksamkeit Cynthia McKelvey (2015)