Grundlagen der Gentechnik und Biotechnologie für Studierende der Pharmazie. Der Arzneischatz - Materia medica

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1 Grundlagen der Gentechnik und Biotechnologie für Studierende der Pharmazie Univ.-Prof. Dr. Rudolf Bauer Institut für Pharmazeutische Wissenschaften Karl Franzens Universität Graz R. Bauer 2008 Der Arzneischatz - Materia medica Die arzneilich genutzten Wirkstoffe stammen aus drei Bereichen: 1. Unbelebte Natur 2. Belebte Natur 3. Chemische Synthese Pharmakognosie = Lehre von den biogenen Arzneistoffen 1

2 Biogene Arzneistoffe / 1 Natürlich vorkommend * = Biotechnologische von Bakterien Gewinnung Vitamine* (z.b. Vit. B 12, Riboflavin) Antibiotika* (z.b. Bacitracin, Rifamycin, Tetracyclin) Kohlenhydrate* (z.b. Dextran) Enzyme* (z.b. Streptokinase, Hyaluronidase) von Pilzen Antibiotika* (z.b. Penicillin) Alkaloide* (z.b. Ergotamin) Enzyme* (z.b. Amylasen, Lipasen, Proteasen) von Pflanzen Primärstoffe* (z.b. Polysaccharide) Sekundärstoffe(*) (z.b. Morphin) Biogene Arzneistoffe / 2 Mit Enzymen modifiziert (Biokonversion) mit Hilfe der Enzyme von Bakterien z.b. Prednisolon, Ascorbinsäure, Ephedrin mit Hilfe der Enzyme von Pilzen z.b. Cortisol, Sexualhormone, Herzglykoside Gentechnologisch gewonnen naturidentisch (z.b. Humaninsulin) modifizierte Naturstoffe, Muteine (z.b. Insulin Lispro) 2

3 Definitionen Biotechnologie = Prozesse zur Herstellung von Produkten durch lebende Organismen oder isolierte Enzyme Gentechnologie = Methoden, die der Isolierung, Charakterisierung, Vermehrung und Neukombination von Genen dienen Geschichtliche Entwicklung der Biotechnologie Verwendung von Bierhefe und Sauerteig in den Hochkulturen Ägyptens und Mesopotamiens Vergärung von Traubensaft zu Wein bereits in der Bibel erwähnt Käseherstellung im antiken Griechenland mittels Feigenextrakt und Labferment Louis Pasteur ( ) entwickelt Theorie der Fermentation und den Prozess des Pasteurisierens Robert Koch ( ) isoliert und beschreibt zahlreiche Mikroorganismen Alexander Fleming ( ) entdeckt 1928 das Penicillin 3

4 Biotechnologisch hergestellte Arzneimittel Biotechnologisch hergestellte Arzneimittel Aminosäuren (z.b. Glutaminsäure, Tryptophan) Antibiotika (natürliche und modifizierte; z.b. Penicillin) Antimykotika (zb. Griseofulvin) Corticosteroide und Sexualhormone (Semisynthese aus pflanzlichen Vorstufen) Herzglykoside (Modifizierung pflanzlicher Vorstufen) Vitamine (z.b. Vit. B12, Ascorbinsäure, Riboflavin) Monoklonale Antikörper Immunsuppressiva (z.b. Cyclosporin A) Zytostatika (z.b. Actinomycin) 4

5 Geschichtliche Entwicklung der Gentechnologie 1944 Entdeckung der DNA als Träger der Erbinformation durch Oswald Theodor Avery 1953 Aufklärung der räumlichen Doppelhelix-Struktur der DNA durch James Watson und Francis Crick (Nobelpreis 1962) 1973 Herstellung des ersten "rekombinanten" Bakteriums durch Stanley Cohen und Herbert Boyer 1977 gelingt es erstmals, ein menschliches Gen zu klonen, es in ein Bakterium einzuschleusen und damit ein für den Menschen nützliches Protein (das Hormon Somatostatin) herzustellen 1982 das weltweit erste gentechnisch hergestellte Medikament (rekombinates Human-Insulin) kommt auf den Markt 1995 erstes genetisch manipuliertes Lebewesen, die Krebsmaus, wird patentiert 2000 vollständige Entschlüsselung des menschlichen Genoms Oswald Avery Stanley Cohen und Herbert Boyer James Watson und Francis Crick 5

6 DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Arzneimittel Hormone Zytokine Enzyme Impfstoffe Gerinnungsmodulatoren Antikörper In der EU sind gegenwärtig ca. 93 verschiedene DNArekombinationstechnisch hergestellte Proteine als Wirkstoffe zugelassen. Ca. 400 befinden sich weltweit in der Entwicklung, über 150 davon gegen Krebs. 6

7 Umsatz mit DNA-rekombinantionstechnisch hergestellten Arzneimitteln Umsatz (Millionen Euro) Impfstoffe Anti-Diabetes Immunstimulanzien Arzneimittel gegen Blutkr... Hormone Sexualhormone Andere Gesamt 7

8 8

9 In der Biotechnologie tätige Firmen Abott Laboratories, US American Home Products, US Aventis, F/D Baxter International, US Bayer, D Boehriner-Ingelheim, D Bristol Meyers Squibb, US GlaxoSmithKline, UK Johnson & Johnson, US Merck & Co, US Novartis, CH u.v.a.m. 9

10 Grundlagen der Gentechnik und Biotechnologie für Studierende der Pharmazie Stoffgebiete Definitionen und geschichtliche Entwicklung Methoden der Bio- und Gentechnologie Biotechnologische Prozesse Mikrobielle Produkte Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen zur Arzneistoffproduktion Produkte tierischer und menschlicher Zellen Gesetzliche Grundlagen Gesellschaftliche und ethische Aspekte Grundlagen der Gentechnik und Biotechnologie für Studierende der Pharmazie Vorlesungseinheit* Datum Vortragender Inhalt 1,2 9. März 2006 Bauer Definition, Geschichte 3,4 16. März 2006 Brantner Mikrobielle Produkte 5,6 23. März 2006 Brantner Mikrobielle Produkte 7,8 30. März 2006 Brantner Mikrobielle Produkte 9,10 6. April 2006 Brantner Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen 11, April 2006 Brantner Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen 13,14 4. Mai 2006 Brantner Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen 15, Mai 2006 Bauer Methoden und Prozesse 17, Mai 2006 Bauer Methoden und Prozesse 19,20 1. Juni 2006 Bauer Methoden und Prozesse 21,22 8. Juni 2006 Bauer Produkte tierischer und menschlicher Zellen 23, Juni 2006 Bauer Produkte tierischer und menschlicher Zellen 25, Juni 2006 Bauer Produkte tierischer und menschlicher Zellen 27, Juni 2006 Brantner Gesetze, Gesellschaft * jede Vorlesungseinheit hat 49 min Prüfungen:? 10

11 Literatur Kreis, Baron, Stoll: Biotechnologie der Arzneistoffe, Dtsch. Apotheker Verlag, Stuttgart, 2001 Kayser, Müller: Pharmazeutische Biotechnologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 2000 Dingermann, Hänsel, Zündorf: Pharmazeutische Biologie, Springer-Verlag, Heidelberg, 2003 Dingermann, Zündorf: Gentechnik/Biotechnik: Lehrbuch und Kompendium für Studium und Praxis. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1999 Brown: Gentechnologie für Einsteiger, 3. Aufl., Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2002 Heß: Biotechnologie der Pflanzen, UTB, Stuttgart, 1992 Biotechnologie Bioverfahrenstechnik Produktionstechnik Entsorgungstechnik Produkt-Isolierung Immobilisierung Technik Apparatebau Meß- und Regeltechnik Prozesstechnik Biologie Mikrobiologie Zellbiologie Zellkultur Biotechno logie Chemische Verfahrenstechnik Reaktionstechnik Aufarbeitung Trennprozesse Biochemie Enzymchemie Molekularbiologie Gentechnik Chemie Analytische Chemie Physikalische Chemie Naturstoff-Chemie 11

12 Biotechnologische Gewinnung von Arzneimitteln Fermentationsverfahren Zell- und Gewebekultur Vorteile biotechnologischer Verfahren Nutzung nachwachsender Rohstoffe statt fossiler Ausgangsstoffe Verminderter Energiebedarf durch eine Prozessführung bei Raumtemperatur und Normaldruck Verringerte Umweltbelastung durch Ausschluss aggressiver Medien Abkürzung von teilweise vielstufigen klassischen Verfahren der Chemie durch eine Fermentationsstufe mit geringer Nebenproduktbildung Biotechnologische Verfahren sind oft die einzig möglichen Herstellungswege bestimmter Produkte 12

13 Nachteile biotechnologischer Verfahren Arbeiten unter sterilen Bedingungen Schwankungen der Zusammensetzung komplexer Medien Gefahr der Ausbeutungsschwankungen bei instabilen biologischen Systemen Aufwändige Aufreinigungen der gewonnenen Rohprodukte Beseitigung von Bioabfallmasse Beseitigung von Fermentations- und Aufarbeitungsabwässern z.t. ungünstige Produkt/Volumen/Zeit-Ausbeuten Einhaltung gesetzlicher Sicherheitsvorschriften hohe Kosten Biotechnologische Prozesse Drei Phasen: Substratvorbereitung Produktionsprozess (Fermentation) Produktaufbereitung ( downstream processing ) 13

14 Biotechnologische Prozesse Voraussetzung für das Arbeiten mit Mikroorganismen, Zellen und Geweben: selektive Isolierung bzw. Anreicherung aus ihrer natürlichen Umgebung Mikroorganismen z.b. aus Bodenproben tierische Zellen aus Geweben oder Körperflüssigkeiten pflanzliche Zellkulturen aus Wundkallus z.t. Rückgriff auf Stammsammlungen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen DSM, American Type Culture Collection ATCC) 14

15 Nährmedien: Biotechnologische Prozesse müssen alle für das Wachstum erforderlichen Substrate und Wuchsstoffe enthalten Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten Phosphor- und schwefelhaltige Verbindungen (PO 4 2-, SO 4 2- ) anorganische Ionen (Ca 2+, Mg 2+, Na +, K + ) Spurenelemente (Zn 2+, Mn 2+ ) Ziel ist die Verwendung von chemisch definierten synthetischen Medien ( Minimalmedien ) enthält das Nährmedium auch Zusätze, die der Organismus selbst produzieren könnte, spricht man von Vollmedien Biotechnologische Prozesse Kohlenstoffquellen: Zucker, Alkohole, Zuckeralkohole, kurzkettige organische Säuren Maismehlextrakt, Sojamehlextrakt, Malzextrakt, Melasse, Peptone, Caseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt) Stickstoffquellen Ammoniumsalze N-haltige organische Verbindungen Aminosäuren Nitrate 15

16 Wachstum und Vermehrung Wachstum = irreversible Zunahme der Biomasse (Wachstum wird gemessen als Zunahme der Zellmasse pro Volumeneinheit) Wachstumsrate µ = Anzahl der Zellmasseverdoppelungen pro Zeiteinheit Teilungsrate ν = Anzahl der Verdoppelungen der Zellen bzw. Organismen pro Zeiteinheit Generationszeit g = Zeit, die für die Verdoppelung der Zellen bzw. Organismen benötigt wird Wachstum und Vermehrung Bakterien teilen sich alle min (ggf. Synchronkultur) Pilzzellen (Hefen) teilen sich alle 1-2 Stunden bei pflanzlichen Zellen liegen die Verdoppelungszeiten bei Stunden bei tierischen Zellen findet in Kultur unter optimalen Bedingungen alle 24 h eine Zellteilung statt; häufig finden in Kultur nur wenige Zellzyklen statt (Primärkultur); Sekundärkulturen sind begrenzt kultivierbar (ca. 50 Passagen); permanente Kulturen lassen sich nur mit Krebszellen oder durch Fusion von nicht entarteten Zellen mit Tumorzellen entstandenen Zellen ( Hybridomazellen ) erzielen 16

17 17

18 Kinetik des Wachstums Bestimmung der Wachstumskinetik Messung des Proteingehaltes Messung der Nucleinsäuremenge photometrische Trübungsmessungen Zählung der Zellen (Thoma-Kammer) 18

19 Kinetik des Wachstums Wachstumskurve einer bakteriellen Massenkultur 6 1 = Lag-Phase (Latenzphase) 2 = Progressive Phase 3 = Log-Phase 4 = Dezelerationsphase 5 = Stationäre Phase 6 = Absterbephase Der Stoffwechsel der Produzenten der Stoffwechsel dient primär der Erhaltung und Vermehrung der Zellsubstanz drei Hauptabschnitte: Katabolismus Intermediärstoffwechsel Anabolismus die Prozesse der Energiegewinnung und der Bereitstellung von Biosynthesebausteinen dienen, werden dem Primärstoffwechsel zugeordnet Biosynthesewege, die zu Stoffen führen, die nur in bestimmten Taxa vorkommen und häufig Verteidigungsaufgaben haben, werden als Sekundärstoffwechsel bezeichnet 19

20 Biosynthetische Leistung einer mikrobiellen Massenkultur Nährstoffe 6 Trophophase Idiophase Produktion von Produktion von Primärmetaboliten Sekundärmetaboliten Fermentationsprozesse Definitionen von Fermentation : Biochemie: Fermentation = Prozesse, bei denen unter anaeroben Bedingungen Energie gewonnen wird, wobei organische Verbindungen als Elektronendonatoren und -akzeptoren fungieren Mikrobiologie: Fermentation = Prozesse, die zur Produktion eines definierten Produktes durch Massenkulturen führen Ein Fermentationsprozess ist charakterisiert durch den Produzenten, den Bioreaktor und das Verfahren. 20

21 Fermentationsprozesse Produzenten: Enzyme (frei oder immobilisiert) einzellige Organismen fädig organisierte Bakterien und Pilze aus Organismen isolierte Zellen und Organe Pflanzen und Tiere Enzyme Enzyme sind von Organismen gebildete Katalysatoren, die dafür sorgen, daß die biochemischen Reaktionen einer Zelle unter physiologischen Bedingungen rasch und koordiniert ablaufen können sie beschleunigen die Einstellung eines chemischen Gleichgewichtes manche Enzyme benötigen Cofaktoren (Coenzyme), die unabhängig vorkommen oder mit dem Enzym kovalent verbunden sein können (prosthetische Gruppen) Enzyme arbeiten nur unter spezifischen ph- und Temperaturbedingungen 21

22 Gewinnung von Enzymen Ausgangsmaterial Mikroorganismen/Pilze (z.b. Amylasen, Cellulasen, Penicillinase) Pflanzliches Material (z.b. Papain, Bromelain, Ficin) Tierisches Material (z.b. Pepsin, Chymosin, Thrombin, Lipase, Fibrinolysin) Menschliches Blut oder Harn (z.b. Blutgerinnungsfaktoren) Rekombinante DNA Technologie (z.b. Desoxyribonuclease I; β-glucocerebrosidase) Gewinnung von Enzymen Probleme bei der Isolierung liegen meist in einer Mischung von bis zu 1000 Proteinen vor Struktur und Aktivität muß erhalten bleiben Empfindlichkeit gegenüber ph Temperatur Salzkonzentration Sauerstoff mechanische Scherkräfte Jedes Enzym erfordert eine spezifische Reinigungsstrategie 22

23 Gewinnung von Enzymen Extraktion und Reinigung Herstellung eines Rohextraktes (Zellaufschluss; Entfernung der Zellwände/-membranen bei gelösten Enzymen) Entfettung mir org. Lösungsmitteln Optional: Entfernung von Nukleinsäuren mit Protaminsulfat (NH 4 ) 2 SO 4 Fällung ( Aussalzen ); das zu gewinnende Protein soll eben in Lösung bleiben Dialyse Ultrazentrifugation Chromatographische Trennung Elektrophorese Kristallisation Enzymkinetik Umsetzungsgeschwindigkeit abhängig von Temperatur ph-wert Anwesenheit von Coenzymen/Ionen Substratkonzentration Wechselzahl k cat (turn over number) gibt an, wie viele Substratmoleküle ein Enzym pro Sekunde oder Minute umsetzen kann ist Maß für Umsetzungsgeschwindigkeit, Umsetzungsdauer und Reaktionswirkstärke Michaelis-Menten-Konstante K m gibt jene Substratkonzentration (Mol/L) an, bei der die halbmaximale Umsetzungsgeschwindigkeit erreicht wird Lineweaver-Burk-Darstellung 23

24 Immobilisierte Enzyme Möglichkeiten der Immobilisierung: Chemisch Adsorption ionische Wechselwirkung kovalente Bindung Azid-Methode Carbodiimid-Methode Isothiocyanat-Methode Cyanogenbromid-Methode Azo-Methode Physikalisch ( Einschlußimmobilisierung ) Einbettung in Polymermatrix (z.b. Agar, Alginate, Gelatine, Pektin) Mikroverkapselung, Liposomen Membran-Einschluß Biotechnologische Anwendung Enzymreaktoren Beispiele: Stärkeverarbeitung Herstellung von β-d-glucose mittels α-amylase und Glucan-1,4-α-glucosidase Chemische Modifizierung von Steroiden Herstellung von Aminosäuren mittels Aminosäure- Dehydrogenasen (reduktive Aminierung von α- Ketocarbonsäuren) Umwandlung von Penicillin G in 6-Aminopenicillansäure mittels Penicillin-G-Acylase Enzymatische Aspartamsynthese mittels Thermolysin Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure 24

25 Verwendung von Mikroorganismen und Zellen in der Biotechnologie Besonderheiten: komplexer Stoffwechsel Fähigkeit zur Reproduktion bzw. Vermehrung Kompartimentierung (erfordert Diffusionsvorgänge) Regulationsmechanismen der Transkription und Translation (Repressoren, Stimulatoren, Transkriptionsfaktoren) Möglichkeit der negativen Rückkopplung immobilisierte Multienzymsysteme mit effizienter Cosubstrat-Regenerierung, in denen komplexe Stoffumwandlungen koordiniert und reguliert ablaufen 25

26 Immobilisierte Zellen Zellen lassen sich ähnlich wie Enzyme immobilisieren Diffusionsvorgänge in der Matrix sind bei der Einschlußimmobilisierung zu berücksichtigen verringerte Empfindlichkeit gegenüber den im Bioreaktor auftretenden Scherkräften Wiederverwertbarkeit ermöglicht kontinuierliche Prozessführung Voraussetzung ist, dass das Produkt in das Nährmedium abgegeben wird (bei Mikroorganismen häufig, bei Pflanzenzellen selten) Produktbildung sollte nicht mit dem Wachstum gekoppelt sein (Sprengen der Matrix) Immobilisierte Zellen Bsp.: Essigsäureproduktion 26

27 Bioreaktoren Apparaturen, in denen Enzyme, Zellen, Organe oder Organismen für Produktionszwecke inkubiert bzw. kultiviert werden ( Fermenter ) müssen an die Ansprüche der biologischen Systeme angepasst werden Oberflächen- (Emerskultur) und Submersverfahren anaerobe und aerobe Prozesse Prozessparameter (Temperatur, ph-wert, Nährstoffe, Spurenelemente) müssen berücksichtigt und kontrolliert werden Reaktorgröße muß an die Produktionsrate angepasst werden Bioreaktortypen Fassungsvermögen: Laborreaktor: < 50 Liter Versuchsreaktor: Liter Betriebsreaktor: Liter 27

28 Bioreaktortypen Fassungsvermögen: Laborreaktor: < 50 Liter Versuchsreaktor: Liter Betriebsreaktor: Liter Durchmischung: mechanisch (verschiedene Rührwerke) - Propellerrührer - Schrägblattrührer - Scheibenrührer - Impellerrührer - Mehrstufen-Impuls-Gegenstromrührer (MIG-Rührer) - Kreuzbalkenrührer - Blattrührer - Ankerrührer - Wendelrührer niedrigviskose Medien hochviskose Medien: hydrodynamisch (Pumpen) pneumatisch (Airlift-Reaktor) mittelviskose Medien Schema eines Fermenters 28

29 Bioreaktortypen Spezielle Formen: Gärtassen-Reaktor Membranreaktoren Hohlfaser-Reaktor Bioreaktoren für immobilisierte Biokatalysatoren Festbettreaktoren ( packed bed ) Wirbelschicht- oder Fließbettreaktor Bioreaktortypen 29

30 Betriebsarten von Bioreaktoren Satzbetrieb (batch-verfahren): diskontinuierlich Zulaufverfahren (fed-batch-betrieb): Kulturvolumen nimmt zu repetitives Zulaufverfahren (repeated fed-batch): semi-kontinuierlich mit höherer Produktivität Zweistufenprozess: (two-stage batch-verfahren) teilweiser oder völliger Austausch des Nährmediums nach bestimmter Zeit; repetitiv: semikontinuierlich Kontinuierliche Prozesse: Turbidostat Chemostat (Perfusionsbetrieb) Scale-Up biotechnologischer Prozesse gleicher spezifischer Leistungseintrag (Rührleistung pro Volumen) gleiche Umfanggeschwindigkeit des Rührers (konstante Scherung) gleiche Sauerstoffeintragsrate (OTR) gleicher volumetrischer Stoffübergangskoeffizient k L a (Sauerstoff-Transportkoeffizient) gleiche Reynoldszahl R e (Rührerdurchmesser, Drehzahl, Dichte, Viskosität) Bioprozessanalytik und Regelungstechnik sind sehr wichtig 30

31 Produktisolierung und -reinigung Abtrennung von Produzent und Nährmedium Filtration (bei Partikelgröße von ca. 1 µm) Oberflächenfiltration (Filterkuchen) Tiefenfiltration Siebfiltration Ultrafiltration (Molekülgröße von 0,1 nm - 1 µm) Reverse Osmose (Moleküle < 0,1 nm) Zentrifugation Flockung und Flotation Produktisolierung und -reinigung Zellaufschluß tierische Zellen Gefrieren und anschließendes Vermahlen osmotischer Schock pflanzliche Zellen lassen sich durch Scherkräfte nach dem Trocknen gut aufschließen Mikroorganismen wegen geringer Größe und Stabilität schwer aufzuschließen Aufschluß durch Scherkräfte in Lösung (Homogenisator) Ultraschallaufschluß Verwendung von hohem Druck und anschließender Entspannung (Versprühen) 31

32 Produktisolierung und -reinigung Anreicherung und Extraktion Aufkonzentrierung in Durchlauferhitzern, Fallfilmverdampfern, Dünnschichtverdampfern oder Zentrifugaldünnschichtverdampfern Fällung Extraktion durch Flüssig-Flüssig-Verteilung Membranfiltration Ultrafiltration (MG > 1000 D) Umkehrosmose Fallfilmverdampfer Dünnschichtverdampfer Produktisolierung und -reinigung Reinigung chromatographische Verfahren Ionenaustausch Kristallisation Trocknung Kontakttrockner Konvektionstrockner (Sprühtrocknung) Strahlungstrockner Gefriertrockner Kontakttrockner 32

33 Präparative Methoden in der Gentechnik Quellen: Bodenproben tote Materialien lebende Materialien Isolierung von DNA Extraktion der DNA mit Phenol/Chloroform 1. Vorbereitung von Phenol und Chloroform Vorbereitung von Phenol und Chloroform für die Extraktion der DNA Schmelzen bei 68 C Zugabe von 8-Hydroxychinolin (Endkonz. 0,1 %) 2 x Extraktion mit gleichem Volumen 1 M Tris- Puffer, ph 8,0 weitere Extraktionen mit gleichem Volumina 0,1 M Tris-Puffer, ph 8,0 + 0,2 % 2-Mercaptoethanol bis ph > 7,6 Lagerung bei 4 C für max. 1 Monat Chloroform wird im Verh. 24:1 mit Isoamylalkohol gemischt 33

34 Präparative Methoden in der Gentechnik Quellen: Bodenproben tote Materialien lebende Materialien Isolierung von DNA Extraktion der DNA mit Phenol/Chloroform 1. Vorbereitung von Phenol und Chloroform 2. Lyse der Zellen 3. Extraktion (zur Abtrennung von Proteinen und RNA) Fällung der DNA mit Ethanol Präparative Methoden in der Gentechnik Minipräparation von Plasmid-DNA Problem: großer Überschuss an DNA im Vgl. zu Plasmiden selektive Abtrennung der Plasmid-DNA in speziellen 1,5 ml Plastik-Reaktionsgefäßen ( Mini-Preps ) müssen vorher zur Entfernung der allgegenwärtigen DNasen autoklaviert werden Reinigung von Plasmid-DNA an Glasfaser-Säulen Selektive Adsorption von Plasmid-DNA an Glasfaser- oder Silica-Materialien in Gegenwart chaotroper Reagenzien (Guanidin-HCl, Guanidin-isothiocyanat) Isolierung von 10 µg Plasmid-DNA aus 0,5-4 ml Bakteriensuspension in < 40 min 34

35 Präparative Methoden in der Gentechnik DNA-Reinigung durch Gradientenzentrifugtion an CsCl Eignet sich zur Isolierung von Bakteriophagen-DNA, zur Trennung von kovalent geschlossener zirkulärer Plasmid- DNA, von geknickter und linearer DNA, sowie zur Isolierung von RNA Proteine, DNA und RNA werden voneinander getrennt (Alternative zur Phenol/Chloroform-Extraktion) Dauer: 36 Stunden Zentrifugenröhrchen aus Zellulosenitrat Proben werden im UV-Licht mit einer Spritze entnommen (DNA wird mit Ethidiumbromid (cave!) sichtbar gemacht) 35

36 Präparative Methoden in der Gentechnik DNA-Isolierung durch Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Gelelektrophorese: Wanderung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Verwendetes Gel-Material und Vernetzungsgrad hängt von der Größe der zu isolierenden DNA ab Agarosegele: große DNA-Fragmente mit max. 60 kb Polyacrylamidgele: kleine DNA-Fragmente mit min. 10 Nukleotiden trennbare Mengen: 0,2-10 µg DNA Wiedergewinnung der DNA aus Agarosegelen: Bande wird aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA durch Elektroelution in einen Dialyseschlauch oder durch Elektrophorese auf eine Dialysemembran extrahiert Wiedergewinnung der DNA aus Polyacrylamidgelen: Extraktion mit Ammoniumacetat-Puffer + EDTA, ph 8 36

37 Präparative Methoden in der Gentechnik Isolierung von mrna Isolierung der gesamten zellulären RNA: Extraktion von Zellen oder Gewebe mit Guanidin und heißem Phenol Extraktion von Zellen oder Gewebe mit Guanidinisothiocyanat und anschließender CsCl-Gradientenzentrifugation Isolierung der Poly(A)-RNA: Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-cellulose mit Oligo(dT) 20 -Sonde und Streptavidin-beschichteten magnetischen Polystyrolkügelchen ggf. kann gleich die Reverse Transkription angeschlossen werden 37

38 Präparative Methoden in der Gentechnik Markierung von DNA mittels Nick-Translation: Radioaktive Markierung mit 32 P-Desoxynucleotiden mittels [α- 32 P]dATP, DNA-Polymerase I und Ligase Nicht-Radioaktive Markierung durch Einbau von Digoxigenin-markiertem dutp (DIG-dUTP) Endmarkierung mittels Klenow-Fragment: zur Markierung von 4-8 Nukleotiden an den durch Restriktionsenzyme entstandenen klebrigen Enden der DNA diese werden mittels [α- 32 P]dATP und dem Klenow- Fragment aufgefüllt das Klenow-Fragment wird durch enzymatische Spaltung der Polymerase I mit Subtilisin erhalten (besitzt nur noch die 5-3 -Polymerase- und die 3-5 -Exonucleaseaktivität) Präparative Methoden in der Gentechnik Reverse Transkriptase (RT) RNA-abhängige DNA-Polymerase wird verwendet um mrna in cdna umzuschreiben wird aus Virus-infizierten Zellen gewonnen; z.b. aus Knochenmarkzellen von Geflügel, die mit dem Avian- Myeloblastose-Virus (AMV) oder dem Rous-Sarkom-Virus (RSV) infiziert wurden die Reverse Transkriptase verfügt über drei enzymatische Aktivitäten: 5 3 Polymerase 5 3 Exoribonuclease (hydrolysiert DN 3 5 Exoribonuclease 38

39 Präparative Methoden in der Gentechnik Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) millionenfache Vervielfältigung eines DNA-Abschnitts innerhalb weniger Stunden drei Schritte (in einem Gefäß) 1. Trennen der DNA-Doppelhelix in zwei Einzelstränge bei 95 C 2. Abkühlen auf C und Zugabe von zwei unterschiedlichen Primern (Primer-Annealing), freien Nukleotiden und Puffer (Mg 2+ ) 3. Verlängerung (Elongation) der Primer und Synthese der komplementären DNA-Stränge mittels Taq-DNA-Polymerase bei 70 C ein Zyklus ist nach 3-4 Minuten abgeschlossen programmierbare PCR-Automaten (Theromcycler) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 39

40 Präparative Methoden in der Gentechnik Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Anwendungsmöglichkeiten: pränatale Diagnostik Lokalisation von Gendefekten Identifizierung von Pathogenen im Blut und Blutprodukten Gewebetypisiserung vor Organtransplantationen Vaterschaftsbestimmung Kriminalistik Ahnenforschung Evolutionsforschung Identifizierung von Pathogenen in Wasserproben und Nahrungsmitteln Gewinnung von DNA für Gentechnologie 40

41 Analytische Methoden in der Gentechnik Minigele (ca. 4 cm x 5 cm) Agarose- und Acrylamidgele (homogen oder Gradientengele) Probenvolumen: 1-3 µl Anfärbung der DNA mit Silbernitrat Empfindlichkeit: pg DNA pro Bande z.t. automatisierte Durchführung Analytische Methoden in der Gentechnik Southern-Blot DNA-Transfer-Technik zur Erkennung von DNA mit bestimmten Basensequenzen Auftragemenge: 0,2-10 µg DNA zunächst Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese Transfer aller aufgetrennten DNA-Fragmente auf eine Nitrocellulose- oder Nylon Membran ( Blotting ) mittels Diffusion oder Elektroblotting Fixierung auf Nitrocellulose durch 2 h Backen bei 80 C oder auf Nylonmembran durch Bestrahlung mit UV 254 nm Hybridisierung mit markierten DNA-Sonden (komplementär zu den gesuchten Genen) in einem verschlossenen Plastikbeutel (3-16 h) Autoradiographie oder nicht-radioaktive Visualisierung der hybridisierten DNA 41

42 Analytische Methoden in der Gentechnik Northern-Blot qualtitativer und quantitativer Nachweis von RNA durch Hybridisierung mit bekannten DNA-Fragmenten gelelektrophoretische Auftrennung der RNA-Präparation unter denaturierenden Bedingungen (Alkali, Formaldehyd, Glyoxal oder Harnstoff) Transfer der aufgetrennten RNA-Fragmente auf eine Membran (Diazobenzyloxymethyl-(DBM)-Papier, Nitrocellulose oder Nylon) und Fixierung spezifischer RNA-Nachweis durch Hybridisierung mit markierten DNA-Sonden Analytische Methoden in der Gentechnik Western-Blot spezifischer Nachweis von Proteinen mit enzymmarkierten Antikörpern nach gel-elektrophoretischer Auftrennung und Blot auf eine Membran es werden Membranen aus Nylon, Nitrocellulose oder Polyvinyldifluorid (PVDF) verwendet für die Kopplung an Antikörper werden verwendet: Meerrettichperoxidase (POD) β-galactosidase (β-gal) alkalische Phosphatase (AP) für die Sichtbarmachung werden präzipitierende chromogene Substrate oder Chemilumineszenz-Substrate verwendet 42

43 Neukombination von Genen (Genetic Engineering) Die Gentechnologie eröffnet die Möglichkeit zur Kombination von Erbmaterial über die Artgrenzen hinweg! Einsatz der Gentechnologie: Herstellung rekombinanter Proteine Herstellung rekombinanter Antikörper Herstellung von Impfstoffen (Protein- und DNA- Impfstoffe) Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen (PCR, DNA-Fingerprint) Gentherapie (ex vivo und in vivo) Krebstherapie (Interferone, Cytokine) DNA-Übertragung in Zellen Die Übertragung von DNA in fremde Wirtszellen, die Vermehrung der DNA und die Expression von Proteinen in diesen Zellen, sind die Schlüsselprozesse der Gentechnik. Transformation = Übertragung von DNA in prokaryontische Zellen Transduktion = Übertragung von DNA in prokaryontische Zellen mittels Bakteriophagen Transfektion = Übertragung von DNA in eukaryontische Zellen 43

44 Vektorsysteme Vektoren = Hilfsmittel der Gentechnik, um fremdes Erbmaterial in Zellen einzuschleusen ( Genfähren ) besitzen ein Replikationssystem, meist in Form eines Replikationsursprungs (ori), eventuell mit der zusätzlichen genetischen Information für notwendige Proteinfaktoren tragen Markergene, meist in Form von Antibiotikaresistenzen, auf deren Expression hin selektiert werden kann weisen Klonierungsstellen auf, d.h. Basensequenzen mit Erkennungsstellen für bestimmte Restriktionsendonukleasen 44

45 Expressionssysteme für DNArekombinationstechnisch hergestellte Arzneistoffe Die Wirt-Vektor-Kombinationen, werden als Saatgutsysteme (seedlot systems) bezeichnet und müssen für die Arzneistoffproduktion validiert und von der European Medical Evaluation Agency (EMEA) genehmigt werden. Bakterien (Escherichia coli) Hefepilze (Saccharomyces cerevisiae) Säugerzelllinie CHO ( Chinese hamster ovary cells ) Säugerzelllinie BHK ( baby hamster kidney cells ) humane Hautzell-Linien Transgene Tiere (im Versuchsstadium) Transgene Pflanzen (im Versuchsstadium) Ein Saatgutsystem besteht aus einer Master-Zellbank und einer von der Master-Zellbank abgeleiteten Arbeitszellbank. Expressionssysteme für DNArekombinationstechnisch hergestellte Arzneistoffe 45

46 Transformation von Bakterien Transformation von Bakterien Kalziumchloridmethode Bakterien werden kompetent gemacht (Zustand erhöhter Aufnahmefähigkeit für DNA), indem sie h bei 4 C mit einer 50 mm CaCl 2 -Lösung in 10 mm Tris-Puffer (ph 8,0) behandelt werden danach erfolgt die Zugabe der DNA (ca. 40 ng) in Form eines Vektors (meist Plasmide); 30 min Inkubation bei 0 C; 2 min bei 42 C geringe Ausbeute (nur 1 von DNA-Molekülen wird erfolgreich übertragen) es muss eine Selektion der erfolgreich transformierten Bakterien erfolgen (über Resistenzgene) man unterscheidet transiente und stabile Transformationen 46

47 Escherichia coli als Expressionssystem Vorteile Leicht und preiswert kultivierbar leicht über Plasmide transformierbar sehr stoffwechselaktiv Nachteile und Probleme Bakterien fehlt die Enzymausstattung zum Herausschneiden der Introns (Splicing) das betreffende Gen kann eine Sequenz enthalten, die einer Terminatorsequenz in E. coli ähnelt ein Codon kann für E. coli unüblich sein keine posttranslationalen Modifikationen (Glykosilierungen unterbleiben) Proteine werden nicht richtig gefaltet (Chaperone fehlen) Proteine werden in Einschlußkörperchen sezerniert ev. intensive und verlustreiche Aufarbeitung notwendig Escherichia coli als Expressionssystem Beispiele Human-Insuline der Firmen Berlin-Chemie, Sanofi-Aventis und Lilly Insulin Mutein Lispro der Fa. Lilly (Humalog R ) Somatotropin (human growth hormon HGH) Reteplase der Fa. Boehringer Mannheim (Rapilysin R ) 47

48 Transformation von Hefezellen Bisher über drei verschiedene Vektortypen: Plasmidvektor: 2-Micron-Plasmid Länge von 6318 bp hat keine eigenen Selektionsmarker durch Kombination mit bakteriellen Plasmiden können Schaukelvektoren (shuttle vectors) konstruiert werden, die sich sowohl in E. coli als auch in S. cerevisiae replizieren ARS-Vektoren ringförmige Vektoren, die den Replikationsstartpunkt des Hefegenoms tragen ( ARS-Abschnitt = autonome replicable sequences) und Teile von bakteriellen Plasmiden mit Markergenen enthalten Minichromosomen YAC (yeast artifical chromosomes) verhalten sich ab einer Größe von 150 kb wie richtige Chromosomen; besitzen ARS, Selektionsmarker und CEN-Region besonders geeignet für lange DNA-Abschnitte Transformation von Hefezellen wegen der umgebenden Zellwand können die Vektoren nicht direkt in Hefezellen eingebracht werden durch enzymatische Verdauung der Zellwand müssen erst Sphäroblasten (Protoplasten) gewonnen werden nach Behandlung mit CaCl 2 -Lösung können diese DNA aufnehmen durch Kultivierung in einem speziellen Nährmedium wird anschließend die Zellwand wieder regeneriert 48

49 Saccharomyces cerevisiae als Expressionssystem Leicht und preiswert fermentierbar gibt die Proteine ins Kulturmedium ab Reinigung weniger aufwändig Glykosilierungen werden durchgeführt, aber mit anderen Zuckern als bei menschlichen Zellen Beispiele Mini-Pro-Insulin (Novo Nordisk) Hepatitis B-Oberflächenantigen Lepirudin der Fa. Hoechst (Refludon R ) Transfektion von Pflanzenzellen Mikroinjektion direkt in den Zellkern von Protoplasten Direkte DNA-Aufnahme aus dem Kulturmedium (nur in Ausnahmefällen erfolgreich, 1: ) Elektroporation in Protoplasten durch kurze Spannungsstöße (~ V/m² für ~ 10 m sec) bricht die Membran lokal kurzfristig zusammen, so dass Poren entstehen, durch die die DNA einströmen kann 2-3 Wochen Gewebekultur mit hochkonzentrierter Plasmid-DNA anschließend spezielle Selektionsverfahren nötig Biolistik Beschuß mit Wolframkügelchen, die mit DNA beladen wurden Infektion mit Bodenbakterien (Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes) DNA-Transfer mittels Ti-Plasmid bzw. Ri-Plasmid ( hairy roots ) (Konstruktion in E. coli) 49

50 50

51 Arzneistoffproduktion durch transgene Pflanzen Problem: Geringe gesellschaftliche Akzeptanz transformierter Pflanzen Medikamente aus transformierten Pflanzen sind im Versuchsstadium ( Pharming ) Zukunftsprojekt: Impfen durch Essen ( Plantibodies ) geringe Herstellungskosten Kühlkette entfällt Produktion vor Ort Problem: Kontrolle der Dosis Anwendung der Gentechnik vor allem bei Nutzpflanzen Molecular Pharming Produktion von therapeutischen Proteinen in transgenen Pflanzen TRENDS in Plant Science 10, 580 (2005) EMBO reports 6(7), 583 (2005) 51

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