Methoden der Strukturenuntersuchung

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1 Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops Methoden der Strukturenuntersuchung Lichtmikroskopische Techniken Rastermikroskope Elektronmikroskope Diffraktionsmethode Optisches Gitter Auflösungsgrenze: δ = 0,61 λ / (n sinω) Mit λ=400 nm, n=1,6 und ω 90 ist d 150 nm Objektive Gebeugte Strahlen m 10 0 meter Typische Grössen Mann millimeter Abstand der man mit Auge sehen kann mikrometer Zelle (z.b. Blutkörpern) nanometer Protein 7μm Angström Durchmesser des Atoms, H Atom 1 Angström (Å) pikometer Wellenlenge der Röntgenstrahlung femtométer Atomkern Spezielle Lichtmikroskopische Techniquen Siehe Praktikum Konfokale Mikroskopie Zweiphotonenmikroskop Fluoreszenzkorrelationsmethode

2 Fluoreszenzmikroskop Konfokales Mikroskop Das Prinzip ATP Verteilung visualisiert mit Luciferin Kleine Öffnung Lichtquelle Okularlinse Emissionsfilter Detektor Kleine Öffnung Filter für das Anregungslichtes Objektivlinse Fluoreszierendes Objekt Konventionelle mikroskopische Aufnahme Fokalebene Konfokales Mikroskop Konfokales Mikroskop Aus Tubulin bestehende Mikrotubli in Zellen Dendritische Zelle mit Pollenteilchen. 3D Aufnahme mit konfokalem Mikroskop.

3 Gleichzeitige Anwendung von mehreren fluoreszierenden Markierungen Fluoreszenzanregung mit zwei Photonen Zweiphotonenmikroskop He-La Zellen markiert mit fünf unterschiedlichen Fluoreszenzmethoden. Der Masstab ist 20 µm. Auflösung! IR Laser Fluoreszenzemission bei Einphoton- und Zweiphotonenanregung. Zweiphotonenmikroskopie STimulated Emission Depletion (STED) Mikroskop Visual Cortex von genetisch manipulierten Mause die GFP produzieren. Stefan Hell (Nobelpreis 2014)

4 STimulated Emission Depletion (STED) Mikroskop STED: Lokalization Reorganization des Synaptolysins in synaptischen Vesikeln STED: Lokalization und Kolokalization Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Die Position des Eiweisses kann mit nm genauigkeit angenommen werden. Kolokalization bedeutet nicht unbedingt eine Wechselwirkung! Fluktuation der Molekülen in einem sehr kleinen Volumen: fl Konzentration: 10 nm Anzahl der Moleküle in Beobachtungsvolumen beträgt durchschnittlich: 6 Fluktuationen des Fluoreszenzlichtes: Ähnlich zur dynamischen Lischtstreuung, aber mit Fluoreszenz

5 FCS: Autokorrelationsfunktion FCS: Welche Information kann man erhalten? Ligandenbindung Kleines Ligandmolekül mit Fluoreszenzmarkierung + großes Eiweißmolekül: Diffusionskonstante ändert sich Aggregation Markierte Proteine: Lichtintensität von Dimere, Tetramere ist höher τ d charakteristische Zeit der Diffusion eines Moleküls Diffusionskonstante ist abhängig von der Molekülengröße! Konzentration Reaktionsgeschwindigkeit Diffusion in der Inneren der Zellen Die Autokorrelationsfunktion muss zu einer Modellfunktion angepasst werden um diese Informationen aus der Parametern der angepasste Funktion zu erhalten. Rastermikroskope (Scanning Probe Microscopes) RASTERSONDENMIKROSKOPE STM: Scanning Tunneling Microscope Rastertunnelmikroskop SNOM: Scanning Nearfield Optical Microscope AFM: Atomic Force Microscope Rasterkraftmikroskop (Atomkraftmikroskop) Das Rastertunnelmikroskop wurde in 1981 von Heinrich Rohrer és Gerd K. Binnig entwickelt. Fünf Jahre später sie erhalten den Nobel-Preis.

6 Rasterkraftmikroskop (Atomkraftmikroskop) (Atomic Force Microscope-AFM) Rastertunnelmikroskop Messung des Tunnelstromes Tunnelstrom minta kvadráns dióda Rückkopplunselektronik Objekt Piezo Kristall Der Tunnelstrom ist konstant gehalten mit der vertikalen Bewegung des Objektes. Die Kraft zwischen der Nadel und dem Objekt AFM Messmethoden eine sehr spitze, nadelartige Sonde Krümmungsradius bei der Spitze nm => x-y Auflösung! Kraft Abstoßungskraft Anziehungskraft Abstand Kontakt Modus Der intermittierende Modus (engl.: intermittent contact mode, oder tapping mode genannt)

7 AFM Aufnahmen AFM Aufnahmen Hitzeschockproteine Rote blutzellen nm Alpha Crystallin Aggregate DNS ELEKTRONENMIKROSKOPE Transmissionselektronenmikroskop Rasterelektronenmikroskop Progressive images from atomic force microscopy show the compaction of DNA caused by a protein called AbF2. (

8 Transmissionselektronenmikroskop Rasterelektronenmikroskop Hoschspannungsquelle Vakuumkammer Objekt Primärbild Kathode Anode Kondensorlinse Objektivlinse Projektorlinse Projiziertes Bild Auflösungsvermögen des Elektronenmikroskops Abbe sches Prinzip und Materialwellen Materialwelle: Zu einem Teilchen mit m Masse und v Geschwindigkeit, kann man eine Welle (Materienwelle) h λ = mv zuordnen, die eine Wellenlänge von hat. Die Geschwindigkeit des Elektrons nach einer Beschleunigung mit U Spannung beträgt: 2eU h womit: v = λ = m 2 emu Typisch kann λ 5 pm sein. Aber ω ist sehr klein! NA 0,002 DIFFRAKTIONSMETHODE δ = 0,61 λ / (n sinω) nm

9 Röntgendiffraktion Röntgendiffraktion Anwendung der Röntgenstrahlung in Strukturanalyse der Materie. Zur Erinnerung: Diffraktion des Lichtes Was für ein Gitter passt zur Röntgenstrahlung? λ < ~ d λ Rtg pm H 100 pm sinα = k kλ d d α k nλ = 2d sinθ Atomgi er Kristall auch DNS o. Proteinkristall! Aufbau des Röntgendiffraktionsgerätes Röntgenröhre kv Kristall PB Kollimator Nicht gebeugte Strahlung (0-te Ordnung) Gebeughte Strahlen Photoplatte

10 Eiweißkristalle Bestimmung der Raumstruktur der Eiweiße Lysozyme Elektronen und Neutronendiffraktion Heute Mai 4, 2015: Strukturen! λ: Materialwellen Elektronen: Kleine Eindringstiefe: Oberflächen Elektronen und Neutronen werden an den Atomkernen gestreut. (Rtg wird durch Elektronenwolken gestreut.) Elektronen werden an den schwereren Kernen gestreut Neutronen auch an den Protonen, => Neutronendiffraktion gut zur Strukturuntersuchung von wasserstoffhaltigem Material.