B-Zellen und Antikörper

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1 Seminar Modellstudiengang (Blut und Immunologie) Freitag 4. November :15-9:45 / 10:15-11:45 B-Zellen und Antikörper Albrecht Bufe T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe HE V Blutversorgung 1

2 T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe B Zelle Blutversorgung T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe T Zelle 2

3 Antigen Immunisierung Haut / Schleimhaut Dendritische Zelle (APZ) T Zellen finden Antigen auf Dendritschen Zellen Immunologische Synapse Aktiviert T Zelle 3

4 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an 4

5 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle! Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an 5

6 T Zellen verlassen den Lympknoten als Effektorzellen T Zellen verlassen den Lympknoten als Effektorzellen 6

7 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen 7

8 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen 8

9 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen B-Zellentwicklung Haut / Schleimhaut Lymphknoten B-Zelle Knochenmark IgM 9

10 Knochenmark B-Zellentwicklung Antigen-unabhängig Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Knochenmark Blutbahn, Lymphknoten, Gewebe Antigen-abhängig Unreife B-Zelle Reife naive B-Zelle Lymphoblast B-Gedächniszelle Plasmazelle IgM IgG IgM IgM IgD IgG Stammzelle Cell adhesion molecules CAMs VLA-4 VCAM-1 Integrine Stromazelle (Knochenmark, Leber) 10

11 Frühe Pro-B-Zelle Kit SCF Stem Cell Factor Stromazelle (Knochenmark, Leber) Späte Pro-B-Zelle IL-7 Stromazelle (Knochenmark, Leber) 11

12 Prä-B-Zelle IL-7 CAMs Stromazelle (Knochenmark, Leber) Unreife-B-Zelle Blut IgM Stromazelle (Knochenmark) Autoantigene 12

13 Klonale Selektion Unreife B-Zellen Autoantigene Beseitigung (Apoptose) unreifer B-Zellen, die mit SELBST-Antigenen reagieren, durch klonale Selektion Membran IgM Reife naive B-Zellen Fremdantigen Fremdantigen Keimbahn L V J C L V J C V-J-Verknüpfung L V J C Primäre RNA AAA L V J C mrna AAA Keimbahn V L C L L = leader V = variable J = joining C = constant 13

14 Keimbahn L V D J C L V D J C D-J-Verknüpfung L V DJ C VDJ-Verknüpfung L V DJ C Primäre RNA AAA L V D J C mrna AAA Keimbahn D = diversity Genomische Organisation der Antikörpergene Leichte l-kette L l 1 V l 1 L l V l -29 J l 1 C l 1 J l C l - 4 Leichte k-kette L k 1 V k 1 L k V k -40 J k 1-5 C k Schwere Kette L H 1 V H 1 L H V H -51 D H 1-27 J H 1-6 C µ 14

15 Spezifische Erkennungssequenzen als Rekombinantionssignale L V J C ACAAAAACC GGTTTTTTGT TGTTTTTTGG CCAAAAACA Rekombination Gleich Orientierung Unterschiedlich Heptamere ERKENNUNGS- SEQUENZEN Nonamere 15

16 Heptamer Nonamer Spaltung des Einzelstranges durch RAG-1,RAG-2 Komplex (Rekombination aktivierende Gene) Nonamer Heptamer Spaltung des komplementären Stranges Haarnadel bildung Haarnadel bildung Bildung der Signalverknüpfungssequenz P-Nucleotide durch Endonukleasespaltung der Haarnadeln Anfügen der N-Nukleotide durch terminale DNA-Transferase Paarung der Stränge Exonuklease, DNA-Synthese und Ligation (Verknüpfungssequenz) 16

17 Regulation in der frühen B-Zellentwicklung Die Expression der Enzyme, die an der Rekombination der IG-Gene beteiligt sind, ist entwicklungsabhängig programmiert Die Rekombination der IG-Gene ist eng mit deren Transkription koordiniert Die Rekombination der IG-Gene verändert die Aktivität ihrer Promotoren Entstehung der Antikörpervielfalt 1) Kombinatorische Vielfalt: Die einzelnen Gensegmente für die Domänen liegen in mehreren Kopien vor, die alle miteinander kombiniert werden können. Schwere Kette: 51 V H -Segmente 27 D H -Segmente 51 x 27 x 6 = J H -Segmente Leichte Kette k: 40 V L -Segmente 5 x 40 = J L -Segmente Leichte Kette l: 29 V L -Segmente 4 x 29 = J L -Segmente 316 leichte Ketten x 8262 schwere Ketten = 2,5 x ) Junktionale Vielfalt: Beim Aneinanderfügen der verschiedenen Segmente werden weitere Nukleotide eingefügt. 2/ 3 dieser eingefügten Nukleotide machen das Antikörpermolekül funktionslos (Leserasterverschiebung). 3) Somatische Hypermutation: Während der Reifung der B-Zellen in den sekundären lymphatischen Organen werden bereits funktionsfähige Antikörper verändert. In den hypervariablen Schleifen treten Mutationen auf. Antikörper, die besser an ihr Antigen binden, werden selektiert (Affinitätsreifung) 17

18 Immunglobulinvielfalt Element Immunglobuline -Rezeptoren H k l V-Segmente ~ 70 D-Segmente ~ D-Segmente, in drei Rastern gelesen selten - oft - J-Segmente Verknüftungen mit N- und P- Nukleotiden 2 (1) 2 1 Anzahl der V-Genpaare Verknüpfungsvielfalt ~ ~ Gesamtvielfalt ~ ~ B-Zellentwicklung abhängig von der Genrekombination Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Keimbahn D-J Umordnung VDJ-Umordnung Leichte Kette - VJ Umordnung Auf beiden Chromosomen - + Auf dem 1. Chromosom Auf dem 2. Chromosom - + Rec. K-Gen 1. Chromosom Rec. K-Gen 2. Chromosom Rec. l-gen 1. Chromosom Rec. l-gen 2. Chromosom Unreife-B-Zelle IgM 18

19 B-Zellentwicklung abhängig von der Genrekombination Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Keimbahn D-J Umordnung VDJ-Umordnung Leichte Kette - VJ Umordnung Auf beiden Chromosomen Das Erscheinen der Immunglobulinrezeptoren auf der Zelloberfläche entscheidet über Weiterentwicklung der B-Zelle - + Auf dem 1. Chromosom Auf dem 2. Chromosom - + Rec. K-Gen 1. Chromosom Rec. K-Gen 2. Chromosom Rec. l-gen 1. Chromosom Rec. l-gen 2. Chromosom Unreife-B-Zelle IgM B-Zellentwicklung Haut / Schleimhaut Lymphknoten Reife naive B-Zelle Knochenmark IgM 19

20 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle! 20

21 B Zellen benötigen VIER SIGNALE um aktiviert zu werden CD40 IL-4 CD40L Aktivierte T Zelle Aktivierte B Zellen entwickeln sich zu Plasmazellen und Gedächtniszellen Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle! B-Gedächniszelle Lymphoblast IgG IgM Plasmazelle IgG 21

22 Antikörperstruktur und -funktion V L C L V H C H 2 C H 4 Variable Regionen C H 1 Konstante Regionen Disulfidbrücken Antigenbindungsstelle 22

23 Antikörper- Spaltung pfc C H 3 Pepsin C H 2 Papain F(ab ) 2 C H 1 Fc Fc = Fragment crystallizable Fab Fab Fab = Fragment antigen binding Die 3D-Struktur, die von den hypervariablen Schleifen gebildet wird, bestimmt, welche Antigene gebunden werden können. 23

24 Peptid CDRs complementary determining regions Physikalische Kräfte zwischen Antikörper und Antigen Anziehungen zwischen entgegengesetzten Ladungen Elektronegative Atome (N, O) teilen sich ein Wasserstoffatom Fluktuationen in den Elektronenwolken um Moleküle herum polarisieren benachbarte Atome entgegengesetzt Hydrophobe Gruppen stoßen Wasser ab und neigen dazu, sich zusammenzuballen, um Wassermoleküle zu verdrängen; an der Anziehung sind auch van-der Waals- Kräfte beteiligt. 24

25 Präzipitations- (Heidelberger-) kurve Äquivalenz Antikörperüberschuss Antigenüberschuss Affinität und Avidität von Antikörpern Assoziation Monovalentes Antigen Dissoziation Assoziation Multivalentes Antigen Dissoziation 25

26 Bestimmung der Affinität Kein AK Niedrig Konz. AK Hoch Konz. AK Affinität ist die Bindungsstärke zwischen Ak und Ag, definiert als die Steigung des Verhältnisses von r zu r/c r/c Ka = Steigung = Assoziationskonstante (monovalentes Ag) r = Mol gebundenes Ag pro Mol Ak Ka = Steigung bei x = 1 = mittlere Assoziationskonstante (multivalentes Ag) 1 2 r c = Konz. an freiem Ag IgM J (junction) - Kette C H 4 C H 3 C H 2 J-Kette Disulfidbrücken C H 1 Hinge-Region (Gelenk) 26

27 Antikörpergene der konstanten Region Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 Konstante Region Isotypswitch Lymphoblast B-Zelle Plasmazelle IgM IgG IgA IgE IgG Isotyp-switch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 Konstante Region Spezifische DNA-Sequenzen (switch-region) regulieren die Rekombination Der Isotyp-switch wird durch Transkriptionsfaktoren (Switch-factors) induziert Der Isotyp-switch findet im Lymphknoten (Keimzentrum) statt Er erfordert ein spezifisches Milieu aus Zytokinen, die ihrerseits die Switchfaktoren aktivieren 27

28 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-4 IL-5 TGF- = induziert = steigert Synthese = hemmt IgG IgG1 C H 3 Hinge-Region (Gelenk) IgG2 C H 2 C H 1 IgG3 IgG4 28

29 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-5 TGF- IL-4 = induziert = steigert Synthese = hemmt IgA Polymerisierung mit J-Kette nur in der Schleimhaut (für Transport durch Epithelzellen erforderlich) C H 3 C H 2 C H 1 J-Kette Disulfidbrücken 29

30 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-5 TGF- IL-4 = induziert = steigert Synthese = hemmt IgE Mastzelle, Basophile Zelle C H 4 C H 3 C H 2 C H 1 Hinge-Region (Gelenk) 30

31 Verteilung von Antikörpern Verteilung IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE Transport durch Epithel Transport durch Placenta Diffusion in extravaskuläre Bereiche +/ Serumspiegel (mg/ml) 1, ,5 2,1 3x10-5 Neutralisation: Antigen wird vom Antikörper abgefangen, z.b. als Toxin an der Bindung zu einem entsprechenden Rezeptor gehindert und schließlich entfernt (Phagozytose und Abbau) Opsonierung: Zumeist größerer Antigene wird von Antikörpern eingehüllt. So wird durch Antikörperrezeptoren vermittelte Phagozytose (z.b. Makrophagen) verstärkt. Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen: Antikörper (IgG) binden an Antigene und an NK-Zellen, NK-Zellen setzen tödliche Granula frei 31

32 Sensibilisierung von Mastzellen: IgE Antikörper binden über den hochaffinen IgE-Rezeptor an Mastzellen. Antigen kann Mastzellen aktivieren, die ihrerseits Granula freisetzen und eine Abwehrreaktion auslösen. Aktivierung von Komplement: Antikörper (zumeist IgM) binden Antigen und gleichzeitig Komplement im Serum. Das Komplement löst eine Kaskade von verschiedenen Abwehrreaktionen aus. Effektorfunktionen der Antikörper Funktion IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE Neutralisierung Opsonierung Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen Sensibilisierung von Mastzellen Aktivierung des Komplementsystems

33 Opsonierung: Zumeist größerer Antigene wird von Antikörpern eingehüllt. So wird durch Antikörperrezeptoren vermittelte Phagozytose (z.b. Makrophagen) verstärkt. Rezeptor vermittelte Aktivitäten Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen: Antikörper (IgG) binden an Antigene und an NK-Zellen, NK-Zellen setzen tödliche Granula frei Rezeptoren der Antikörper Rezeptor Struktur Fcg-RI (CD64) Fcg-RII-A (CD32) Fcg-RII-B2 Fcg-RII-B1 Fcg-RIII (CD16) Fce-RI g g g g Bindung Reihenfolge der Affinität IgG 10 8 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 5x10 5 M -1 IgG1=IgG3 IgE M -1 Zelltyp Monozyten Makrophagen Neutrophile Eosinophile Makrophagen Neutrophile Eosinophile Blutplättchen Makrophagen Neutrophile Eosinophile Basophile Blutplättchen Langerhanszellen B-Zellen Basophile NK-Zellen Monozyten Makrophagen Neutrophile Eosinophile Langerhanszellen Mastzellen Eosinophile Basophile Auswirkung der Bindung Aufnahme Aufnahme Freisetzung Von Granula (Eosinopile) Aufnahme Freisetzung Von Granula (Eosinopile) Unterdrückung der Stimulation, keine Aufnahme Induktion des Tötens (NK-Zellen) Freisetzung von Granula 33

34 Affinitärreifung B Zellen benötigen VIER SIGNALE um aktiviert zu werden CD40 IL-4 CD40L Aktivierte T Zelle 34

35 B Zell Differenzierung Keimzentrum Memory B Zelle Langlebig Entdifferenzierte Plasma Zelle Knochenmark Langlebige PZ Hochaffine Plasma Zelle Struktur eines Lymphknoten Keimzentrum T Zone Follikel Medulla 35

36 Antigen-spezifische Interaktionen im Lymphknoten Dendritische Zelle naïve T Zelle B Zelle FOLLIKEL T T T ZONE Dendritische Zelle Aktivierte T Zelle Plasma Zellen MEDULLA Plasmablasten Keimzentrum Hypermutation Affinitätsreifung Somatische Hypermutation (Affinitätsreifung) Antigenbindungsstelle complementary determining regions (CDRs) CDR1 CDR3 CDR3 Antikörper 1 Antikörper 2 Antikörper 3 AS AS AS

37 Ig V-Gen- Hypermutation and Selektion in Keimzentren Nicht Selektion Apoptose Zentrozyten Zentroblasten Helle Zone T FOLLIKEL MANTEL T T ZZ ZZ ZZ FDC + ZZ Antigen ZB ZB Ig-V-Gen- Hypermutation ZB Dunkle Zone T ZZ PZ T mb Selektion Differenzierung Der besondere Fall der FDCs im Keimzentrum 37

38 Struktur eines Lymphknoten Keimzentrum T Zone Follikel Medulla Das weitere Schicksal der reifen naiven B-Zelle? Im Follikel befinden sich die Folikulär dendritischen Zellen (FDC). Einige der B-Zellen werden zu den FDCs gelockt und bilden dort ein Keimzentrum. 38

39 Folikulär dendritische Zelle FDCs sind keine dendritischen Zellen (tragen keine MHC- Moleküle, stimulieren also keine T-Zellen) Sie bilden ein Netz in den Primärfollikeln. Sie binden Immunkomplexen aus Antikörpern und Antigenen über Fc-Rezeptoren. Sie locken B-Zellen durch Freisetzung des Chemoattrackents BLC (B-Zell-Chemokine) in die Keimzentren. Zu dieser Zeit findet die somatische Hypermutation statt. Die im Keimzentrum in Affinität gereiften B-Zellen versuchen die löslichen Antikörper aus den Immunkomplexen herauszudrängen. Wenn es gelingt, erhalten Sie weiter Antigenstimulation als Überlebenssignal. Jetzt bilden sich Plasma- und Memoryzellen, die vermutlich sehr lange leben. Zentrozyt Fc-Rezeptor 39

40 Fc-Rezeptor Hohe Affinität 40