DNMR Dynamische NMR-Spektroskopie

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1 OC 8 Struktur, Eigenschaften und Reaktivität organischer Moleküle DNMR Dynamische NMR-Spektroskopie Rotation um Einfachbindungen Konformationeller und chemischer Austausch Armin Geyer Fachbereich Chemie Philipps-Universität Marburg SS

2 Gehinderte Rotation und Inversion Zahlreiche reversible molekulare Prozesse haben Aktivierungsbarrieren im Bereich von kcal/mol und zeigen daher temperaturabhängige 1 H-NMR-Spektren. Inversion von N-haltiger Dreiringe Rotation um partielle Doppelbindungen Gekoppelte Rotation um Einfachbindungen Molekulare Erkennung Aziridine Amide Ringinversion Cyclohexan Ligand-Rezeptor-Bindung (Medikamente) Man unterscheidet: Langsamer Austausch» t 1/2 1 oder schneller Austausch «t 1/2 1 wobei t 1/2 = mittlere Lebensdauer des Zustands (hier: Konformer, Topomer) Beispiel zur Mittelung chemischer Verschiebungen: Die beiden Singuletts eines primären Amids sind am 500 MHz-Spektrometer 1 ppm voneinander getrennt. Mit = 500 Hz muss die E/Z-Isomerisierung (Rotation um die C-N-Bindung) langsam sein und die Rotamere mittlere Lebensdauern von mindestens s = 2 ms besitzen. Beispiel Mittelung 3 J H,H -Kopplungskonstanten: 3 J H,H ~ 10 Hz t 1/2 ~ 10 1 s Unter langsam im Sinne der NMR-Zeitskala versteht man, daß die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante k r < / 2 ist ( = Signalaufspaltung ohne Austausch). langsam ist in diesem Sinne statistisch-kinetisch aufzufassen. Spricht man von langsamer Rotation, so heißt das, daß nur ein geringer Bruchteil der Moleküle in der Zeiteinheit die Energiebarriere überwinden kann. Die eigentliche Rotation ist für das einzelne Molekül jedoch wegen der geringen Trägheitsmomente sehr schnell. Man sollte demnach statt langsam besser selten sagen. Schnell wäre dann durch häufig zu ersetzen.

3 Dynamische NMR-Spektroskopie DNMR Aus dem Signalabstand bei tiefer Temperatur und der Temperaturabhängigkeit der Koaleszenz kann die Barriere berechnet werden. Koaleszenz sagt nur etwas über die Barriere eines Platzwechsels, jedoch nichts über den Mechanismus aus. Häufige Ursachen: Gehinderte Rotation um Einfach- oder partielle Dopelbindungen (Amide, Atropisomere etc.), Protonierungsgleichgewichte (Deprotonierung, Reprotonierung), Ligand- Rezeptor-Wechselwirkungen Weitere Ursachen: ax, äq Substituenten pyramidaler Komplexe uvm.

4 Komplexierung von Harnstoff und Acetat. Thioharnstoff komplexiert stärker Katalyse von Carbonylreaktionen mit Thioharnstoffderivaten

5 Molekulare Erkennung Affinität ist eine thermodynamische Gleichgewichtsgröße Nur Moleküle, die an einen Rezeptor binden, können Medikamente werden.

6 Correlated rotation N C rotation: exchange of H 21 and H 11 (H 21 and H 22) C N rotation: exchange of H 21 and H 22 (H 12 and H 12) receptor receptor Lactobacillus casei dihydrofolate reductase ligand ligand

7 Correlated rotation Feeney, FEBS Lett The side chain of Arginine: How many proton signals do we observe for guanidine? Conformational averaging of four NH signals at higher temperture to only one resonance signal. Fast... temperature receptor 40 C 40 C 30 C 30 C 1 C 1 C ligand...slow exchange

8 Konformation und Dynamik Giacomo Balla : Dynamism of a Dog on a Leash 1912

9 Time scales slow exchange :» t 1/2 1 fast exchange : «t 1/2 1 t 1/2 = half-life of state free observed bound

10 ligand protein The signals of the protein are too broad to be resolved Relaxation of NMR signals: matching frequencies The slow Brownian tumbling of proteins ( c ~ 10-9 s) matches the NMR frequency (10-9 Hz) while the fast tumbling of small molecules ( c ~ s) does not. long-lived excited states of small molecules sharp resonances short-lived excited states of large molecules broad resonances 2 2 c : correlation time The time necessary to rotate about one rad c c

11 Two signal sets: slow exchange B. J. Stockman et al., Science F NMR of a stremolysin/inhibitor complex. Slow exchange between free and bound ligand two signal sets Slow rotation about C C bond ortho fluorines are resolved F F F F F O AcNHCO N H N H N H N S S 100 s 1 ring flip rate

12 Line broadening: fast exchange... if you want to observe only the binding process with protein: 1 mm ligand (1) 100 M protein (224 kda IMPDH) K i ~ 60 M approx protein protons without protein: Line-broadening is semiquantitative: T 2 change and chemical shift change leads to different broadening for individual protons of the same ligand. M. Moore, Biopolymers 1999,

13 Mixture analysis Ligands: nicotinic acid, 2-phenoxy benzoic acid Protein: (40 kda MAP kinase) 5:1 ratio of ligands/protein Affinity: K D ~ 70 M Selective broadening and loss of signal intensity identify the component that binds to the receptor: benzoic acid withoutp rotein with protein M. Moore, Biopolymers 1999,

14 NMR titration: 2D 1 H- 15 N HSQC for Gly13: titration of HPr with the mannitol binding IIA mtl K D ~ 0.3 mm v. Nuland et al FEBS Lett. 1993

15 NMR titration: 2D 15 N-HSQC: Cross section of the signal of the residue K346 of a SH2-domain in a titration with EEEpYMPME-NH 2 (lines with ) and simulation (straight lines). k off = k 21 = 700 s 1 E + L k 12 EL `simple binding k 21 Cross section of the signal of the residue I381 of a mutant of the same SH2-domain in a titration with EEEpYMPME-NH 2 (lines with ) and simulation (straight lines). k 21 = 1000 s 1, k 32 = 10 s 1 k 12 E + L EL* EL k 21 k 23 k 32 intermediate complex Günther, Schaffhausen JBiomolNMR 2002

16 Transferred NOESY The transferred NOESY is a regular NOESY experiment, but it is applied to a protein-ligand system in dynamic exchange and with excess ligand Initial state: free ligand 2. Receptor 3. Formation of the complex, bound ligand NOEs between protons close in space are developed. 4. Dissoziation of the complex. The free ligand maintains the information acquired in the bound state for a short period of time until the system reverts to the initial state.

17 Transferred NOESY NOESY spectrum TR- NOESY spectrum only if: x bound B > x free F The cross relaxation rates of the bound ligand ( B ) are opposite in sign to those of the free one ( F ) and produce negative NOEs. The existence of binding may be easily deduced by visual inspection: sign inversion. TR-NOEs provide an adequate means to determine the bound conformation of the ligand.