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1 Etablierung eines Drosophila-Modells der Alzheimer Erkrankung zur Analyse von Glutaminylzyklase-vermittelter pyroglu-aβ-bildung und deren Hemmung durch spezifische Inhibitoren D i s s e r t a t i o n zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I Biowissenschaften der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Christiane Lindner geboren am 28. August 1979 in Weimar Gutachter: 1. Prof. Dr. Gunter Reuter 2. Prof. Dr. Hans-Ulrich Demuth 3. PD Dr. Steffen Roßner Verteidigt in Halle (Saale) am 01. April 2008 urn:nbn:de:gbv: [

2 I. Inhaltsverzeichnis I. Inhaltsverzeichnis I. Inhaltsverzeichnis...ii II. Abkürzungsverzeichnis...iv 1. Einleitung Material und Methoden Genetische Methoden Anzucht und Haltung der Fliegen Herstellung transgener Linien von Drosophila melanogaster Etablierung transgener Stämme GAL4-UAS-kontrollierte Transgenexpression Behandlung transgener Drosophila mit P150/ Toxizitätstest Dekaptieren von Fliegen Molekularbiologische Methoden Gewinnung von Nukleinsäuren Amplifizierung von Nukleinsäuren Klonierung von PCR-Fragmenten Klonierung der Aβ-Expressionskonstrukte Klonierung von Drosophila QC Expressionskonstrukten Biochemische Methoden Aβ-Immunpräzipitation aus Schneiderzellmedium Gelelektrophorese von Proteinen Nachweis von Proteinen im Westernblot ELISA QC-Aktivitätstest Zytologische Methoden Transfektion von Schneider-Zellen Zellfraktionierung Immunzytologische Untersuchung Ergebnisse Herstellung transgener Linien von Drosophila melanogaster Herstellung und Test der Konstrukte Herstellung transgener Linien GAL4-UAS kontrollierte Expression des Transgens Auswahl der geeigneten Treiberlinie Auswahl der geeigneten transgenen Linie Der Einfluss des QC-Inhibitors P150/03 auf die pyroglu-bildung der Linie CS Die Toxizität von P150/ Der Einfluss des QC-Inhibitors P150/03 auf die pyroglu-bildung der Linien CS36 und CS Die Herstellung neuer transgener Fliegenlinien...53 ii

3 I. Inhaltsverzeichnis 3.9 GAL4-UAS kontrollierte Expression des Transgens Glutaminylzyklasen in Drosophila Homologe Expression von CG5976 und CG32412 in S2 Zellen Immunzytologische Untersuchung Die Genprodukte von CG32412 und CG5976 haben QC-Aktivität Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis...91 Anhang A1 Vektoren und Kostrukte A2 Stabile S2 Zelllinien A3 Transgene Stämme Drosophila melanogaster A4 Verwendete Vektoren A5 Selektierte Fliegen Publikationsliste Eidesstattliche Erklärung Danksagung Lebenslauf iii

4 II. Abkürzungsverzeichnis II. Abkürzungsverzeichnis Aβ Abb. AD AICD APH APLP ApoE4 APP APPL APPsα/β AS BACE1 bzw. CT CTF DMSO EC ELISA ER et al. FA FAD FTDP GnRH HEK HMGR i.a. β-amyloid-protein Abbildung Alzheimer sche Demenz, Alzheimer sche Krankheit APP intracellular domain, APP intrazelluläre Domäne anterior pharynx defective APP-like-protein Apolipoprotein Allel ε4 Amyloid Precursor Protein, Amyloid Vorläuferprotein Amyloid Precursor Protein-like lösliches N-terminales APP-Fragment entstanden durch α- bzw. β-sekretasespaltung Aminosäure β-site APP cleaving enzyme beziehungsweise Computertomographie C-terminales APP-Fragment Dimethylsulfoxid Glutamyl-Zyklase-Aktivität der Glutaminyl Zyklase enzyme linked immunosorbant assay Endoplasmatisches Retikulum und andere formic acid, Ameisensäure familiär vererbte / präsenile Alzheimer sche Demenz Frontotemporale Demenz mit Parkinson Gonadotropin realeasing hormone, Gonadoliberin human embryonal kidney Hydroxymethylglutaryl-CoenzymA-Reduktase im Ansatz iv

5 II. Abkürzungsverzeichnis MCI mild cognitive impairment, milde kognitive Beeinträchtigung Mio. Millionen MRT Magnetresonanztomographie MVB multivesicular bodies, Multivesikelkörperchen N3pE Glutamat an Position 3 liegt als Pyroglutamat vor NMDA N-Methyl-D-Aspartat n.s. nicht signifikant o.g. oben genannt PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PEN presenilin enhancer PET Positronenemissionstomographie PS Presenilin pyroglu Pyroglutamat QC Glutaminyl cyclase, Glutaminylzyklase RFU Relative Fluorescence Units, relative Fluoreszenz Einheit RT Raumtemperatur S2-Zellen Schneider-Zellen SAD sporadisch auftretende / senile Alzheimer sche Demenz Tab. Tabelle TMB Tetramethylbenzidin TRH Thyreotropin releasing hormone, Thyreoliberin UAS upstream activating sequence vgl. vergleiche, siehe auch w iso w 1118 iso1;iso2;iso3 (weißäugiger, isomerisierter Stamm von Drosophila melanogaster) WT Wildtyp v

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