Malariadiagnostik in Theorie und Praxis a hands-on experience
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- Walter Dunkle
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1 Malariadiagnostik in Theorie und Praxis a hands-on experience Assoc. Prof. HARALD NOEDL, MD, PhD Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin Kinderspitalgasse 15, A Vienna, AUSTRIA harald.noedl@meduniwien.ac.at Im Rahmen der Methodenseminare SS15 Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin Protozoenerkrankung hervorgerufen durch vier (5 ) verschiedene Spezies der Gattung Plasmodium übertragen durch die Anophelesmücke: P.falciparum, P. vivax, P. malariae, and P. ovale ca 198 Mio (2013) klinische Faelle (<50 in AUT) Todesfälle/Jahr (WHO, 0-2 in AUT) Etwa 40% der Weltbevoelkerung (3,2 Mrd) Malaria ausgesetzt 2 1
2 P. falciparum [klinisches Bild: Malaria tropica ] ist verantwortlich fuer die schwersten Verlaufsformen und fast alle Todesfaelle Die benignen Verlaufsformen der Malaria werden verursacht von P. vivax, P. ovale [ Malaria tertiana ], und P. malariae [ Malaria quartana ] Innerhalb von etwa 5 bis 10 Jahren führen wiederholte Infektionen zu einer kurzlebigen Semiimmunitaet (Kinder bis 10 Jahre sind daher besonders betroffen, da sie noch keine Immunitaet entwickeln konnten) 3 LITERATUR UND LINKS Bücher Gilles & Warrel. Bruce-Chwatts s Essential Malariology, 2002 Wernsdorfer & Mc Gregor. Malaria Principles and Practice of Malariology, 1989 Hommel & Kremsner. Encyclopedia of Malaria (2017) WHO und Online World Malaria Report CDC. WHO Malaria Treatment Guidelines, 2 nd Ed, 2010, 4 2
3 M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E (WHO 2014) At Risk 3 billion 3,2 billion Clinical Cases million 198 millions Deaths 1,5-2,7 million Main Distribution Secondary 90% of cases in Subsaharan Africa India, Sri Lanka, Afghanistan, Vietnam, Colombia 90 % of cases in Subsaharan Africa India, Afghanistan, SE- Asia M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae M. tropica M. tertiana M. tertiana M. quartana Präpatenz Inkubation (bzw Monate) Erythrozytärer Zyklus Fieber Quotidian, tertian, sub-/bi-tertian Tertian Tertian Quartan Max. Parasitämie/uL Relapse (Hypnozoiten) Dauer einer unbehandelten Infektion 2 millionen (40%) 50,000 (1%) 30,000 (0.6%) 20,000 (0.4%) y y y? 3-50 y 3
4 M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E Neu: P. knowlesi die 5. Spezies Morphologisch nicht von P. malariae (M. quartana) zu unterscheiden Zyklus: 24h! schneller Anstieg der Parasitämie Zoonose! Verbreitung: Südostasien (v.a. Borneo und Malaiische Halbinsel) Reservoir: Makaken (M. fascicularis & nemestrina) Wichtigster Vektor: A. leucosphyrus 4
5 M A L A R I A L E B E N S Z Y K L U S malara_movie2.swf M A L A R I A D I A G N O S T I K PROBLEME IN DER MALARIA-DIAGNOSTIK Malaria ist eine potentiell tödliche Erkrankung, fruehzeitige Diagnose daher lebenswichtig In Endemiegebieten stellt jeder Erkrankte ein Infektionsrisiko für die Gemeinschaft dar. Rechtzeitige Erkennung von Malaria ist daher von grosser epidemiologischer Bedeutung PROBLEM: Malaria ist eine Krankheit der Armen Malariadiagnostik und kontrolle verlangen jedoch ein gewisses Maß an Infrastruktur und finanzielle Mittel für die Diagnose und Therapie des einzelnen Falles In reichen Ländern dagegen fehlt es nicht am Geld, wohl aber an der Erfahrung im Umgang mit Malaria 10 5
6 M A L A R I A D I A G N O S T I K ÜBERBLICK: VERFÜGBARE DIGNOSTISCHE VERFAHREN Klinische Diagnose Gefärbter Blutausstrich Dicker Tropfen Ausstrich Fluoreszenz Mikroskopie QBC Kawamoto Molekulare Diagnostik (PCR/LAMP) ELISA Antigen Antikörper Immunochromatographische Tests HRP-2 pldh 11 M A L A R I A M O R P H O L O G I E P L A S M O D I U M F A L C I P A R U M Zyklus: 48 Stunden, Erys nicht vergroessert, Maurer s kleft Ringe / Trophozoiten Klein bis mittelgross, haeufig zwei Chromatine (Doppelchromatin), randstaendige Formen (accole), oft mehrere Parasiten in einem Erythrozyten (Doppel-, Dreifachinfektion); spaetere entwicklungsstadien verschwinden aus dem periphaeren Blutstrom (Sequestration) Schizonts Normalerweise NICHT im peripheren Blutstrom (ausser bei schweren Verlaufsformen); 12 bis 32 Merozoiten, kompakt mit einem einzelnen dunklen Pigment Gametozyten Erscheinen etwa 10 Tage nach den asexuellen Formen; bananenfoermig; weibliche (Macrogametozyten) sind schlanker, haben einen kleinen Kern, blaeuliches Zytoplasma, Pigmentkoerner gehaeuft, maennliche (Microgametozyten) sind etwas breiter undhaben ein roetliches Zytoplasma, einen grossen Kern und verteiltes Pigment 12 6
7 M A L A R I A M O R P H O L O G I E P L A S M O D I U M V I V A X Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner Tuepfelung Ringe / Trophozoiten Klein bis relativ gross, wachsen schnell, mit deutlicher amoeboider Aktivitaet und Pseudopodien (Amoeboide Formen); grosse Vakuole Schizonten Auch im peripheren Blutstrom, 12 to 24 Merozoiten, vergroesserte Zelle Gametozyten Erscheinen innerhalb von 3 Tagen, gross, rund oder oval, koennen beinahe die gesamte, vergroesserte Zelle ausfuellen; Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter Kern; Microgametozyten: grosser diffuser Kern 13 M A L A R I A M O R P H O L O G I E P L A S M O D I U M O V A L E Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner Tuepfelung, haeufig oval, ausgefranst Ringe / Trophozoiten Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma, Vakuole verschwindet fruehzeitig, prominentes Pigment, Schizonten Auch im peripheren Blutstrom, 4 to 12 Merozoiten, vergroesserte Zelle Gametozyten Aehnlich wie P. malariae (aber in vergroesserter Zelle); Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser, diffuser Kern 14 7
8 M A L A R I A M O R P H O L O G Y P L A S M O D I U M M A L A R I A E Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert Ringe / Trophozoiten Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma, Vakuole verschwindet fruehzeitig, polares Wachstum (Bandformen), reichlich dunkles, prominentes Pigment Schizonten 6 bis 12 Merozoiten als cluster or symmetrisch angeordnet (bluetenfoermig), konzentriertes, oft zentrales Pigment Gametocytes Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser, diffuser Kern 15 P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae 16 8
9 M O R P H O L O G I E 17 M A L A R I A D I A G N O S T I K KLINISCHE DIAGNOSE Auch heute noch die am weitesten verbreitete Methode der Malariadiagnose und in vielen Gegenden die einzig verfügbare Diagnose anhand typischer Klinik (Fieber, Schüttelfrost, Kopfschmerz, Übelkeit, Erbrechen...) Problem: Malaria hat keine typische Klinik, sie kann vielmehr praktisch jede ander Krankheit imitieren Klinische Diagnose der Malaria ist daher häufig eher ein Lotteriespiel, besonders in nicht endemischen Gebieten, in denen es häufig an der Erfahrung im Umgang mit Malaria fehlt 18 9
10 MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE Auch heute nach über 100 Jahren noch der Gold Standard der Malariadiagnose Hat in dieser Zeit wenig Veränderung gesehen Vorteile: Sensitiv Erlaubt Speziesdiagnostik und Quantifizierung der Parasitämie Relativ billig (US$ 0.12 bis 0.40) Nachteile: Arbeitsintensiv und relativ zeitaufwendig (ca. 60 Minuten) Erfordert gut geschultes und vor allem geübtes technisches Personal 19 MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE DICKER TROPFEN Durch Haemolyse massiv angereicherte Schichtung von Erythrozyten (ca fach) Färbung mit Giemsa, Field s, Wright s Stain Qualität der Färbung extrem wichtig für Sensitivität Quantifizierung durch Zählung pro 200 Leukos Sensitivität: >20/uL (Expert Microscopy), >50/uL (Standard in Endemiegebieten), >500/uL in den meisten westlichen Labors Vorteil: Hohe Sensitivität, daher ausgezeichnet für Diagnose Nachteil: Deutlich schwieriger zu interpretieren als Ausstrich, schwierigere Speziesdiagnose 20 10
11 MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE AUSSTRICH Als Monolayer auf Slide aufgebracht, fixiert Färbung mit Giemsa, Wright s Stain Qualität der Färbung nicht so wichtig für Sensitivität Quantifizierung durch Zählung per ,000 Erys Vorteil: Einfach zu interpretieren, sehr gut für Speziesdiagnose Nachteil: NICHT GEEIGNET für Diagnose dank niedriger Sensitivität (nur ca. 1/10 des Dicken Tropfens!) 21 FLUORESZENZMIKROSKOPIE QBC II Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J. Anreicherung von Parasiten in Acridin-Orange beschichteten Kapillaren, Nachweis in Fluoreszenzmikroskop Nach Zentrifugieren Konzentration der gefärbten Parasiten in der oberen Ery Schicht KAWAMOTO TECHNIK AO Färbung, Umgeht das Problem des Fluorenzmikroskops mit Quarz Halogenlichtquelle Vorteil: Etwas einfacher zu interpretieren als Giemsa Nachteil: Relativ aufwendig, nicht sensibler als Giemsa Smear, ungeeignet für Endemiegebiete, schwierige Differentialdiagnose 22 11
12 RDTs (Rapid Diagnostic Tests) Immunochromatographische Tests Prinzip ähnlich ELISA, monoklonaler Antikörper fängt markiertes Antigen auf Mikrozellulosemembran Verschiedene Formate: Teststreifen Kartenformat Kassettenformat 23 RDTs (Rapid Diagnostic Tests) Zielantigene: Histidinreiches Protein II (HRP2) z.b. Now ICT (Binax), Paracheck (Orchid) Äußerst stabiles Protein (daher nicht für den Nachweis des Behandlungserfolgs geeignet) In P. falciparum, unabhängig von Knob- Phänotyp In Parasiten, infiz. Erys, Serum u. Plasma Lactatdehydrogenase (pldh) Optimal (Diamed) Enzym aus Glycolytic Pathway Findet sich bei allen P. spezies Kurze Halbwertszeit Aldolase (als Panamalaria Ag auf Now ICT) 24 12
13 RDTs (Rapid Diagnostic Tests) Vorteile: Rasche Diagnose (ca. 15 Minuten) Einfache Durchführung, erfordert daher nur kurze Einschulung (aber dennoch nicht für die Selbstdiagnose z.b. bei Reisenden geeignet!) Hohe Sensitivität (vgl. mit dickem Tropfen, im Vergleich zu unerfahrenem Personal sogar deutlich höher!) Erfordern praktisch keine Infrastruktur (Elektrizität, Laborgeräte etc.) und sind sehr wiederstandsfähig Nachteile: Keine Speziesdiagnose (Primär Pf) Falsch positiv nach erfolgreicher Therapie (HRP2) Limitierte Aussage über Parasitendichte Relativ teuer (ca. US$ 0.60 bis 5.00) 25 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ziel: Small-Subunit 18S rrna u.a. (z.b. CS) Vorteile: Äusserst sensitiv (ca. 5 Parasiten/uL) Bester Nachweis von gemischten Infektionen RTPCR erlaubt exakte Quantifizierung der Parasitendichte und ist relativ schnell Ausgezeichnetes Tool für wissenschaftliche Zwecke (z.b. als Goldstandard für RDT- Sensitivitätsstudien) Nachteile: Sehr teuer Nicht für Routinediagnose 26 13
14 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Norihiro Tomita et al. Nature Protocols 3, (2008) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Idee: Im Gegensatz zur Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt bei der isothermalen DNA-Amplifikation die jeweilige Reaktion bei gleichbleibender Temperatur (isothermal) mit einer strangversetzenden DNA- Polymerase Vorteile: Ähnlich PCR, äusserst sensitiv Benötigt wesentlich weniger Infrastruktur als PCR. Daher besser für resource-limited Umgebungen Resultate wesentlich rascher als bei Standard PCR Nachteile: Relativ teuer, benötigt dennoch eine gewisse Infrastruktur, derzeit noch experimentell 27 ELISA Antigen Antikörper Nachweis Antigennachweis: Hoher Durchsatz (ca 40 Samples pro Platte, 5 Platten können gleichzeitig gefahren werden 200 Resultate innerhalb von ca. 3-4 Stunden) Ausgezeichnet geeignet für epidemiologische Studien, nicht für Routinediagnostik Hohe Sensitivität (ca. 20 Parasiten/uL), für Pf sensibler als Mikroskopie, möglicher Goldstandard für Pf? Kommerziell nur für Pf erhältlich, daher keine Speziesdiagnose Antikörpernachweis: Für epidemiologische Seroprävalenzstudien, Blutbanken, Eradikationskampanien Nicht für Routinediagnose 28 14
15 FÜR JEDEN ZWECK DER RICHTIGE TEST Routinediagnose in Endemiegebieten: Mikroskopie (Giemsa) ODER RDTs (wo Mikroskopie nicht verfügbar) Routinediagnose bei Reisenden: Mikroskopie (Giemsa oder Fluoreszenz) PLUS RDTs (keine Selbstdiagnose) Seroprävalenzstudien und Blutbanken: Ak-ELISA und Mikroskopie Wissenschaftliche Zwecke: Mikroskopie (Giemsa) PLUS PCR/LAMP oder Ag- ELISA Auch nach über 100 Jahren hat die Mikroskopie nicht an Bedeutung für die Malariadiagnose verloren. Neue ergänzende Techniken können jedoch die Sensitivität deutlich erhöhen. 29 Malariadiagnostik in Theorie und Praxis a hands-on experience Assoc. Prof. HARALD NOEDL, MD, PhD Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin Kinderspitalgasse 15, A Vienna, AUSTRIA harald.noedl@meduniwien.ac.at Im Rahmen der Methodenseminare SS15 Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin 15
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