MALDI-TOF-MS und FT-IR- Spektroskopische Methoden in der

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1 HERZLICH HERZLICH WILLKOMMEN MALDI-TOF-MS und FT-IR- Spektroskopische Methoden in der TIERGESUNDHEIT Mikrobiologie LEBENSMITTELSICHERHEIT VERBRAUCHERSCHUTZ Jörg Rau Futtermitteltag Karlsruhe

2 Untersuchung von Lebensmitteln + für die Tiergesundheit Detektion von Mikroorganismen - spektroskopischen Techniken IR MALDI-TOF-MS - Rolle der Spektroskopie in unserer Mikrobiologie Anwendung - Beispiele Schußfolgerungen / Ausblick????

3 Proben für die Mikrobiologie an den CVUAs Hygiene Monitoring - Lebensmittel & Wasser

4 Proben für die Mikrobiologie CVUAS Hygiene Monitoring Lebensmittel & Wasser LM-bedingte Erkrankungen

5 Proben für die Mikrobiologie CVUAS Humanpathogene Vergleichsisolate zu Erkrankungen vom Landesgesundheitsamt

6 Proben für die Mikrobiologie CVUAs / STUA Tiergesundheit TGD Pathologie

7 Nachweis von Bakterien Direktkultur Anreicherung mit Isolierung Kolonien / Isolate Kern-Aufgabe der Mikrobiologie: > Isolate benennen Isolat = Start der Identifizierung

8 Nachweis von Bakterien Isolat - Identifizierung Phänotypische Eigenschaften Biochemische Profile

9 Nachweis von Bakterien Isolat - Identifizierung genetische Eigenschaften PCR

10 Nachweis von Bakterien Isolat - Identifizierung per Spektroskopie Infrarot-Spektroskopie (IR) Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS)

11 Infrarotspektroskopie eine breit angewendete Technik T (IR) G T MT IR für Kunststoffe qualitativ und quantitativ (seit <<1980) Winescan (seit 2006) NIR für Grundparameter (seit 2008) IR in der Mikrobiologie (seit 2004)

12 Infrarotspektroskopie Reinkultur unter definierten Bedingungen Präparation auf den Probenträger Ergebnis nach < 2 h Messung im IR Vergleich mit Datenbank am PC

13 Infrarotspektroskopie Durch Infrarot-Strahlung (Wärmestrahlung) werden Moleküle zu Bewegung (Schwingungen, Rotationen) angeregt. Ein Teil der eingestrahlten Energie wird dabei absorbiert. Unterschiedliche chemische Bindungen absorbieren bei unterschiedlicher Energie, d.h. Wellenzahl.

14 Infrarotspektroskopie Unterschiede in der Zusammensetzung bedingen andere IR-Spektren. Das gilt für Kunststoffe, wie für Mikroorgansimen. z.b. Unterschiede im Zellwandaufbau

15 Infrarotspektroskopie Unterschiede in der Zusammensetzung bedingen andere IR-Spektren. Das gilt für Kunststoffe, wie für Mikroorgansimen. z.b. Unterschiede im Zellwandaufbau

16 Infrarotspektroskopie Für Mikroorganismen ergibt sich ein charakteristisches Muster fingerprint = molekularer Fingerabdruck Lipide Amide Mix Polysaccharide

17 Einsatz der FT-IR in der Routine Aufbau einer hausinternen Datenbank mit bekannten Isolaten Zuordnung von unbekannten Isolaten auf der Ebene von Genus Spezies Subspezies Pathogenitätsfaktoren Spektren beinhalten zudem individuelle Informationen ( Fingerabdrücke ) der Isolate Identität

18 Die Feld-Stammsammlung -70 C

19 Species of interest E coli a-proteobacteria g-proteobacteria other b-proteobacteria Taylorella, Bordetella Clostridium Streptococcus Lactobacillus Enterococcus Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus Yersinia 300 > Gram positive Tauschbörse Listeria spp. Salmonella Bacillus spp Gram negative Bacillus cereus grp. Actinomycetae Pasteurellales Legionella Vibrionales Pseudomonadales Bacterioides Flavobacterium Ornithobacterium Campylobacter

20 Nachweis von Bakterien Spektroskopische Methoden Isolat - Identifizierung Massenspektrometrie (MALDI-TOF)

21 Nachweis von Bakterien Spektroskopische Methoden Isolat - Identifizierung Massenspektrometrie (MALDI-TOF) Reine Kolonie

22 MS bei Mikroorganismen Massen konkreter Biomoleküle ribosomale Proteine - taxonomische Marker - Genus / Spezies

23 Prinzip Reine Kolonie Präparation auf den Probenträger Matrix-Mix Matrixkristall Analyt

24 MALDI-TOF MS

25 MALDI-TOF MS Flugrohr Matrixkristall Analyt Target

26 MALDI-TOF MS Matrixassisted Laser Desorption/ Ionisation Laserschuss + elektr. Feld + + elektr. Feld

27 MALDI-TOF MS Matrixassisted Laser Desorption/ Ionisation + + elektr. Feld Beschleunigung

28 MALDI-TOF MS Time Of Flight + + Drift / Trennung + +

29 MALDI-TOF MS Beschleunigung elektr. Feld

30 Ablauf Ergebnis nach < 15 min Identifizierung per Datenbank

31 Workflow Food Water Animal Standard Px enrichment selective agar biochemical diff. PCR (ail, stx..) isolates MALDI species database PCR sequencing 16S rdna/ rpob... isolate collection external serology specific tests FT-IR database species (B. cereus grp, Listeria) subspecies contamination route LIMS

32 Lebensmittelvergiftung April 2013 Notruf: Familienfeier im Restaurant 13 von 31 Personen leiden unter plötzlichen Bauchkrämpfen und Erbrechen.

33 Lebensmittelvergiftung 5 Kinder im Krankenhaus (1 Tag), 3 Erwachsene in ambulanter Behandlung => Diagnostisches Matrial (Kot, Erbrochenes) Der Notarzt vermutet einen LM-bedingten Ausbruch! => Probenahme durch LM-Überwachung sofort => Probenahme des Küchenpersonals

34 Lebensmittelvergiftung Menü Gänseleberterrine Makrele Proben der mikrobiologisch empfindlichen LM Forellenkaviar Jakobsmuscheln Kräuter und Algen Salat Aber die Kinder haben nur den Nachtisch gegessen Eiscreme in fünf Sorten

35 Lebensmittelvergiftung Menü Gänseleberterrine Makrele Forellenkaviar Jakobsmuscheln Kräuter und Algen Mikrobiologische Untersuchung Fokus auf Toxine, wg. der geschilderten Symptome Staphylococcus Enterotoxine Bacillus cereus Cereulid Die üblichen Verdächtigen Staphylococcus aureus Bacillus cereus Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Salat Eiscreme in fünf Sorten

36 Lebensmittelvergiftung Staphylococcus enterotoxin S. aureus Gänseleberterrine NEG NEG Makrele NEG NEG Forellenkaviar NEG NEG Jakobsmuscheln NEG NEG Kräuter und Algen NEG NEG Salat NEG NEG Eiscreme in fünf Sorten 3 x POS 5 x POS

37 Lebensmittelvergiftung S. aureus Isolate 5 von Lebensmittel 4 von Patienten 1 von Nasentupfer Küchenpersonal Bestätigung der klassischen Differenzierung mit MALDI-TOF-MS Vergleich der Human- und der Lebensmittelisolate mit FT-IR

38 CVUA = diff. S. aureus S. aureus Isolate von 4 Patienten Bruker Tensor27/HTS-XT IR-spectra n=2 vector normalized 500 to 1500 cm -1 second deriv. Ward s algorithm Stuhl und Erbrochenes von 4 Patienten

39 Zitrone-Joghurt 5 S. aureus Isolate aus Eiscreme Bruker Tensor27/HTS-XT IR-spectra n=2 vector normalized 500 to 1500 cm -1 second deriv. Ward s algorithm Pistazie Vanille Schokolade Erdbeere stool Stuhl and und vomit samples Erbrochenes von from 4 Patienten 4 patients

40 Zitrone-Joghurt Nasentupfer 1 Isolat von Nasentupfer Küchenpersonal Bruker Tensor27/HTS-XT IR-spectra n=2 vector normalized 500 to 1500 cm -1 second deriv. Ward s algorithm Pistazie Vanille Schokolade Erdbeere Stuhl und Erbrochenes von 4 Patienten

41 S. aureus t-typ Zitrone-Joghurt t084 Nasentupfer t160 Bundesinstitut für Risikobewertung NRL (LM-Isolate) Die IR-Gruppierung wurde komplett bestätigt mit genetischer Typisierung und Antobiotika-Resistentzprofil Robert Koch Institut NRZ (Human-Isolate) Pistazie Vanille Schokolade Erdbeere stool Stuhl and und vomit samples Erbrochenes von from 4 Patienten 4 patients t127 Fetsch et al., 2014; Int J Food Microbiol.

42 Anwendungen - Beispiele Lebensmittel Ausbruchsuntersuchungen: Staphylococcus aureus / Hochzeitsfeier Johler et al., FPD 2013 emetische Bacillus cereus / Kantine Rau et al., BMTW 2009

43 Anwendungen - Beispiele Lebensmittel Ausbruchsuntersuchungen: Staphylococcus aureus / Hochzeitsfeier Johler et al., FPD 2013 emetische Bacillus cereus / Kantine Rau et al., BMTW 2009 Unterstützung von Spezies-Beschreibungen Listeria fleischmannii Bertsch et al., IJSEV 2013 Bacillus cytotoxicus Guinebretiére et al., IJSEV 2013

44 Anwendungen - Beispiele Tiergesundheit Pasteurella multocida B Ausbruch: Damhirsche, Schweine, Rinder Soike et al., BMTW 2012

45 Anwendungen - Beispiele Tiergesundheit Pasteurella multocida B Ausbruch: Damhirsche, Schweine, Rinder Soike et al., BMTW 2012 Corynebacterium ulcerans in Wildschweinen; Rehen Contzen et al, 2011; ZPH roe deer roe deer 2010 Rau et al, 2012; BMTW Eisenberg et al., 2014; EID Verkäsende Entzündung der Lymphknoten

46 Anwendungen - Beispiele Tiergesundheit Pasteurella multocida B Ausbruch: Damhirsche, Schweine, Rinder Corynebacterium ulcerans in Wildschweinen; Rehen Rotmaulseuche der Forellen (Yersinia ruckeri, BT) Wortberg et al., JFD 2012

47 Anwendungen - Beispiele Tiergesundheit Pasteurella multocida B Ausbruch: Damhirsche, Schweine, Rinder Corynebacterium ulcerans in Wildschweinen; Rehen Rotmaulseuche der Forellen (Yersinia ruckeri, BT) Prävalenz von MRSA in drei Milchviehherden Spohr et al., ZPH 2011

48 Anwendungen - Beispiele Tiergesundheit Pasteurella multocida B Ausbruch: Damhirsche, Schweine, Rinder Corynebacterium ulcerans in Wildschweinen; Rehen Rotmaulseuche der Forellen (Yersinia ruckeri, BT) Vorkommen von MRSA in drei Milchviehherden Vorkommen von Y. enterocolitica in 6950 Kotproben von Hunden und Katzen Stamm et al., JCM 2013 Kuhm et al., AEM 2009

49 Was kann MALDI nicht? Feinst-Differenzierung Isolat-identität Antibiotika-Resistenz (IR, spezielle PCR) (z. Zt. Forschung) Eine Geldsparmaschine Abschreibung, Wartung, Validierung

50 Das können wir erwarten! Einen breiten Einsatz Akzeptanz - Offen für Erweiterungen (andere Ziel-Proteine) - Kombimöglichkeiten mit der IR - LIMS-Anbindung Lebensmittel, Veterinär-Medizin, Wasser... Sicherheit in der Artbestimmung Bakterien, Hefen, Schimmel Geschwindigkeit

51 Differenziert Isolate FT-IR vs. MALDI-TOF MS Jahr

52 IR & MALDI-TOF MS Lebensmittelchemie Veterinärmedizin Tierkrankheiten PCR Spec + LM Mikrobiologie zusätzliche Interdisziplinäre Verzahnung

53 Was bringt uns MALDI in BW? MALDI IR

54 Was bringt uns MALDI in BW? Kontaktfläche - Gegenseitige Unterstützung Ausfallhilfe Impulse intensiverer Austausch - gemeinsame Datenbank Validierung ext. Kooperationen

55 Zusammenfassung Die vorgeschriebenen klassischen Methoden wurden deutlich erweitert durch spektroskopische Methoden mit offenem Blick - MALDI-TOF MS (verlässliche Spezies Bestimmung) - FT-IR (Subspezies, Identität) Im Ergebnis - schneller Arbeitsgang - breite Anwendung in unserer Mikrobiologie für LM und Tiergesundheit

56 Zusammenfassung MALDI ist das Arbeitspferd + die Messlatte unserer Identifizierung IR ist der Schlüssel zur Verfolgung von Mikroorganismen Bleibt aber eine Paradiesvogel-Methode!

57 Spektroskopische Methoden sind ein neues, großes Fenster unserer Mikrobiologie!