Charakterisierung von Weizen aus unterschiedlichen Anbauformen mit Profiling-Methoden

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1 Charakterisierung von Weizen aus unterschiedlichen Anbauformen mit Profiling-Methoden Georg Langenkämper, Christian Zörb, Karsten Niehaus 1, und Thomas Betsche Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel Institut für Biochemie von Getreide und Kartoffeln, Detmold 1 Abteilung für Proteom- und Metabolomforschung, Lehrstuhl für Genetik, Universität Bielefeld 58. Tagung für Getreidechemie in Detmold vom Juni 2007

2 Förderung des Projektes durch das Bundesprogramm Ökologischer Landbau Projektlaufzeit: November 2005 Oktober 2007

3 Gliederung Einleitung Fragestellung Untersuchungsmaterial: DOK-Weizen Ergebnisse 1. Profiling von Metaboliten 2. Profiling von Proteinen Schlussfolgerungen

4 4,7 % Anteil an der landwirtschaftlichen Nutzfläche (Bundesdurchschnitt)

5

6 Fragestellungen 1. Hat die Anbauform einen Einfluss auf Inhaltsstoffe des Weizens? 2. Gibt es anbauspezifische Inhaltsstoffprofile?

7 Untersuchungsmaterial: Weizen Getreide aus einem Feldversuch mit kontrolliertem ökologischem und konventionellem Anbau DOK - Feldversuch Variablen ausgeschaltet: Standort, Klima, Sorten

8 D O K Feldversuch Seit gliedrige Fruchtfolge Löss-Parabraunerde Forschungsinstitut für biologischen Landbau (FiBL) und Forschungsanstalt Agroscope Reckenholz-Tänikon, Schweiz

9 Anbauformen Organisch Dynamisch Konventionell Mineralisch Keine Düngung org dyn conv min null

10 Ergebnisse zum DOK Versuch Eigenschaften ÖKO Referenz Boden: N, K, P, - a, e Boden: ph, organische Substanz, Biodiversität, Biomasse + a, f Kornertrag - a, e Hektolitergewicht, Tausendkorngewicht = e Proteinkonzentration - b, e Ballaststoffe, Fructan, Phytinsäure, Oxalsäure, Antioxidantien = b Mineralstoffe, Spurenelemente + / - b, d Aminosäuren = e Metabolit-Profiling + / - c a Mäder et al., 2002, b Langenkämper et al., 2006a, c Zörb et al. 2006, d Langenkämper et al., 2006b, e Mäder et al. 2007, f Fließbach et al 2007

11 P r o f i l i n g Drei prinzipielle Anwendungsebenen Transkripte Proteine Metabolite

12 Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Gesamt Ionenstrom (x10 6 ) org conv Fumarat Valin Citrat Malat Glukose Ribitol (IS) Saccharose Raffinose Zeit (min) Gesamtionen-Chromatogram methanolischer Extrakte

13 Lysin Threonin relative Einheiten 1,5 1,0 0,5 B B B A A 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 AB BC C A A 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell

14 β-alanin Pantothensäure 0,4 A 0,15 A AB AB relative Einheiten 0,3 0,2 0,1 BC C AB AB 0,10 0,05 B B 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell

15 Jahre 2005 und Titlis Aminosäuren Zucker und Zuckeralkohole organische Säuren andere α-alanin α-glycerophosphat β-alanin Fructose 2-Aminoadipate Adenosin Metabolite Prolin Citrat Glutamat Gluconat Ribitol (IS) Fumarat Uracil Asparagin Glucose Malat Harnstoff Glycin Succinat Shikimat Isoleucin Saccharose Pyruvat Pantothensäure Lysin Raffinose Threonin Ribose Tyrosin Maltose α-ketoglutarat Tryptophan 2-Hydroxyglutarat Methionin Arginin Histidin Leucin Homoserin Phenylalanin Serin 2-Isopropylmalat 4-Aminobutyrate 2006 Runal myo-inositol Valin Glycerat

16 Panthothensäure - Vitamin B5 β-alanin Pantoinsäure Pantothensäure Coenzym A

17 Metabolite Zusammenfassung 45 Metabolite wurden identifiziert Die Konzentrationen von 15 Metaboliten waren verschieden Die Schwankungsbreiten der Konzentrationen betrugen maximal 50 % In den Sorten Runal (Anbau 2006) und Titlis (Anbau 2005) traten die meisten Konzentrationsunterschiede bei unterschiedlichen Metaboliten auf Konzentrationen von β Alanin war in den organischen Anbauformen in beiden Sorten und Anbaujahren signifikant geringer

18 Protein-Profiling Extraktion von Gesamtprotein aus Weizenschrot - Fällung mit Aceton/TCA - Extraktion mit Lysepuffer mit nicht-ionischem Detergenz Auftrennung des Proteinextrakts in 2D-Gelelektrophorese: 1. Isoelektrische Fokussierung 2. SDS-PAGE Auswertung der Gele Massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen

19 Protein-Profiling von Weizen Zweidimensionale Gelelektrophorese Mw [kda] Organisch ph 3 Mineralisch ph 10 ph 3 ph 10 78,0 66,3 42,7 30,0

20 Probe A Gelauswertung Probe B 1) Einzelgele 2) Mittelwertgele + 3) Overlay (Ausschnitt)

21 Gelauswertung Overlay (Ausschnitt) 3D Ansicht relative Proteinexpression A B

22 Anzahl der Proben im Protein-Profiling vier Feldwiederholungen je Anbauform pro Feldwiederholung drei Extrakte und 2D-Gele fünf Anbauformen und zwei Anbaujahre 120 2D-Gele erstellen und auswerten (bis 1000 Proteine pro Gel) Fokussierung des Protein-Profiling auf Weizen dyn und min von zwei Anbaujahren Protein-Profiling in Weizen anderer Anbauformen mit gleichen Trends

23 Protein Profiling von Weizen aus den Anbauformen dyn und min 1049 verschiedene Proteine in 24 2D-Gelen detektiert 37 Proteine in ökologsich-dynamischen Weizen geringer exprimiert 2 Proteine in ökologsich-dynamischen Weizen verstärkt exprimiert Expressionsunterschiede bei diesen 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden

24 Identifizierung von Weizenproteinen mit unterschiedlicher Expression ph 3 ph 10 HMW Glutenin UE Mw [kda] Serpin GAP-DH LMW Glutenin Peroxidase Sample Gel Image: D2 48d Kopie

25 Proteine mit unterschiedlicher Expression Speicherproteine Globulin 1 5 HMW Glutenine 6 LMW Glutenine 2 Triticin-Vorläufer Enzyme Aldose-Reduktase ähnliches Protein β-amylase Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase granule bound Stärkesynthase-Vorläufer Peroxidase 1 Peroxiredoxin Stärkesynthase Saccharosesynthase Typ 2 2 Xylanasen, A-Ketten Familie Andere Eukariotischer Initiationsfaktor Serpin 13 Proteine nicht identifiziert

26 relative Proteinexpression 1,2 0,8 0,4 LMW Glutenin B A 0,4 0,2 HMW Glutenin Untereinheit 1By9 B A 0 dyn min 0 dyn min ökologisch konventionell ökologisch konventionell

27 0,9 0,6 0,3 0 Serpin A B dyn min ökologisch konventionell relative Proteinexpression

28 Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase Peroxidase 1 0,12 0,4 relative Proteinexpression 0,08 0,04 b a 0,3 0,2 0,1 b a 0 dyn min 0 dyn min ökologisch konventionell ökologisch konventionell

29 Zusammenfassung Protein Profiling 1049 Proteine detektiert, davon 132 per MALDI-TOF identifiziert 37 Proteine in ökologisch-dynamischem Weizen mit geringerer Expression überwiegend Speicherproteine wie Globuline, HMW und LMW Glutenine sowie Enzyme 2 Proteine in ökologisch-dynamisch Weizen mit erhöhter Expression eine Peroxidase und ein nicht identifiziertes Protein Expressionsunterschiede bei 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden Ergebnisse für organische und konventionelle Anbauform in Tendenz gleich

30 Schlussfolgerungen Weizen der verschiedenen Anbauformen im DOK Versuch sind nicht gleich: Signifikante Konzentrationsunterschiede von β-alanin und von 39 Proteinen wurden in zwei Anbaujahren festgestellt. Die signifikanten, aber kleinen, Unterschiede bedeuten keine ernährungsphysiologisch andere Qualität. Ökologisch und konventioneller Weizen ist gleichwertig.

31 Dank an Dr. Aiko Barsch (Universität Bielefeld) Dr. Paul Mäder (FiBL, Frick) Monika Null-Greulich (BfEL Detmold) Ursula Leckeband (BfEL Detmold)

32 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

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