Southern Blot, in-situ Hybridisierung, (quantitative) PCR. Northern Blot, Quantitative RT-PCR, DNA-Chip

Transkript

1 Molekularbiologie Proteinnachweis, -quantifizierung Western Blot, Immunhistochemie DNA Nachweis / Quantifizierung Southern Blot, in-situ Hybridisierung, (quantitative) PCR RNA Quantifizierung Northern Blot, Quantitative RT-PCR, DNA-Chip Mutationsanalyse RFLP, Sequenzierung, Schmelzpunktanalyse, Hybridisierung Deletionsanalyse PCR, Sequenzierung Translokationsanalyse Southern Blot, (RT-)PCR, FISH

2 Detektion von DNA / RNA Keine Aussage über Lebens- oder Vermehrungsfähigkeit Keine Screeningmethode Hohe Sensitivität Viren (ev. integriert) Bakterien Parasiten

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4 In-situ Hybridisieung HPV 16/18

5 Durchführung - PCR Amplifikation Trennung der Produkte nach Größe Identifizierung und Analyse

6 Amplifikation

7 Trennung der Produkte nach Größe

8 Identifizierung und Analyse

9 HPV 18 - PCR

10 Nachweis von Erreger-DNA mittels PCR Vorteile Nachteile Unkultivierbare Organismen Zeitfaktor Hohe Sensitivität Aufwand Kontaminationsgefahr (falsch positive Ergebnisse) Keine Screeningmethode

11 Quantifizierung von DNA/RNA Blot: Southern/Northern (RT)PCR: (Semi-)quantitative in situ -Methoden (z.b.: FISH) Chip-Verfahren (high throughput) Seltener verwendet: Nuclease protection assay, Ligase chain reaction etc.

12 Quantitative PCR: Exonuclease probe Polymerization R = Reporter Q = Quencher Forward Primer R Probe Q 5' p 3' 3' 5' 5' 3' 5' Reverse Primer Strand displacement 5' p3' 3' 5' 5' 3' 5' Q Cleavage R 5' p 3' 3' 5' 5' 3' 5' Q Polymerization completed R Q p 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5'

13 Quantifizierung von N-myc

14 Expressionsanalyse I. Northern Blot - One Gene at a time II. cdna Macroarray Gene auf einer Membrane (8x12 cm) III. cdna Microarray (DNA Chip) - z.b. vollständiges Saccharomycesgenom (6116 Gene/cDNAs) auf einem Objektträger (2x2 cm)

15 Normale Mucosa Karzinom mrna mrna Cy 5 - markierte cdna Cy 3 - markierte cdna Hybridisierung cdna array Scanner

16 Hybridisierter cdna-array Vergleich zweier Lymphom-Zelllinien

17 RNA expression analysis KM-H2 IgG3 KM-H2 Ki-1 KM-H2 no K299 Ki-1 K299 IgG3 K299 no no IgG3 Ki-1 no IgG3 Ki-1 KM-H2 K299 Hodgkin signature DNA content cell cycle apoptotic cells cdna microarray experiments Analysis Identification of CD30 controlled genes RQ-PCR validation ALCL signature

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19 Analyse von Punktmutationen Methoden: Restiktionsenzymanalyse Hybridisierung DGGE SSCP Allelspezifische PCR Sequenzierung

20 Molekulare Diagnostik Gerinnungsstörungen, Stoffwechselerkrankungen Faktor V Leiden Mutation Hämochromatose: HFE-Gen Mutationen Mb. Wilson: ATP7B - Mutationen

21 Mutation Faktor V Leiden Häufigste genetisch bedingte Ursache für venöse Thrombosen Prävalenz: 5-7% in der Normalbevölkerung Mutation: G1691A = Arg561Gln

22 Faktor V Leiden MnlI

23 Mutationsanalyse DNA-Polymorphismen: z.b. Hämochromatose Verwendung unterschiedlicher Analysetechniken Restriktionsenzymanalyse Schmelzpunktanalyse (Real-time PCR) Hybridisierung (Strip-Assay)

24 Mutation C282Y des HFE-Gens: RFLP-Analyse St + - Kontr. Patient

25 Mutation C282Y des HFE-Gens: Schmelzpunktanalyse

26 Translokationsnachweis - Techniken Zytogenetik Molekularbiologie Southern Blot PCR RT-PCR FISH (Fluoresezenz in situ Hybridisierung)

27 Translokation BCR-ABL

28 Nachweis BCR-ABL mittels RT-PCR

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30 FISH BCR- ABL

31 Anwendungen Diagnostik: CML Individuelle Risikoabschätzung: AML, ALL Therapiekontrolle: KMT, (Chemotherapie, Interferon) Früherfassung eines Relaps

32 B-Lymphozyten B-Zell Rezeptor Effektorzellen: Plasmazellen - Antikörperproduktion Unterstützung des Makrophagensystems

33 Immunglobuline Glykoproteine, im Serum u. Gewebsflüssigkeiten aller Säugetiere AG-Rezeptoren: an Zelloberfläche AK: frei im Blut oder Lymphflüssigkeit 5 Klassen: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Unterschiede: Größe, Ladung, AA- Zusammensetzung, Kohlehydratgehalt

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38 Genstruktur

39 TCR-ß Gen-rearrangement Addition of a variable number of nucleotides in a template independant fashion N - region

40 Hypervariable Regionen CDR (complementarity determining regions) Jede Leicht- und Schwerkette: 3, CDR1- CDR3 Umgeben von 4 FR (framework regions) CDR's aufgrund von Faltung nahe aneinander

41 Reaktiv? CLL?

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43 IgH PCR - Klonalitätsbestimmung

44 Lymphom?

45 TCRγ

46 Analysis of PCR products Method Comparison TCRγ - PCR Patient PAGE analysis Capillary electrophoresis

47 Verlaufskontrolle nach KMT Analyse des X-Chromosoms RFLP VNTR Minisatelliten Mikrosatelliten STR Short Tandem Repeats

48 Loci: Größe (bp): D8 S D21 S Patientin vor KMT D18 S STR-Analyse Spenderin Farbstoff: JOE Patientin 6M nach KMT, peripheres Blut Patientin 6M nach KMT, Beckenkamm 60% Spenderzellen <10% Spenderzellen

49 Molekulare Diagnostik - Onkologie Nachweis der: Amplifikation von Onkogenen Mikrosatelliteninstabilität Punktmutationen (Onkogene, Tumorsupressorgene) Klonalität

50 N-myc Southern-blot 1,2: pos. Ko. (IMR) 3,4: normale DNA 5: Patient 1 6: Patient 2, 10µg 7: Patient 2, 5µg 8: Patient 2, 2µg DNA

51 Quantitative PCR N-myc

52 HNPCC Hereditary Non- Polyposis Colon Carcinoma Junge Patienten Colon ascendens Muzinöses Adenokarzinom Mutation in DNA-Reparaturgen (hmsh2, hmlh1, hpms1, hpms2) Hohe Mutationsrate Mikrosatelliteninstabilität

53 HNPCC MSI- Analyse 6-FAM BAT 25: bp D2 S123: bp TET BAT 26: bp D17 S250: bp HEX D5 S346: bp TAMRA Interner Standard BAT26 D5 S346 BAT 25 (APC) D17 S250 (Mfd 15CA) D2 S123 Normalgewebe Tumor: MSS

54 MSI-Analyse BAT 25 BAT2 D5 S346 (APC) 6 D5 S346 (APC) Interner Standard NORMALGEWEBE NORMALGEWEBE TUMORGEWEBE: MSI-H TUMORGEWEBE: MSI-H