Ubiquitin-vermittelte Cadmium-Resistenz und MAC 1-abhängige Regulation des Kupferund Eisenstoffwechsels

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1 0 Molekulargenetische Analyse Metall-abhängiger Prozesse in S. cerevisiae: Ubiquitin-vermittelte Cadmium-Resistenz und MAC 1-abhängige Regulation des Kupferund Eisenstoffwechsels DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Uniyersität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 1994 vorgelegt von Joern Jungmann

2 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 1 2. Einleitung Anpassung der Zelle an Umwelteinflüsse Bedeutung von Metallen für lebende Organismen Metall-regulierte Systeme Zelluläre Schutzmechanismen gegenüber toxischen Metallen Beseitigung geschädigter Komponenten: das Ubiquitin-System Reparatur geschädigter Komponenten: molekulare Chaperone Entfernen toxischer Metalle: Metallothioneine Eisen-und Kupferstoffwechsel Aufgabenstellungen Ergebnisse Bedeutung des Ubiquitin-Systems für die Cadmium-Resistenz von Hefezellen Bedeutung der Ubiquitinierung proteolytischer Substrate und deren Degradation für die Cadmium-Resistenz von Hefezellen Transkriptionelle Induktion des Ubiquitin-Systems in Gegenwart von Cadmium Charakterisierung von MAC 1, einem Vertreter einer neuartigen Familie Metall-abhängiger Transkriptionsfaktoren Homologie von MAC1 zu den Kupfer-abhängigen Transkriptionsfaktoren ACE1 und AMT Intrazelluläre Lokalisierung eines MAC 1 -/J-Galaktosidase-Fusionsproteins Charakterisierung der biologischen Funktion von MAC 1 mit Hilfe von mac/-"loss-of-function"-mutanten Lebensfähigkeit und Wachstum einer mac/-"loss-of-function"- Mutante Unabhängigkeit der C/SC7-Transkription vom MAC1 -Genprodukt 28

3 Beteiligung von MAC1 am Kupfer- und Eisenstoffwechsel der Zelle Charakterisierung der biologischen Funktion von MAC 1 mit Hilfe einer "gain-of-function"-mutante Klonierung und Sequenzierung des MACi u P'-Allels Kupfer-HypersensitivitätderMAC/^'-Mutante Abhängigkeit der Eisen-und Kupfer-Reduktaseaktivität von MAC Identifizierung von Zielgenen für MAC 1 als Transkriptionsfaktor Regulation der FÄEi-Transkription durch MAC Nachweis der Abhängigkeit der F/J 7-Transkription von MAC1 über einen ß-Galaktosidaseaktivitäts-Test Regulation der Transkription weiterer Gene durch MAC Bedeutung des Metallothioneins für die Cadmium-Resistenz von Hefezellen Induktion des Hefe-Metallothioneins in Gegenwart von Cadmium Einfluß von Kupfer auf die Cadmium-Resistenz von Hefezellen Analyse der Cadmium-Resistenz von Hefezellen in Abhängigkeit von der Expression des Hefe-Metallothioneins Diskussion Cadmium-Resistenz in S. cerevisiae MAC 1, ein Metall-abhängiger Transkriptionsregulator des Kupferund Eisenstoffwechsels in 5. cerevisiae Regelkreise im Stoffwechsel physiologischer und bei der Entgiftung toxischer Metalle Material und Methoden Chemikalien Bakterienstamm Saccharomyces cerevisiae-stamrae Vektoren Desoxyoligonukleotide Medien Bakterienmedien Hefemedien 70 72

4 5.7 Zellanzucht Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen Langzeitlagerung von Zellen Kompetente Bakterienzellen und Bakterientransformation Calciumchlorid-Methode Elektroporation Kompetente Hefezellen und Hefetransformation Lösungen DNA-Techniken Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Minilyse Plasmid-Midipräparation Präparative Plasmid-DNA-Isolierung Isolierung von DNA aus Hefe Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Phenol/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren Ligation von DNA Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen DNA-Agarosegelelektrophorese Southern-Blot Sequenzierung von DNA Methoden im Umgang mit RNA Minipräparation von Gesamt-RNA aus Hefe Präparative Isolierung von Gesamt-RNA aus Hefe Denaturierung von RNA RNA-Agarosegelelelektrophorese Färben von RNA-Agarosegelen Northern-Blot Allgemeine Methoden im Umgang mit Nukleinsäuren Dialyse von Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Fällung von Nukleinsäuren mit Ethanol Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren Radioaktive Markierung von DNA-Restriktionsfragmenten '-Endmarkierung von Desoxyoligonukleotiden Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA Denaturierung von hybridisierten Nukleinsäuren auf Nylonfiltern 95

5 Autoradiographie Spezielle Methoden im Umgang mit Hefe Tetradenanalyse Integrative Transformation über homologe Rekombination Koloniehybridisierung Analytische Methoden Indirekte Immunfluoreszenz Enzymatischer Test der 0-Galaktosidaseaktivität Bestimmung der Sauerstoff aufnähme in die Zelle Bestimmung der Eisen-und Kupfer-Reduktaseaktivität Untersuchung der Reduktaseaktivitäten von Hefestämmen mit Hilfe von 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium-chlorid (TTC) Gradientenplatten zur Analyse des Wachstums von Hefestämmen Literatur Abkürzungen 120