Genetic Engineering. Gentechnik SS 2004

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1 Genetic Engineering Gentechnik SS 2004 MANNHEIM UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Prof. Dr. Petra Kioschis-Schneider Institute of Molecular Biology and Cell Cultering Technique

2 CV Prof. Dr. Petra Kioschis-Schneider University: Diploma Thesis: PhD: Postdoc: Job: Biology (Diploma), University Kaiserslautern Major Molecular Biology Major Genetics and Human Biology Minor Cytology Minor Cell Biology University Kaiserslautern (Prof. Dr. Zankl; Prof. Dr. Nagl) Non-radioactive in situ hybridisation (FISH, Fluorescence In Situ Hybridisation): Comparison of different detection systems and banding techniques Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) (Prof. Dr. A. Poustka) Imperial Cancer Research Fund, London (ICRF) (Prof. Dr. Hans Lehrach) Construction of an ordered clone library of the region Xq27.3 Xqter of the human X chromosome Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) Identification, cloning and characterisation of the MTM1 gene involved in Myotubular Myopathy Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) Project leader: - Identification and analysis of human diseases in Xq28 - Transcript map and expression analysis of the synteny region of Xq28 in mouse - Chemoresistance in human malignant melanom RZPD Deutsches Ressourcenzentrum fuer Genomforschung GmbH, Heidelberg/Berlin Head of Screening and Gene Expression Profiling Services FH Mannheim Professor of Molecular Biology (since 03/2000)

3 Contents Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4 Introduction Structure and function of DNA. A very brief overview. Important enzymes in genetic engineering and molecular biology. Use and application. Restrictionendonucleases DNA-Ligases DNA modifying enzymes Polymerasen Nucleasen: PCR - alkalische Phosphatase - Polynucleotidkinase - Terminale Transferase -DNA Polymerase - Klenow-Fragment - Reverse Transcriptase - Taq Polymerasen - Endonucleasen (Dnase I; S1-Nuclease; Restriktionsendonucleasen) - Exonucleasen (Bal31; ExoIII) Chapter 5 Sequencing

4 Contents Chapter 6 Chapter 7 Gel electrophoresis Cloning procedures and cloning vectors. Host systems Cutting and joining (Restriction Endonucleases and Ligation) Cloning vectors - Linkers and adapters - Homopolymer tailing - TA cloning of PCR products - Plasmid vectors - Vectors based on the Lambda Bacteriophage -Cosmids -PACs/ BACs - Yeast - M13 Vectors Genetic Engineering

5 Contents Chapter 8 Gene libraries - Genomic and cdna Libraries - Screening libraries with Gene Probes - Labelling and Hybridisation Chapter 9 Expression Systems Expression Vectors - Expression vectors for cloning and expression in prokaryotic cells - Expression vectors for cloning and expression in eukaryotic cells Genetic Engineering

6 Literature T. Dingermann: Gentechnik / Biotechnik T.A. Brown: Gene Cloning B.R. Glick, J.J. Pasternack: Molecular Biotechnology J.D. Watson: Recombinant DNA J. Sambrock, E.F. Fritsch, T. Maniatis: Molecular Cloning J.W. Dale, M. von Schantz: From Genes to Genomes D. Bourgaize, T.R. Jewell, R.G. Buiser: Biotechnology S.B. Primrose, R. Twyman, B. Old: Principles of Gene Manipulation M.M. Burell: Enzymes of Molecular Biology L.G. Davis, W.M. Kuehl, J.F. Battey: Basic Methods in Molecular Biology Genetic Engineering

7 Chapter 1: Introduction Genetic Engineering

8 Genetic Engineering

12 Was ist ein GVO? GVO (gentechnisch veränderter Organismus) Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt. Artikel 2 der europäischen Freisetzungs- Richtlinie (2001/18/EG).

13 Die Verwendung von GVO Das Ziel einer gentechnischen Veränderung eines Organismus (Mikroorganismus, Pflanze, Tier) ist eine Änderung einer (oder mehrerer) seiner Eigenschaften: verstärkte Produktion eines Enzyms, Resistenzen gegen Herbizide, Insekten oder Viren, verzögerte Reifung, geänderte Stärke- oder Fettsäurezusammensetzung. Es besteht jedoch ein wesentlicher Unterschied, ob ein Lebensmittel selbst ein GVO ist, oder ob dem Lebensmittel ein Zusatzstoff oder Hilfsstoff zugegeben wird, der mittels gentechnischer Verfahren hergestellt wurde. Genetic Engineering

16 Die Produktpipeline der klassischen Pharmaindustrie Genetic Engineering

25 Grüne Biotechnologie Ziele der modernen Pflanzenzüchtung Erhaltung und Erweiterung der genetischen Diversität Steigerung der Widerstandsfähigkeit Erhöhung der biologischen Stoffbildung Verbesserung der Produktverträglichkeit Realisierung von umweltverträglicheren Produkten Gentechnik bei Pflanzen durch die Einschleusung eines oder weniger Gene in eine Pflanze lassen sich definiert neue Eigenschaften erzielen Artgrenzen können überwunden werden Unerwünschte Eigenschaften können gezielt beseitigt werden transgene Pflanzen als Bioreaktoren Modelle für die Grundlagenforschung Beitrag zur Ökologie Genetic Engineering

26 Chancen transgener Pflanzen Grüne Biotechnologie erhöhte Resistenz und verbesserte Umweltanpassung verändertes Kohlenhydrat- oder Fettsäuremuster veränderte Aminosäurezusammensetzung Verbesserung von Lagerungsfähigkeit und Geschmack Reduktion von allergenen Proteinen Rohstoffproduktion und Bodensanierung Wirkstoffproduzierende Pflanzen männliche Sterilität Genetic Engineering

27 Risiken transgener Pflanzen Grüne Biotechnologie für das Ökosystem: o Gentransfer o verstärkte Verbreitung transgener Pflanzen o toxische Effekte für den Menschen: o Übertragung von Antibiotica-Resistenzen o toxische Genprodukte o Allergien Genetic Engineering

28 Zusammenfassende Bewertung: Wem nützt die grüne Biotechnologie? der Industrie? dem Landwirt? dem Verbraucher? der Bekämpfung des Welthungers? Genetic Engineering

29 Gentechnik in Pflanzen Genisolierung Konstruktion von Vektoren (Ti-Plasmid) Genvermehrung Das Einschleusen von DNA in Pflanzenzellen (Transformation) Selektion von der transformierten Zellen Transgene Pflanzen Genetic Engineering

31 Das Ti-Plasmid Der einzige Vektor, der routinemäßig für die Herstellung transgener Pflanzen verwendet wird, stammt aus einem Bodenbakterium namens Agrobakterium tumefaciens. Dieses Bakterium ruft die sog. Wurzelhalsgallen-Krankheit (crown gall disease) hervor. Genetic Engineering

32 Konstruktion von Vektoren (Ti-Plasmid) Mit rekombinanten DNA Methoden wird ein Fremdgen in die T-Region des Ti-Plasmids eingeführt, wodurch es seine Fähigkeit zur Tumorinduktion verliert. Ein Agrobakterium mit einem solchen rekombinanten Plasmid wird für die Übertragung des neuen Gens in die Pflanzenzelle eingesetzt. Genetic Engineering

33 Transgene Transformation Pflanzen Selektion von der transformierten Zellen Transgene Pflanze

34 Transgenic tobacco harboring a GFP Gene

35 Merkmale, die in genetisch veränderten Pflanzen eingesetzt werden Herbizidtoleranz Virusresistenz Insektenresistenz Resistenz gegen pilzliche Erkrankungen Veränderung der Blütenfarbe Verzögerte Fruchtreife Verlängerte Haltbarkeit... Genetic Engineering

36 Anbauflächen weltweit Genetic Engineering

37 GVO am Markt! China war weltweit das erste Land, das transgene Pflanzen auf den Markt brachte. Zu Beginn der 90er Jahre wurde virusresistenter Tabak, wenig später virusresistente Tomaten zur Vermarktung zugelassen wurde erstmals in den USA ein gentechnisch verändertes Lebensmittel marktfähig, nämlich die unter dem Namen Flavr Savr oder Anti-Matsch-Tomate bekannte gentechnisch veränderte Tomate. In den letzten Jahren gelangten in den USA auch transgener Mais, Sojabohnen, Kartoffeln, Raps, Kürbis und Baumwolle auf den Markt. In den OECD-Mitgliedstaaten (29 Länder) wurden bislang ca. 70 Zulassungen für gentechnisch veränderte Pflanzen (oder Produkte aus diesen) zur kommerziellen Nutzung ausgesprochen. Das waren vor allem Mais, Raps, Tomaten, Sojabohnen und Kartoffeln, in zweiter Linie Kürbis, Baumwolle, Zuckerrüben und Reis. Den Großteil dieser Produkte findet man lediglich in den USA, in Kanada und in Japan auf dem Markt.

38 Soja ist die Kulturpflanze mit der weltweit größten Anbaufläche mit gentechnisch veränderten Sorten: 1999 waren es 21,6 Mio. ha, 54% aller Flächen mit transgenen Pflanzen sind die Flächen mit Gen-Soja weltweit noch einmal auf ca. 23. Mio. ha gestiegen In USA und Argentinien sind gentechnisch veränderte Sojabohnen mit Herbizidresistenz ohne Auflagen zugelassen. Sie sind als gesundheitlich unbedenklich eingestuft. Von der Aussaat bis zum Lebensmittel werden diese Sojabohnen nicht anders behandelt als konventionelle. in der EU: Zulassung nur für Import, Verarbeitung und Lagerung, nicht zum Anbau Nach der Ernte werden Sojabohnen in Ölmühlen verarbeitet; sie liefern Rohstoffe für eine Vielzahl von Lebensmittelzutaten. Es wird geschätzt, dass Lebensmittelprodukte Zutaten aus Sojabohnen enthalten oder indirekt mit sojahaltigem Tierfutter erzeugt werden. Genetic Engineering

39 Mais liefert den Rohstoff für eine Vielzahl von Lebensmittelzutaten: Maiskeimöl, Maismehl für Backwaren, Teige Cornflakes u.v.m.stärke und modifizierte Stärke sowie unzählige Produkte der Stärkeverzuckerung, Gemüse. Dazu als Futtermittel für die Tierhaltung weit verbreitet, auch Verwertung der ganzen Pflanze als Silage (Silomais). Von der Weltmaisernte werden 30 Prozent für Lebensmittelzwecke, 70 Prozent als Futtermittel verwendet. Zulassungen in der EU, jedoch nennenswerter Anbau bisher nur in Spanien. Viele Lebensmittel enthalten Zutaten aus Mais und Maisstärke. Allerdings sind Maisimporte aus Ländern, die großflächig gentechnisch veränderten Mais anbauen, in die Eu gering.

40 Aus Raps werden direkt oder indirekt verschiedene Lebensmittel gewonnen: Rapsöl, als Speiseöl, vor allem in der Margarineproduktion. Mischungen von Ölen aus mehreren Pflanzen können als pflanzliches Öl deklariert werden. Die Preßrückstände bei der Ölgewinnung werden als Futtermittel verwertet. Rapshonig enthält die aufgenommen Blütenpollen. Befliegen die Bienen gentechnisch veränderten Raps, sind die übertragenen Gene - wie alle anderen Gene auch- im Honig nachweisbar. Zwar sind gentechnisch veränderte Rapslinien zugelassen, ein kommerzieller Anbau ist jedoch nicht vor 2002 zu erwarten. Die Vermarktung von Futter- und Lebensmitteln (Rapsöl) aus GVO-Raps ist möglich.

41 Neben Textilfasern werden aus Baumwolle auch verschiedene Lebensmittelzutaten gewonnen. - Die eiweiß- und fettreichen Samen der Baumwolle (Baumwollsaat) liefern hochwertige Öle, die als Speiseöl oder in der Margarineherstellung Verwendung finden. ( vgl. auch: pflanzliche Öle, Baumwollsaatöl) - Eiweißpräparate und -isolate sowie Baumwollsaatmilch - Zusatzstoff Methylcellulose E461 (Verdickungsmittel, Füllstoff) - Die Rückstände (Presskuchen) der Samen werden zu Tierfutter verarbeitet Genetic Engineering

42 Transgenic Cotton Bt transformed cotton untransformed cotton

43 Fische. Bisher hat die US-amerikanische Lebensmittelbehörde FDA noch nicht über gentechnisch veränderte Lachse entscheiden. Seit mehr als einem Jahr liegt ihr ein Antrag vor, Lachse als Lebensmittel zuzulassen, die durch Einführung neuer Gene doppelt so schnell wachsen wie bisher und bereits nach Monaten geschlachtet werden können. Risiken: Befürchtet wird vor allem, dass schnellwachsende transgene Fische aus den Tanks und Käfigen der Zuchtfarmen entweichen. Diese könnten sich in den natürlichen Populationen durchsetzen und die vorhandenen Arten verdrängen. Am Ende wäre das möglicherweise fatal: Da die transgenen Fische eine erhebliche kürzere Lebenszeit haben und daher weniger Nachkommen erzeugen, könnte nach mehreren Generationen der Bestand abnehmen oder gar völlig zusammenbrechen. Genetic Engineering

44 Example for the application of Genetic Engineering: Recombinant Insulin Genetic Engineering

46 Insulin Made by pancreatic beta cells Enables cells to take up glucose from the bloodstream to use in production of ATP Insufficient insulin causes diabetes (insulin dependent diabetes mellitus IDDM) Must inject insulin to avoid physiological complications Cells cannot take up glucose Insufficient ATP is made Glucose spills into urine (excreted by kidneys; kidney tries to dilute glucose by excreting large amounts of water) Genetic Engineering

47 Diabetes Mellitus Complications of diabetes (60 x 10 6 worldwide cases) Retinopathy Kidney failure Nerve disorders Circulatory diseases (including gangrene and stroke) Diabetic coma (ph imbalance caused by fat metabolism producing ketones) Genetic Engineering

48 Structure of Insulin Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total A chain = 21 amino acids B chain = 30 amino acids S - S l l A S S S S B Genetic Engineering

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50 Structure of Insulin and Processing Two disulfide bonds hold A and B together (interchain disulfide bond) One disulfide bond within the A chain (intrachain disulfide bond) Insulin processing Preproinsulin Contains a signal sequence + 3 sections of amino acids Signal sequence is removed after targeting to RER Translation continues on RER > forming proinsulin»removal of 33 amino acids at Golgi Apparatus, and joining of A and B chains to form insulin Preproinsulin too difficult for E. coli to produce Simplification had to be made! Genetic Engineering

51 Substitution of Insulin Before recombinant insulin was available, insulin was obtained from cows or pigs pancreases Cow (Bovine) = 3 amino acid differences Pig (Porcine) = 1 amino acid difference Amino acid differences can stimulate allergic responses Therefore human insulin is preferred Genetic Engineering

52 Recombinant Human Insulin rdna techniques produce recombinant human insulin: Human gene library was screened subcloned into a plasmid expression vector using lac operon to promote human insulin transcription Expression in E. coli resulted in bulges containing inclusion bodies packed full of insulin Isolation of insulin from inclusion bodies = timely and expensive Genetic Engineering

53 Improved Strategy for Producing Recombinant Insulin Signal peptide was cloned at 5 end of gene encoding a 24 aa leader that directs secretion of insulin into culture medium instead of retention inside inclusion bodies SP detaches as insulin is transported across cell membrane A chain synthesized in one E. coli strain B chain synthesized in a different E. coli strain A and B purified from culture supernatant separately then joined together/reconstituted Humulin (Eli Lilly, 1986) Continuous culture techniques used Genetic Engineering

54 Objectives chapter 1 (introduction): 1. Know and define the different fields of biotechnology 2. Define what a GVO (GMO; genetical modified organism) is 3. Compare gene expression in prokaryotes and eukaryotes 4. Know the differences between bacterial, animal and plants cells 2. Describe the basic principles of gene therapy (somatic and germ line) 3. Describe the Ti plasmid and the principle of cloning in plants 4. Be familiar with some examples of transgenic plants 5. Be familiar with the structure of insulin Genetic Engineering