PATENTSCHRIFT 09) DD ( ) A1

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1 DEUTSCHE DEMOKRATISCHE REPUBLIK (12) Wirtschaftspatent Erteilt gemäß 17 Absatz 1 Patentgesetz PATENTSCHRIFT 09) DD ( ) A1 4(51) C 12 P 21/02 C 07 K 7/40 AMT FÜR ERFINDUNGS- UND PATENTWESEN In der vom Anmelder eingereichten Fassung veröffentlicht (21) WP C 12 P / (22) (44) (71) Akademie der Wissenschaften der DDR, 1080 Berlin, Otto-Nuschke-Straße 22-23, DD (72) Bienert, Michael, Dr. rer. nat., DD; Hänsicke, Andre, Dipl.-Chem., DD; Beyermann, Michael, Dr. rer. nat., DD; Kaufmann, Klaus-Dieter, Dr. sc. nat., DD; Oehlke, Johannes, Dr. rer. nat., DD; Klauschenz, Erhard, Dr. rer. nat., DD; Bespalowa, Schana, Dr. rer. nat., SU; Titov, Michail, Dr. rer.nat., SU; Pleiß, Ulrich, Dr. rer. nat., DD (54) Verfahren zur Herstellung von Tritium-markierten Insulinen (57) Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von positionsspezifisch Tritium-markierten Insulinen mit der Sequenz des Human-, Rinder- oder Schweineinsulins. Anwendungsgebiete liegen in der Humanmedizin sowie in der Pharmazeutischen Industrie. Die Aufgabe der Erfindung, positionsspezifisch Tritium-markierte Insuline ohne gleichzeitige chemische Modifizierungen des Insulins zu gewinnen, wird dadurch gelöst, daß ein gut zugängliches Des-oktapeptid (B23-30)-Schweine- oder Rinderinsulin mit einem am Tyrosin (B26) Tritium-markierten Oktapeptid der Human- oder Schweineinsulin-B-Kettensequenz B23-30 auf enzymatischem Wege verknüpft wird. Das Tritium-markierte Insulinoktapeptid (B23-30) wird durch katalytischen Halogen-Tritium-Austausch aus einem 3.5-Diiodtyrosin enthaltenden Precursor gewonnen, der entweder mit 3.5-Diiodtyrosin synthetisiert oder durch lodierung eines iodfreien synthetischen Oktapeptides hergestellt wird. Nach dem Verfahren kann / 3 H 2 -Tyr(B26)/-lnsulin in guter Ausbeute und Reinheit mit einer für biopharmazeutische und pharmakokinetische Zwecke geeigneten spezifischen Radioaktivität gewonnen werden. ISSN <? Seiten

2 Erfindungsanspruch: 1. Verfahren zur Herstellung von 3 H-markierten Insulinen nach der Trypsin-katalysierten Kupplungsmethode Di-Bocdesoktapeptid(B23-30Hnsulin/ N -Boc-oktapeptid(B 23-30) der Insulinsequenz und abschließender Abspaltung der Boc- Gruppen mit Trifluoressigsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man das Di-Boc-desoktapeptid-Schweine- oder Rinderinsulin mit Tritium-markierten C-terminalen Oktapeptiden B23-30 der Human-oder Schweineinsulinsequenz, deren Markierungsstellen am Tyrosin liegen, der allgemeinen Formel I, H-GlyPhePheTyr( 3 H 2 )ThrProLys(Boc)-X-OH I in derx = Throder Ala und Boc = tert.-butyloxycarbonyl bedeuten, zu markiertem Human-, Schweine- oder Rinderinsulin umsetzt. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Oktapeptide der allgemeinen Formel I Verwendung finden, die aus Precursoren der allgemeinen Formel II, H-GiyPhePheDitThrProLys(Boc)-X-OH, II worin X und Boc die in Formel I angegebene Bedeutung haben und Ditfür 3.5-Diiodtyrosin steht, durch Halogenaustausch mit Tritiumgas hergestellt werden. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Precursoren der allgemeinen Formel II Verwendung finden, die entweder durch Fragmentkondensation zweier Tetrapeptide der Formeln III und IV, Bpoc-GlyPhePheDit-OH III H-ThrProLys(Boc)-X-OCH 3 IV in denen Bpoc für Biphenylisopropyloxycarbonyl steht, aus denen die geschützten Oktapeptide der allgemeinen Formel V Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)-X-OCH 3 V entstehen, die man nachfolgend einer alkalischen Verseifung der Methylestergruppe und einer sauren Deblockierung der Bpoc-Gruppe unterwirft oder durch lodierung von Oktapeptiden der allgemeinen Formel XI, H-GlyPhePheTyrThrProLys(Boc)-X-OH XI worin X und Boc die in Formel I angegebene Bedeutung haben, mit lodchlorid, vorzugsweise in Methanol im ph-bereich 1 bis 3, gewonnen werden. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tetrapeptid der Formel III Verwendung findet, das man aus dem Dipeptid der Formel VI, Bpoc-GlyPhe-OH VI das aus Biphenylisopropyloxycarbonyl-glycin und Phenylalaminmethylester mit nachfolgender alkalischer Verseifung des -Esters erhalten wird und einem Dipeptid der Formel VII, H-PheDit-OH VII das austert.-butyloxycarbonylphenylalanin und 3,5-Diiodtyrosin mit nachfolgender saurer N a -Deblockierung erhalten wird, herstellt. 5. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß Tetrapeptide der Formeln IV Verwendung finden, die man aus dem Dipeptid der Formel VIII, Z-ProLys(Boc)-OH VIII das C-terminal mitthreonin- oder Alaninmethylester zu den Tripeptiden der allgemeinen Formel IX, Z-ProLys(Boc)-X-OCH 3 IX verlängert wird, die durch katalytische Hydrierung N-terminal deblockiert und mit Benzyloxycarbonyl-threonin zu Tetrapeptiden der allgemeinen Formel X, Z-ThrProLys(Boc)-X-OH verknüpft und dann katalytisch hydriert werden, herstellt. Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von am Tyr(B26) mit Tritium markierten Insulinen des Menschen (Humaninsulin, Formel I), des Schweines oder Rindes.

3 H I Gly lle, 1 ValGluGInCysCysThrSerlleCysSerLeuTyrGInLeuGluAsnTyrCysAsn-OH H I Phe Val AsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly HO-ThrLysProThrTyr( 3 H 2 )PhePheGlyArgGIu Formel I Das Verfahren gestattet die Tritiummarkierung von Humaninsulin, aber auch von Insulinen anderer Spezies, mit einer für biopharmazeutische und pharmakokinetische Zwecke geeigneten spezifischen Radioaktivität Insuline mit der Struktur des Schweine-, Rinder- oder Humaninsulins werden in großem Ausmaß zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt. Tritiummarkierte Insuline sind wichtige Werkzeuge beim Studium der biopharmazeutischen und pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Arzneimittel. Anwendungsgebiete liegen in der Humanmedizin und in der Pharmazeutischen Industrie. Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Es sind verschiedene Verfahren beschrieben worden, tritiummarkierte Insuline des Rindes oder Schweines darzustellen, bisher jedoch wurde keine dieser Methoden zur Gewinnung von tritiummarkiertem Humaninsulin angewendet. Von FROMAGEOT, HUNG und MORGAT (DE-OS )" wurde die Methode der katalytischen Dehalotritiierung aromatisch gebundener lodatome durch Tritiumgas benutzt. Da aber sowohl der lodierungsschritt des Insulins als auch die katalytische Enthalogenierung zu starker Nebenproduktbildung Anlaß geben (Oxydation, Disulfidspaltung, unvollständige Enthalogenierung aufgrund von Katalysatorvergiftung) wurden beide Schritte an Komplexen aus Insulin und Insulinantikörpern ausgeführt. Das Verfahren lieferte eine hohe spezifische Radioaktivität (80-85Ci/mmol), war aber sehr aufwendig und ließ sich nicht gut reproduzieren. Eine wesentliche Verbesserung stellte die Methode von HALBAN und OFFORD (Biochem. J. 151,219 [1975]) dar, denen auf chemischem Wege die Abspaltung des Phe(B1) und die nachfolgende Einführung von 3 H-Phe als tert.- Butyloxycarbonyl-/ 3 H/-Phe-N-hydroxysuccinimidester in ein /N a -Boc-Gly(A1), N E -Boc-Lys(B29)/-des-Phe(B1)-lnsulin (GEIGER, SCHÖNE u. PFAFF, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 253,1487 [1971]) gelang. Die Autoren erreichten so eine spezifische Markierung in der B1-Position (2-20Ci/mmol je nach spezifischer Radioaktivität des verwendeten / 3 H/-Phe) des Schweineinsulins. Nachteilig sind bei dieser Variante der hohe Syntheseaufwand zur Herstellung des Des-Phe(BI)- Insulinderivates sowie die Notwendigkeit der Ausarbeitung einer Mikromethode zur Synthese von Boc-/ 3 H/-Phe-ONSu. Die Biosynthese in Ratteninselzellen unter Verwendung von / 3 H/-Phe und / 3 H/-lle wurde zur Herstellung von / 3 H/-Ratteninsulin mit Markierungen in den Positionen lle(a-2,10) (18Ci/mmol) oder Phe (B1,24,25) (37 Ci/mmol) herangezogen (MISBIN, ALMIRA, BUYNITZKI, MEHLu. RABINOVITCH, Biochem. Biophys. Res. Common. 99,1058 [1981]). Diese an sich sehr elegante Methode zur selektiven Markierung der A- und/oder B-Kette des Insulins ist auf Grund des hohen erforderlichen 3 H-Aminosäureüberschusses (es werden maximal 0,001 %der angebotenen Aminosäure in das Insulin eingebaut) extrem kostspielig und erfordert außerdem das Arbeiten mit Zellkulturen unter den Bedingungen sehr hoher Radioaktivität (ca. 5Ci 3 H-Aminosäure/1 000 Inselzellen). Verschiedene Methoden des direkten Austausches am Insulin mit Tritiumgas (HOLT, VOELKER u. HOLT, Biochem. Biophys. Acta 38,88 [1960]; HEMBREE, EHRENKAUFER, LIEBERMANN u. WOLF, J. Biol. Chem. 248,5532 [1973]) oder des sauer katalysierten Austausches in 3 H-Wasser (MATSUMOTO, SHIMADA, IKEDA, HAYAKAWA u. NAGASE, Chem. Pharm. Bull. 25,2195 [1977]) sind untersucht worden, wobei jedoch nur niedrig markierte Präparate erhalten wurden, die komplizierten Reinigungsoperationen unterzogen werden mußten. Eine Tritiummarkierung von Rinderinsulin konnte durch Umsetzung mit 3 H-lmidoestern erreicht werden (REPKE u.zull, J. Biol. Chem. 247, 2189 [1972]). Bei dieser Methodik unterliegt das Insulin natürlich einer starken Veränderung seiner physikochemischen Eigenschaften. Es ist bekannt, daß man enzymatische Spaltfragmente des Insulins im C-terminalen Sequenzbereich der B-Kette durch enzymatische Semisynthesen mit Peptid- oder Aminosäurederivaten in strukturell veränderte Insuline überführen kann. So lassen sich, ausgehend von durch Trypsinspaltung des Schweineinsulins gewonnenen Des-oktapeptid(B23-30)-lnsulin mit jeweils passend geschützten, synthetisierten Oktapeptiden der Humaninsulinsequenz B23-30 Humaninsulin (INOUYE, WATANABE, MIRIHARA, TOCHINA, KANAYA, EMURA u. SAKAKIBARA, J. Amer. Chem. Soc. 101,751 [1979]) oder mit sequenzvariierten Oktapeptiden Analoge des Human- oder Schweineinsulins (GATTNER, DANHO, BEHN u. ZAHN, Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem. 361,1135 (1980); INOUYE, WATANABE, TOCHINA, KANAYA, KOBAYASHI u. SHIGETA, Experientia 37,811 [1981]) gewinnen, wenn unter Verwendung von Überschüssen der Oktapeptidderivate mit Trypsin in mindestens 50% organische-lösungsmittel enthaltenden Puffern vom ph 5 bis 7 gekuppelt wird.

4 Ähnlich kann man Humaninsulin aus Schweineinsulin gewinnen, wenn das durch Carboxypeptidase-A-Spaltung darstellbare Des-Ala(B30)-Schweineinsulin mit einem ThreoninesterundTrypsin (MORIHARA, OKA, TSUZU Kl, EP und Nature 280, 412 [1979]) oder Schweineinsulin direkt mit einem Threoninester und Trypsin, jeweils analog den vorstehend genannten Bedingungen, transpeptidiert wird (MARKUSSEN, DE ; BEYERMANN, KRAUSE u. BEYERMANN, DD-WP C 07 C/ ; OBERMEIER, LUDWIG u. SEIPKE, DE ; JONCZYK u. GATTNER, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362,1591 [1981]). Mit Tritium markierte Insuline sind auf diesen Wegen bisher nicht dargestellt worden. Die für die erste Variante erforderlichen 3 H-markierten Oktapeptide der Schweine- oder Humaninsulinsequenz B23 30 sind ebenfalls nicht bekannt. Gut bekannt sind demgegenüber verschiedene Synthesen C-terminaler B-Kettenoktapeptide B23-30 der Humaninsulinsequenz mit einem N E -Boc-Schutz am Lysin(B 29), wie sie für die Semisynthesen über Des-oktapeptid(B 23-30)-lnsulin erforderlich sind (OBERMEIER u. GEIGER, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357,767 [1976]; SHVACHKIN, RJABZEW, SUJANOVA u. FUNTOYA, J. allg. Chem. [russ.] 48,1413 [1978]; KEGLEVIC, GOLES, PONGRACIC u. VALENTENKOVIC, Croatica Chem. Acta 49,491 [1977]; INOUYE, WATANABE, MORIHARA, TOCHINA, KAMAYA, EMURA u. SAKAKIBARA, J. Amer. Chem. Soc. 101,751 [1979]; TITOV, LEONTJEVA u. BESPALOVA, J. allg. Chem. [russ.] 41,224 [1971] und Ber. Akad. Wiss. UdSSR 209,227 [1973]). Peptidsynthesen mit 3,5-Diiodtyrosin sind an verschiedenen nicht die Insulin-B-Kettensequenz betreffenden Peptiden beschrieben worden (PAWELCZAK, RZESZTOTARSKA, NADOLSKA u. TARNAWSKI, Liebigs Ann. Chem. 1976,1521 und 1979, 761; LEMAIRE, YAMASHIRO, BEHRENS u. LI, J. Amer. Chem. Soc. 99,1577 [1977]; EBERLE, HÜBSCHER u. SCHWYZER, Helv. Chim. Acta 60,2895 [1977]; WIENECKE, Dissertation, Aachen, 1981). Daraus folgt als Besonderheit bei der Verwendung von 3,5-Diiodtyrosin gegenüber den in der Peptidsynthese üblichen Methoden, daß Schutzgruppenabspaltungen durch katalytische Hydrierungen und stark saure Behandlungen der Peptide wegen des lod/wasserstoff-austausches nicht möglich sind und Hydrazinolysen von C-terminal 3,5-Diiodtyrosin-haltigen Peptidestern sehr schwierig verlaufen. Es ist weiterhin bekannt, daß man tyrosinhaltige Peptide durch Umsetzung mit lodchlorid in neutralen bis schwach alkalischen Medien in entsprechende 3,5-Diiodtyrosin-peptide überführen kann (McFARLANE, Nature 182, 53 [1958]). Die vorliegende Erfindungsbeschreibung grenzt sich bei der Synthese eines 3,5-Diiodtyrosin in der Position B26 enthaltenden Precursor-oktapeptides der Humaninsulinsequenz für die 3 H-Markierung von den bekannten Verfahren der Synthese iodfreier Oktapeptide durch Verwendung einer andersartigen, vorteilhafteren Fragmentkondensationsstrategie und den die Synthese stark vereinfachenden Verzicht auf jeden Hydroxylschutz an den Aminosäuren 3,5-Diiodtyrosin und Threonin ab. Ziel der Erfindung Ziel der Erfindung ist die Gewinnung von positionsspezifisch tritiummarkiertem Human-, Schweine- oder Rinderinsulin mit einer für biopharmazeutische und pharmakokinetische Zwecke geeigneten, spezifischen Radioaktivität auf einem möglichst wenige Reaktionsschritte mit 3 H-markiertem Material umfassenden, im Mikromol-Maßstab einfach ausführbaren Weg. Darlegung des Wesens der Erfindung O Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von positionsspezifisch tritiummarkiertem Human-, Schweine- oder Rinderinsulin zu entwickeln. Die zur Lösung einer derartigen Aufgabe bisher bekannten Methoden gestatten, wenn man die Insuline iodiert und nachfolgend lod katalytisch gegen Tritium austauscht, keine hinreichend nebenreaktionsfreie und positionsspezifische Tritiierung; wenn man die Insuline direkt katalytisch mit Tritiumgas oder mit saurem 3 -H-Wassertritiiert zu den vorstehend genannten Nachteilen auch keine genügend hohen spezifischen Radioaktivitäten, und wenn man über eine Semisynthese an den Insulinen die Aminosäure Phe(B1) gegen / 3 H/-Phe austauscht die Tritiierung nur mit relativ hohem Aufwand sowohl zur Aufbereitung des Insulinfragments als auch zur Mikropräparation des kupplungsfähigen, radioaktiven / 3 H/-Phe-Derivates. Alle diese Verfahren konnten wegen der bisher schwierigen kommerziellen Verfügbarkeit von Humaninsulin auch nicht zur Herstellung von tritiummarkiertem Humaninsulin herangezogen werden. Unter Vermeidung dieser Nachteile liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, durch eine Semisynthese im C-terminalen Bereich der B-Kette des Insulins mit einem synthetisch zu gewinnenden, erst unmittelbar vor dem Einsatz radioaktiv zu markierenden Fragment mit geringem Aufwand und in hohen Ausbeuten bei hinreichender spezifischer Markierung durch den wahlweisen Ausgang vom gut verfügbaren Schweine- oder Rinderinsulin sowohl 3 H-markiertes Human- als auch Schweine- oder Rinderinsulin zu gewinnen. Erfindungsgemäß wird das nach bekannten Verfahren einfach darstellbare N a,n a '-Di-Boc-desoktapeptid(B23-30)-Schweineoder Rinderinsulin enzymatisch-semisynthetisch unter der Einwirkung von Trypsin bei einem E/S-Verhältnis von 1:10 in einem 50% Dimethylformamid enthaltenden Trispuffer vom ph6,5 mit einem am Tyrosin(B26) tritiummarkierten, N E -Boc-geschützten Oktapeptid der Human- oder Schweineinsulinsequenz B23-30, das im 5fach molaren Überschuß eingesetzt wird, verknüpft. Anschließend wird gebildetes markiertes Tri-Boc-Insulin mit der Human-, Schweine- oder Rinderinsulinsequenz mit durch Essigsäure angesäuertem Wasser gefällt, gewaschen, getrocknet und durch Behandlung mit Trifluoressigsäure deblockiert. Durch präparative Hochdruckflüssigkeitschromatografie läßt sich gereinigtes / 3 H-Tyr(B26)/-Human-, Schweine- oder Rinderinsulin in einer auf eingesetztes Di-Boc-desoktapeptid(B23-30)-lnsulin bezogenen Ausbeute bis zu 30% mit einer durch den Markierungsgrad des N e -Boc-oktapeptides (23-30) bestimmten spezifischen Radioaktivität gewinnen. Dieser Verfahrensweg hat den großen Vorteil, daß durch die Tritiierung keine Schädigung des Insulinmoleküls, besonders seiner Disuifidstruktur, eintritt, da nicht, wie bei den meisten bekannten Verfahren, das gesamte Insulinmolekül unter der Mitwirkung eines Katalysators mit Tritiumgas behandelt wird, sondern ein derartiger Tritiierungsschritt am chemisch viel widerstandsfähigeren Oktapeptid(B 23-30) vorgenommen wird. In diesem Sinne erweist es sich als ein überraschender Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß sich Reaktionsprodukte und Ausgangskomponenten in einem Reinigungsschritt gut trennen lassen und so sehr reine 3 H-lnsuline erhalten werden können. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens ist die bequeme Zugänglichkeit von tritiummarkiertem Humaninsulin, das wegen seiner schwierigen Darstellbarkeit nach anderen Verfahren bisher nicht bekannt war.

5 Erfindungsgemäß wird das für die enzymatisch-semisynthetische Kupplung benötigte N -Boc-/ 3 H-Tyr(B26)/-oktapeptid (B 23-30) der Human- oder Schweineinsulinsequenz durch katalytische Dehalotritiierung mit Tritiumgas aus den N E -Boc-/ Dit(B26)/-oktapeptiden (B 23-30) erzeugt. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß die Precursoroktapeptide in einem experimentellen Schritt, nämlich nur durch die Reaktion mit dem Tritiumgas, in eine für die semisynthetische Kupplung geeignete tritiummarkierte Form überführt werden können, während bei bekannten Verfahren zur Herstellung von 3 H-lnsulinen die Ausarbeitung von Mikromethoden für mehrstufige radioaktive Synthesen von Aminosäurederivaten erforderlich war. Ein weiterer Vorteil ist auch, daß der Einbau eines B23-30-Oktapeptides durch Einführung weiterer Precursoraminosäuren, wie p-chlorphenylalanin, p-lodphenylalanin oder 3,4-Dehydroprolin, auch die Synthese von Insulinen mit sehr hohen spezifischen Radioaktivitäten (>100Ci/mmol) zuläßt. Die bisher nicht bekannten N E -Boc-/Dit(B26)/-lnsulinoktapeptide (B23-30) werden erfindungsgemäß entweder unter Verwendung von 3,5-Diiodtyrosin synthetisiert oder durch lodierung der bekannten Oktapeptide mit lodchlorid gewonnen. Die erstgenannte Verfahrensweise hat den Vorteil, daß bei etwa vergleichbarem Syntheseaufwand für die /Tyr(B26)/- und die /Dit(B 26)/-Oktapeptide die häufig nicht selektiv genug verlaufende nachträgliche lodierung mit dem sich daraus ergebenden Reinigungsaufwand entfällt. Die N E -Boc-/Dit(B26)/-oktapeptide(B23-30) lassen sich besonders einfach synthetisieren, wenn im Gegensatz zu bekannten Verfahren zur Herstellung der nicht iodhaltigen Oktapeptide anstelle des stufenweisen Aufbaus vom C-Terminus oder von Fragmentkondensationeneine4 + 4-Fragmentsynthese durchgeführt wird. Der stufenweise Aufbau vom C-Terminus hat, wenn er C-terminal carboxylfrei durchgeführt wird, die bekannten Nachteile der mit wachsender Kettenlänge kompliziert werdenden Reinigungsschritte und wenn er mit Carboxylschutz durchgeführt wird, den Nachteil, daß bei der vorliegenden Sequenz die terminalen Peptide meist als Öle anfallen und schlecht kristallisieren. Außerdem kann vom Einbau des 3,5- Diiodtyrösins an zur Gewährleistung der Abspaltungsselektivität gegenüber dem N E -Boc-Rest am Lys(B29) nicht mehr mit N a -Z-geschützten Aminosäureaktivestern gearbeitet werden, was den Einsatz weit syntheseaufwendigerer Schutzgruppen erfordern würde. Fragmentkondensationen vom Typ haben gegenüber einer Strategie den Nachteil, daß durch die zusätzliche Fragmentkupplung die Racemisierungsgefahr steigt und an der konkreten Sequenz ein Dipeptid H-DitThr-OH hergestellt und eingebaut werden müßte, das wahrscheinlich nur mitoh-schutzgruppen gehandhabt werden könnte. Solche sind aber vom Benzyltyp nicht einsetzbar, da diiodtyrosin-enthaltende Peptide nicht katalytisch hydriert werden können und vom tert.-butylethertyp nicht verwendbar, da sie nicht selektiv gegen die N E -Boc-Gruppe am Lysin abgespalten werden können. Andererseits verbietet sich eine Verwendung der Oktapeptide mittert.-butylether-seitenkettenschutzgruppen in den Semisynthesen, da sie die Löslichkeit der Oktapeptide im Synthesepuffer drastisch verschlechtern. So stellt die erfindungsgemäße Synthese dieser Oktapeptide aus den Tetrapeptiden Bpoc-Gly-PhePheDit-OH und H-ThrProLys (Boc)-X-OMe(X = Throder Ala) nach üblichen Fragmentkondensationsmethoden, vorzugsweise mit DCC unter Zusatz einer die Racemisierung senkenden N-Hydroxyverbindung, eine besonders effektive Methode dar, die gute Ausbeuten liefert. Aus den Oktapeptiden Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)-X-OMe lassen sich die terminalen Schutzgruppen nach bekannten Verfahren leicht entfernen. Das in der Fragmentkondensation eingesetzte N-terminaleTetrapeptid Bpoc-GlyPhePheDit-OH wird am günstigsten ohne C-terminalen Carboxylschutz synthetisiert, da überraschend ein entsprechender Tetrapeptidmethylester nicht verseift werden kann. Dagegen verliefen zwei Salzkupplungen am 3,5-Diiodtyrosin, zunächst mit Boc-Phe-ONB (HONB = N-Hydroxy-5- norbornen-2,3-dicarbonsäureimid) und nach der Deblockierung des DipeptidsmitBpoc-GlyPhe-ONB in unerwarteter Weise sehr glatt mit Ausbeuten zwischen 70 und 90%. Die C-terminalen Tetrapeptide Z-ThrProLys(Boc)-X-OMe werden mit Vorteil aus Z-ProLys(Boc)-OH synthetisiert, das durch Verknüpfen eines Aktivesters von Z-Pro-OH, vorzugsweise des mit HONB gebildeten Aktivesters, mit N s -Boc-Lysin in ausgezeichneter Ausbeute und Reinheit zugänglich ist. Zunächst verlängert man dieses Dipeptid C-terminal je nach gewünschter Insulinsequenz mitthreonin- oder Alaninmethylester und dann nach Abspaltung der N -Z-Gruppe N-terminal mit Z-Thr-OH jeweils nach üblichen Verfahren. Auch in diesen Schritten werden in guten Ausbeuten sehr reine Peptide erhalten, die sich für die Fragmentkupplungen sehr leicht N-terminal durch Hydrierung deblockieren lassen. Diese Precursorsynthesen haben neben der glatten Ausführbarkeit und den insgesamt sehr guten Ausbeuten den Vorteil, daß wederam Threonin'noch am 3,5-Diiodtyrosin mit Schutzgruppen der Seitenkettenhydroxylfunktionen gearbeitet werden muß, was den Syntheseaufwand erheblich verringert. Die lodierung der bekannten Oktapeptide H-GlyPhePheTyrThrProLys(Boc)-X-OH (X = Thr, Ala) mit lodchlorid kann ebenfalls zur Herstellung der Precursoroktapeptide herangezogen werden, obwohl diese Verfahrensweise, wie bereits dargelegt, einen zusätzlichen Aufwand darstellt. Für die Sequenz an sich nicht erwartet, liefert die lodierung im üblichen ph-bereich von 6 bis 8 allerdings sehr komplex zusammengesetzte Produktgemische. Darin bestätigt sich die allgemeine Einschätzung, daß bei der nachträglichen lodierung von Tyrosinpeptiden im Vergleich zu Synthesen der Peptide mit 3,5-Diiodtyrosin sehr häufig große Schwierigkeiten auftreten. Überraschend wurde aber gefunden, daß bei einer lodierung der vorliegenden Oktapeptide in dem an sich nicht gebräuchlichen ph-bereich von 1 bis 3 eine weitgehend selektive Tyrosin-Iodierung erfolgt und daß eine Chromatografiean LiChropräp RP18 eine effektive Reinigungsmethode für die gewünschten jodierten Oktapeptide darstellt, die auf diese Weise in guten Ausbeuten gewonnen werden können. Die Synthese positionsspezifisch tritiummarkierter Insuline mit der Human-, Schweine- oder Rinderinsulinsequenz erfolgte nach einer enzymatischen Semisynthese über die gut zugänglichen Des-oktapeptid<B23-30)-Fragmente des Schweine- oder Rinderinsulins und 3 H-markierten Oktapeptiden B23-30 der jeweils gewünschten Insulinsequenz. Die Methode ist einfach auszuführen und die 3 H-markierten Insuline leicht und in guten Ausbeuten zu isolieren. Mit dem Verfahren konnte 3 H-markiertes Humaninsulin erstmals dargestellt werden. Die tritiummarkierten Oktapeptide werden durch katalytische Dehalotritiierung aus Dit(B26)-Oktapeptid-precursoren hergestellt, für die eine effektive, gut reproduzierbare Synthese unter direktem Einbau von 3,5-Diiodtyrosin ausgearbeitet wurde. Die Synthese ist durch eine einfache Strategie, ein Minimum an zu verwendenden Schutzgruppen und durch eine disponible Handhabung von Knüpfungsmethoden gekennzeichnet. Die gleichen Precursor-oktapeptide lassen sich, allerdings mit größerem Aufwand, auch durch lodierung bekannter iodfreier Oktapeptide gewinnen, wenn die lodierung und Aufarbeitung gegenüber Analogbeispielen unter neuartig veränderten Bedingungen durchgeführt wird.

6 Ausführungsbeispiele Verwendete Abkürzungen: DOI = Des-Oktapeptid(B23-3C))-Schweineinsulin Dit = 3,5-Diiodtyrosin DCC = Dicyclohexylcarbodiimid DCHA = Dicyclohexylamin NMM = N-Methylmorpholin HONB = N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid TFA = Trifluoressigsäure Boc = tert-butyloxycarbonyl Bpoc = Biphenylisopropyloxycarbonyl Z = Benzyloxycarbonyl I.Beispiel Synthese von a H-Humaninsuiin 1.1. Darstellung von Di-Boc-desoktapeptid(B23-30)-Schweineinsulin 2,85g Schweineinsulin-hydrochlorid wurden in 450 ml Wasser gelöst und der ph-wert mit N NaOH auf 8,4 eingestellt. Dazu wurden 120ml einer Lösung von 0,190g Trypsin in 140ml 0,001 N HCl/0,005 M CaCI 2 ; deren ph auf 8,4 gestellt wurde, gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 C über 2,5 Stunden, wobei der ph mit 0,0025 N NaOH konstant gehalten wurde. Die Reaktion wurde durch isoelektrische Fällung bei ph 5,0 abgebrochen und das ausgefallene Gemisch aus DOI und Schweineinsulin mit Wasser und Acet'on gewaschen und getrocknet. Die dabei isolierten 1,85g Peptidgemisch wurden durch Gelchromatografie an Sephadex-G50 in 0,05 M NH4HCO3 unter EDTA : Zusatz getrennt. Die DOI-Fraktion wurde zur Abtrennung von Desamido-DOl anschließend einer lonenaustauschchromatografie an DEAE-Sephadex-A25 bei ph8,2 in einem lsopropanol/01 M Tris-HCI- Puffer mit einem linearen NaCI-Gradienten (0-0,3 M) unterworfen und die dabei erhaltene DOI-Fraktion an Sephadex-G25 in 0,5 M Essigsäure entsalzen und lyophilisiert. Ausbeute: 0,95g (37%) DOI 0,20g (0,04mmol) des gereinigten DOI, 0,101g (1 mmol)triethylamin und 1 ml (5,25mmol) Boc-azid wurden in 15ml DMSO 2,5 Stunden bei 37 C gerührt. Danach wurde mit Aceton gefällt, mit Ether gewaschen und das Di-Boc-DOl aus M Ammoniak lyophilisiert. Ausbeute: 0,190g (90%) Di-Boc-DOl Aminosäureanalyse: Glu 7,0 (7); Gly 2,91 (3); Ala 1,0 (1); Val 3,44 (4); lle 1,18 (2); Tyr 2,61 (3); Phe 1,07 (1); Ser 2,94 (3); Thr 0,97 (1); Asp 2,83 (3); His 1,8 (2) Darstellung des Precursor-oktapeptides H-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH durch Totalsynthese Darstellung von Bpoc-GlyPhe-OMe 3,1 g (10mmol) Bpoc-Gly-OH wurden in 50ml THF gelöst und bei -20 C nacheinander mit 1,12ml (10mmol) NMM und 1,13ml (lommol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt. Nach 3 Min. erfolgte die Zugabe von 2,12g (10mmol) H-Phe-OMe HCl und 1,12ml (10mmol) NMM in 10ml gekühltem DMF. Der Ansatz wurde 1 Stunde bei -10 C und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde das THF i.v. abgezogen, der Rückstand in Essigester aufgenommen und diese Lösung mit 0,1 M KHS0 4, 10%ig NaHC0 3 und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na 2 S0 4 getrocknet. Nach Verdampfen des Essigesters wurde ein Öl erhalten. Ausbeute: 3,6g (76%) Darstellung von Bpoc-GlyPhe-OH 2,37 g (5 mmol) Bpoc-GlyPhe-OMe wurden in 100 ml Dioxan/Wasser (2:1) gelöst und mit N NaOH bei ph 10 verseift. Danach wurde das Dioxan i.v. abgezogen, die wäßrige Phase mit 0,1 M KHS0 4 -Lösung auf ph 2 gestellt und mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wurde mit gesättigter NaCI-Lösung neutral gewaschen und über Na 2 S0 4 getrocknet. Danach wurde das Lösungsmittel i.v. abgezogen, der Rückstand mit Petrolether verrieben, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute: 1,5g (65%); F. 70 C-75 C C3 9 H 51 N (DCHA-Salz)(641,8) Ber. C 72,98 H8,01 N 6,55 Gef. 71,51 8,06 6, Darstellung von Boc-PheDit-OH 0,880g (2mmoi) Boc-Phe-ONB wurden in 10m! THF gelöst und mit 1,3g (3mmol) 3,5-Diiodtyrosin in 20ml DMF, das mit 0,34ml (3 mmol) NMM versetzt wurde, vereinigt und gerührt. Nach 24 Stunden wurden weitere 0,11 ml (1 mmol) NMM und nach 48 Stunden 0,5ml N,N-Dimethylaminopropylamin zugesetzt. Nach weiteren 30 Min. wurde das THF i.v. entfernt und die zurückbleibende DM F-Lösung mit Essigester verdünnt. Anschließend wurde mit 0,1 M KHS0 4 -Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Na 2 S0 4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das Dipeptid kristallisierte nach Verreiben mit Petrolether. Ausbeute: 1,12g (82%); F. 103 C-106 C; [a] -3,3 (CH 3 OH) C 23 H 26 l 2 N (680,3) Ber. C 40,60 H3,85 N4,12 Gef. 39,67 3,97 3, Darstellung von H-PheDit-OH TFA 0,680 g (1 mmol) Boc-PheDit-OH wurden in 5 ml TFA/Methylenchlorid (1:1) gelöst, 1 Stunde bei 0 C gerührt, mit Ether gefällt und mit Ether gewaschen. Ausbeute: 0,652g (94%); F. 118 C-122 C

7 Darstellung von Bpoc-GlyPhePheDit-OH 0,461 g (1 mmol) Bpoc-GlyPhe-OH und 0,112ml (1 mmol) NMM wurden in 20ml THF gelöst, auf -20 C gekühlt, mit 0,13ml (1 mmol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt und 3 Min. gerührt. Dann wurden 0,179g (1 mmol) HONB zugesetzt, unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und eine Lösung von 0,694g (1 mmol) H-PheDit-OH-TFA und 0,224ml (2 mmol) NMM in 20ml DMF hinzugefügt. Der Ansatz wurde 48 Stunden gerührt, dann mit 1 ml N,N-Dimethylaminopropylamin versetzt und weitere 30 Min. gerührt. Danach wurde das THF i.v. abdestilliert, zur DMF-Lösung 100ml Essigester zugegeben, mit 0,1 M KHS0 4 und gesättigter Kochsalzslösung gewaschen und über Na 2 S0 4 getrocknet. Nach Einengen i.v. wurde über Sephadex-LH20 chromatografiert. Ausbeute: 0,685g (67%); [alsls -6,4 (THF) CisHW^Osb (1022,6) Ber. C 52,85 H4,34 N5,48 Gef. 51,03 4,42 5, Darstellung von Z-ProLys(Boc)Thr-OMe 0,954g (2mmol) Z-ProLys(Boc)-OH wurden in 20 ml THF gelöst und bei -20 C nacheinander mit 0,25ml (2,2mmol) NMM und 0,29ml (2,2mmol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt. Nach 3 Min. wurden 0,408g (2,4mmol) H-Thr-OMe HCl und 0,27ml NMM in 5 ml gekühltem DMF zugegeben und eine Stunde in der Kälte und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde i.v. eingeengt, mit Essigester verdünnt, mit 0,1 M KHS0 4,10%iger NaHC03-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Na 2 S0 4 getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels kristallisierte die Verbindung aus Petrolether. Ausbeute: 0,925g (78%); F. 117 C-119 C; [a]g -50,5 (CH 3 OH) C 2 gh 4 4N 4 Og (592,7) Ber.C 58,76 H7,48 N9,45 Gef. 58,62 7,18 8,95 Aminosäureanalyse: Pro 1,0 (1); Thr0,9 (1); Lys 1,1 (1) Darstellung von Z-ThrProLys(Boc)Thr-OMe 0,593g (1 mmol) Z-ProLys(Boc)Thr-OMe wurden in 100ml Methanol mit Pd/Aktivkohle katalytisch hydriert. Das Filtrat der Hydrierung wurde i.v. eingeengt, in 10ml THF gelöst und nach Zugabe von 0,253g (1 mmol) Z-Thr-OH auf -10 C gekühlt. Dann wurden 0,179 g (1 mmol) HONB und 0,206g (1 mmol) DCC zugesetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde der Harnstoff abfiltriert, das Filtrat i.v. eingeengt, mit Essigester verdünnt und nacheinander mit 0,1 M KHS0 4 -Lösung, 10%iger NaHC0 3 -Lösung, gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Na 2 S0 4 getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde mit Petrolether kristallisiert. Ausbeute: 0,555g (80%); F. 60 C-65 C; [a] -69,9 (CH 3 OH) CaaHgiNgOn (693,8) Ber. C57,12 H7,41 N 10,09 Gef. 56,72 7,33 9,74 Aminosäureanalyse: Pro 1,0 (1);Thr 1,8 (2); Lys 1,2(1) Darstellung von Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OMe 0,140g (0,2 mmol) Z-ThrProLys(Boc)Thr-OMe wurden in 80 ml Methanol an Pd/Aktivkohle mit Wasserstoff katalytisch hydriert und das Filtrat i.v. eingeengt. Der Rückstand von 0,112g (0,2mmol) H-ThrProLys(Boc)Thr-OMe, 0,204g (0,2mmol) BpocGIyPhePheDit-OH, 0,043 g (0,24mmol) HONB und 0,049 g (0,2 mmol) DCC wurden bei 0 C in 10 ml THF gelöst und 2 Stunden bei 0 C und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde über Sephadex-LH20 in Methanol gelfiltriert. Ausbeute: 0,184g (59%); F. 121 C-125 C; [ayg-29,2 (THF) CvoHeyhNiAeO 564,3) Ber. C 53,74 H5,61 N8,06 Gef. 52,05 5,67 7, Darstellung von Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH 0,180g (0,115mmol) Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OMe wurden in einer Mischung aus THF und Wasser (2:1) gelöst und mit N NaOH bei ph 10 verseift. Dann wurde das THF i.v. entfernt, die wäßrige Lösung auf ph 2 gestellt und mit NaCI gesättigt. Der ausfallende Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 0,156g (88%); F. 145 C-150 C; [alsli -34,1 (CH 3 OH) Darstellung von H-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH 0,156g (0,1 mmol) Bpoc-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH wurden in 6ml 80%iger Essigsäure 24 Stunden gerührt und anschließend lyophilisiert. Der Rückstand wurde 3mal mit je 4ml Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 0,103g (78%); F. 184 C-187 C; [a] s f -23,0 (CH 3 COOH) 1.3. Darstellung des Precursor-oktapeptides H-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH durch lodierung des lod-freien Oktapeptides 0,020g (20pmol) H-GlyPhePheTyrThrProLys(Boc)Thr-OH wurden in 5 ml DMF/Wasser (1:1) gelöst und auf 0 C gekühlt. Unter Rühren wurden dazu 800 pl einer lodchlorid-lösung gegeben, die aus 4,4g Kl, 2,9g KI0 3 und 50ml konz. HCl und Auffüllen auf 100 ml hergestellt wurde, und der ph der Reaktionslösung mit 6N NaOH auf 2,0 gestellt. Nach 30 Min. wurde der Ansatz unter schwachem Druck über 3g Lichroprep-RP 18 (25-40 pm) gegeben und nacheinander mit 20ml Wasser, 20mlWasser/Methanol (3:2), 20 ml Methanol, 10 ml Methanol/Essigsäure (7:3) und 20 ml Methanol/Essigsäure (2:3) eluiert. Mit der letzten Fraktion wurde das Diiod-oktapeptid eluiert und i.v. zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 0,0175g (67%); F. 185 C-187 C

8 Darstellung von H-GlyPhePheTyr( 3 H 2 )ThrProLys(Boc)Thr-OH 1,8 mg (1,3 Mmol) H-GlyPhePheDitThrProLys(Boc)Thr-OH wurden in 300 il Methanol/380 (il Phosphatpuffer ph7 (0,1 M)/0,2MI Triethylamin gelöst und nach Zugabe von 23mg 10%Pd/AI Min. mit einem 3 H 2 -Druck von 670 mmhg tritiiert. Danach wurde filtriert, der Katalysator 3mal mit je 1 ml Methanol gewaschen und die gesammelten Filtrate 3mal lyophilisiert. Die Substanz hatte 50mCi in 20ml Methanol. 1 ml der methanolischen Lösung wurden zur Trockne eingedampft, in 2 ml Wasser aufgenommen und über 4g CM-Cellulose (Servacel, 0,83mequ/g) mit Wasser chromatografiert. Das Eluat war in der Papierelektrophorese (7%ige Essigsäure, 700V, aufsteigend) mit unmarkiertem H-GlyPhePheTyrThrProLys(Boc)Thr-OH identisch. Spezifische Radioaktivität: 40Ci/mmol Synthese von/ 3 H 2 -Tyr(B26)/-Humaninsulin 10mg (2(jmol) Boc 2 -DOI, 10mg (10jimol) H-GlyPhePheTyrThrProLys(Boc)Thr-OH,70pCi H- GlyPhePheTyr( 3 H 2 )ThrProLys(Boc)Thr-OH und 1 mg Trypsin wurden in 120 il DMF/Tris-HCI ph 8,2 (1:1) gelöst (ph der Reaktionslösung 6,6) und 20 Stunden bei37 C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 al Essigsäure gestoppt und 500 pl Wasser zugesetzt. Der ausfallende Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Danach wurde er in 100 nl Trifluoressigsäure gelöst und nach 1 Stunde bei 0 C mit Ether gefällt, gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde in mehreren Chargen durch HPLC gereinigt (Lichrosorb-RP 18) (10 im); Säule 250 x 4,6 mm; Laufmittel 0,01 M Phosphat/ 0,1 M NaCI0 4 (ph 2,2) und Acetonitril/Isopropanol (2:1 /v:v) im Verhältnis 60:40; Elutionsgeschwindigkeit 1 ml/min.; Druck35at). Die Retentionszeiten betrugen für Insulin 9,2Min.; DOI 5,5Min. und Oktapeptid 4,2Min. Die 3 H-h-lnsulinfraktionen wurden über Sephadex-G 10 in 0,5 M Essigsäure entsalzen. Ausbeute: 1 mg (10%); spezifische Radioaktivität: 9,7mCi/mmol.

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