Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Die Transplantation autologer Lymphknotenfragmente als Therapiemöglichkeit des sekundären Lymphödems Einfluss der VEGF-C-Applikationsparameter auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.) vorgelegt von Lia Schindewolffs Rendsburg Hannover 2012

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves Physiologisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst Institut für Immunmorphologie Medizinische Hochschule Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves Physiologisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. Reinhard Pabst Institut für Immunmorphologie Medizinische Hochschule Hannover 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meiner Familie und Christoph

4 Die Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form von Postern auf folgenden Fachtagungen präsentiert: 17 th IVBM 2012 International Vascular Biology Meeting, Wiesbaden: VEGF-C application pattern improves the regeneration of autotransplanted lymph node fragments and the reconnection with the lymphatic system Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst 38 th ESL European Congress of Lymphology in Berlin: VEGF-C-application and the regeneration and reconnection of autotransplanted lymph node fragments in rats: the effects of time point, location and dosage Autoren: L. Schindewolffs, M. Büttner, C. Hadamitzky, G. Breves, R. Pabst

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7 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT Aufgaben des Lymphsystems Immunabwehr Transport im Fettstoffwechsel Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems Anatomischer Aufbau des Lymphknotens Entstehung des Lymphsystems VEGF-C und VEGF-R Pathologie Das primäre Lymphödem Das sekundäre Lymphödem Filariose Lymphangitis Brustkrebstherapie Folgen eines sekundären Lymphödems Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems Ziel dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN Allgemeines Vorversuch Tiere...20

8 Inhaltsverzeichnis 3.4. Gruppengröße Haltung Präoperative Versorgung Chirurgie chirurgische Modifikationen Operationsabschluss Postoperative Versorgung Die Gruppen Transplantat-Entnahme Makroskopische Untersuchung und Auswertung Technische Aufbereitung der Proben Mikroskopische Untersuchung und Färbung Lichtmikroskopische Untersuchung Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung Statistik Zeitpunkt Lokalisation Dosis ERGEBNISSE Vorversuch Chirurgische Modifikation Makroskopisch Statistik Zeitpunkt Lokalisation Dosis...42

9 Inhaltsverzeichnis 4.4. Mikroskopisch Statistik Zeitpunkt Lokalisation Dosis DISKUSSION Die Modifikation der Methode Die Parameter: Zeitpunkt, Lokalisation, Dosis Der Wiederanschluss der Transplantate an das Lymphgefäßsystem Zeitpunkt Lokalisation Dosis Die Regeneration der Transplantate Zeitpunkt Lokalisation Dosis Résumé: Einfluss der Parameter auf die Transplantate Aussichten und Diskussion von Material und Methoden Schlussfolgerung ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY... 69

10 Inhaltsverzeichnis 8. LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Verzeichnis verwendeter Abkürzungen Verzeichnis verwendeter Abbildungen Verzeichnis verwendeter Tabellen Details zur Statistik Ergebnisse zum Wiederanschluss der Transplantate mit dem Lymphgefäßsystem Ergebnisse zur Regeneration der Transplantate DANKSAGUNGEN

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13 Einleitung 1. Einleitung Das Lymphsystem übernimmt im Körper verschiedene essentielle Aufgaben. Diese bestehen nicht nur in der Steuerung der Immunabwehr und der Produktion lebenswichtiger Antikörper (TAMMELA et al. 2010), sondern ebenso aus seiner Beteiligung am Fettmetabolismus (OHTANI u. OHTANI 2008 A) und der Erhaltung der Homöostase von Körperflüssigkeiten (TAMMELA et al. 2010). Wird dieses System gestört, kommt es zu einer pathologischen Akkumulation proteinreicher Flüssigkeiten im Gewebe, dem Lymphödem. Dieses kann primären oder sekundären Ursprungs sein. Primäre Lymphödeme sind angeboren und entstehen z.b. durch genetische Defekte wie bei der Milroy Disease (BUTLER et al. 2007) oder durch Mutationen von Transkriptionsfaktoren wie bei dem Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom (IRRTHUM et al. 2003). Sie sind seltener als das sekundäre Lymphödem, das durch äußere Einflüsse und somit erst nach der Geburt erworben wird. Weltweit ist die häufigste Ursache für ein sekundäres Lymphödem eine Infektion mit Fadenwürmern, die Filariose (PFARR et al. 2009). Das Lymphödem manifestiert sich bei dieser Erkrankung hauptsächlich an den unteren Extremitäten. In den Industrienationen ist dagegen eine andere Ursache für das sekundäre Lymphödem vorherrschend: die Krebstherapie (ALITALO et al. 2005). Insbesondere die Therapie von Brustkrebs kann eine Lymphödementstehung auslösen. Doch auch die Therapie anderer Krebsarten, wie Zervikal- und Vulvakarzinome, Hautkrebs oder Peniskarzinome können ein sekundäres Lymphödem verursachen. Bei der Brustkrebstherapie stehen heutzutage wesentlich differenziertere Methoden als noch vor einigen Jahren zur Verfügung. Während früher eine komplette Ausräumung der Achsellymphknoten, die Axilladissektion, oder gar die Abnahme der Brust, die Mastektomie, als die Therapien der Wahl bei Brustkrebs galten, wird heute zu weniger radikal-invasiven Mitteln gegriffen, sofern dies das Krankheitsstadium erlaubt. Nach dem Fund von tumorösem Drüsengewebe wird in der Regel eine Entfernung des Tumors und des Wächterlymphknotens (engl.: Sentinel Lymph Node, SLN) vorgenommen. Sollten sich in 1

14 Einleitung diesem Lymphknoten keine Metastasen befinden, folgt keine weitere chirurgische Intervention. Zusätzliche Maßnahmen werden erst erforderlich, sollte die histologische Untersuchung des SLN Metastasen aufweisen. Nach einem solchen Fund werden anschließend alle axillären Lymphknoten der betroffenen Körperseite entfernt. Allerdings besteht unabhängig von der Methode, aufgrund der Störung des Lymphgefäßsystems, für die Patientinnen die Gefahr ein ipsilaterales Lymphödem auszubilden. Ein Lymphödem birgt für die Patientinnen eine Vielzahl von Risiken und einen mannigfaltigen Leidensdruck. Diese Probleme können psychischer Natur sein wie Angst vor der Rückkehr des Krebses, ein negatives Körpergefühl und Frustration (MORGAN et al 2005). Sie können sich aber auch physisch auswirken. Durch Umbauprozesse des Gewebes bei einem chronischen Lymphödem (MORGAN et al. 2005) kann es zu einer Verschlechterung der Hautqualität kommen, wodurch langanhaltende und schlecht heilende Wundinfektionen auftreten können. Die derzeitige Lymphödemtherapie ist rein symptomorientiert und besteht aus einer Kombination von manueller Entstauungstherapie -der Lymphdrainage- und körperlicher Aktivität wie beispielsweise Schwimmeinheiten, sowie dem Tragen von Bandagen. Diese Behandlungen können den Patientinnen zwar für kurze Zeit Linderung verschaffen, bieten aber keine Möglichkeit einer dauerhaften Minderung oder gar Ausheilung des Ödems. Nachhaltig wirkungsvolle chirurgische Therapieansätze gibt es momentan keine (MEHRARA et al. 2011). In den letzten Jahren haben sich einige Arbeitsgruppen damit beschäftigt, autologe Lymphknotenfragmente avaskulär, also ohne direkte chirurgische Verbindung der verbleibenden Blut- und Lymphgefäße an das Lymphknotenfragment, subkutan zu transplantieren. Dies wurde bereits beim Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u. ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), der Maus (TAMMELA et al. 2007) und der Ratte (BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al B) erfolgreich durchgeführt. Um den Wiederanschluss der Transplantate zu fördern, wurde dabei z.b. das Platelet Rich Plasma (PRP) nach der Transplantation injiziert. PRP besteht neben Blutplättchen auch aus einer Reihe von Wachstumsfaktoren, die sich auf die Gefäßneubildung (Angiogenese) auswirken. Einer dieser Faktoren ist der Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C). 2

15 Einleitung TAMMELA et al. (2007) haben im Zusammenhang mit der avaskulären Transplantation autologer Lymphknotenfragmente einen positiven Effekt des VEGF-C auf das Lymphgefäßwachstum feststellen können. Kürzlich haben auch SOMMER et al. (2012 B) ihre Ergebnisse der autologen, avaskulären Transplantation von Lymphknotenfragmenten in Kombination mit der Injektion von VEGF-C veröffentlicht. Die Versuche wurden hierbei an weiblichen Lewis Ratten durchgeführt, denen avaskulär autologe Lymphknotenfragmente in die rechte Leiste transplantiert wurden. Anschließend wurde den Tieren in der ersten Woche an 3 Tagen intradermal 6,67µg VEGF-C pro Tier in die unmittelbare Nähe der Transplantate injiziert. Die Tiere bekamen eine Ruhephase von 4 Wochen bevor die Transplantate entnommen und histologisch sowie immunhistochemisch untersucht wurden. Mit dieser Methode wurde ein positiver Einfluss von VEGF-C auf sowohl die Lymphangiogenese als auch auf die Regeneration der Lymphknotenfragmente gezeigt (SOMMER et al B). In diesen Experimenten wurde allerdings nicht untersucht, welche Auswirkungen eine Veränderung der VEGF-C-Applikations-Parameter Zeitpunkt, Lokalisation und Dosis auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate hat. Primäres Ziel dieser Arbeit war es daher, die Grundlagen und Methoden der Arbeit von SOMMER et al. (2012 B) aufzugreifen und die VEGF-C-Applikations-Parameter Zeitpunkt, Lokalisation und Dosis auf ihre Einflüsse auf die Regeneration und den Wiederanschluss der Transplantate zu untersuchen. In Form eines Vorversuches wurde dabei ebenfalls untersucht, ob die Länge der Ruhephase, die bei SOMMER et al. (2012 B) mit 4 Wochen angegeben ist, Einfluss auf die Regeneration der Lymphknotenfragmente hat. Eine 8 wöchige Ruhephase wurde erprobt. In diesem Zusammenhang wurden Probleme durch die von SOMMER et al. (2008 B) verwendete Technik der Lymphknoten-Fixierung entdeckt, die sich bei der Entnahme der Lymphknotenfragmente äußerten. Eine Entfernung der Transplantate war in den meisten Fällen mit Substanzverlusten dieser verbunden, da es in der Ruhephase zu Verwachsungen der transplantierten Lymphknotenfragmente mit dem Knoten des nicht resorbierbaren Nahtmaterials kam. Zunächst bestand das Ziel dieser Arbeit somit darin, die Methodik der avaskulären Transplantation autologer Lymphknotenfragmente dahingehend zu modifizieren, dass ihre substanzverlustfreie Entnahme durchgeführt werden kann. 3

16 Einleitung Insgesamt sollte so eine möglichst effektive und zuverlässige avaskuläre Transplantation und Entfernung autologer Lymphknotenfragmente ermöglicht und damit die Regenerations- und Wiederanschlussraten der Transplantate verbessert werden. Insbesondere in Hinblick auf eine Prävention des sekundären Lymphödems, wie es z.b. nach einer Brustkrebstherapie entsteht, könnte eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation dienen. 4

17 Literaturübersicht 2. Literaturübersicht 2.1. Aufgaben des Lymphsystems Das Lymphsystem ist an vielen lebenswichtigen Funktionen des Körpers beteiligt. So spielt es unter anderem im Immunsystem eine zentrale Rolle. Nach dem Eindringen von Antigenen in den Körper starten zwei Immunmechanismen. Zum einen die unspezifische, zum anderen die spezifische Immunabwehr. Insbesondere die spezifische Immunabwehr ist eng mit dem Lymphsystem verbunden; transportiert dieses doch die Immunzellen und stellt mit seinen Lymphknoten einen essentiellen Part für die Entstehung spezifischer Abwehrzellen sowie den Austausch dieser untereinander dar Immunabwehr Die Vorgänge der Immunabwehr werden in zahlreichen Übersichten in der Literatur beschrieben, so u.a. auch von STEINIGER (2008): Im unspezifischen Teil spielen vor allem die Monozyten, Makrophagen und Granulozyten eine zentrale Rolle, die durch die Abgabe bakterizider Substanzen und der Phagozytose eine erste Barriere für eindringende Antigene darstellen. Dieses System startet zwar schnell, stellt jedoch eine nicht so effiziente Abwehr bei Wiederkontakt wie das spezifische Immunsystem dar. Zudem gelingt es einigen Erregern sich dieser ersten Abwehr zu entziehen, so dass spezifischere Mechanismen notwendig werden. Die Produktion und Sekretion von Immunglobulinen durch Plasmazellen bilden den humoralen Teil der spezifischen Immunabwehr, während die Aktivierung von T-Lymphozyten die wesentliche Komponente des zellulären Teils darstellt. Die B- und T-Lymphozyten tragen Antigenrezeptoren, die immer nur kleine und spezielle Abschnitte eines Antigens, das sogenannte Epitop, erkennen. Sobald ein B-Lymphozyt Kontakt mit einem solchen Epitop hatte, ist er aktiviert und wandelt sich zu einer Plasmazelle um. Diese wiederum produziert Immunglobuline. Neben dem Blutsystem dient insbesondere das Lymphsystem dazu diese im Körper zu verteilen. Die Aufgabe von T-Lymphozyten in der zellulären Abwehr besteht darin, nach Antigenkontakt z.b. Virus-infizierte Zellen zum Absterben zu bringen. 5

18 Literaturübersicht Eine Sonderstellung in diesem System aus unspezifischer und spezifischer Abwehr nehmen die dendritischen Zellen (DC) ein. Sie lassen sich zu keiner der beiden Einheiten eindeutig zuordnen. Dendritische Zellen sind sehr effektive antigenpräsentierende Zellen, die als einzige in der Lage sind CD4-positive T-Lymphozyten zu stimulieren und ihnen Antigene zu präsentieren. Sie werden mit der Lymphe in die regionären Lymphknoten transportiert und verbleiben dann im Paracortex, einer T-Lymphozyten-reichen Region im Lymphknoten. Hier wandeln sie sich vermutlich zu interdigitierenden DCs (IDC) um. Ähnlich benannte, aber dennoch grundverschiedene Zellen sind die ortsständigen und nicht wandernden follikulär dendritischen Zellen (FDC). Sie sind in den Follikeln von Tonsillen, Lymphknoten und anderen sekundären lymphatischen Organen beherbergt. FDCs sind essentiell für wandernde B-Lymphozyten, die in den Keimzentren der Follikel ausreifen und nur durch den Kontakt mit den FDCs überleben. Somit stellen die sekundär lymphatischen Organe und das Lymphsystem wichtige Pfeiler für die Abwehr dar Transport im Fettstoffwechsel Auch im Fettstoffwechsel ist das Lymphsystem als Transportmedium beteiligt. So werden Lipide und die fettlöslichen Vitamine E, D, K und A nach ihrer Resorption aus dem Darmtrakt über das Lymphsystem transportiert (OHTANI u. OHTANI 2008 A). Sind die Lipide in die Lymphe aufgenommen, stellt sich diese milchig dar Flüssigkeitshaushalt und anatomischer Aufbau des Lymphsystems Nicht nur Fettbestandteile und Immunzellen werden über die Lymphe transportiert, sondern insbesondere beträchtliche Mengen an Gewebsflüssigkeit. Bei einem erwachsenen Menschen werden pro Minute durchschnittlich 4-6 Liter Blut durch das Kapillarsystem gepumpt. Dabei wird das Blut über das arterielle System zu den feinen Kapillaren transportiert und ein Teil der darin enthaltenen Flüssigkeit gelangt in das Interstitium (v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN 2008). Der andere Teil wird von den feinen 6

19 Literaturübersicht Venulen des Blutsystems aufgenommen und überschüssige Flüssigkeit wird über die Niere ausgeschieden. Damit schließt sich über das venöse System der Blutkreislauf. Der im Interstitium verbliebene Teil wird vom Lymphsystem aufgenommen. Einzelheiten zum Aufbau des Lymphsystems und der Verteilung der Immunzellen wurden von v. RAUTHENFELD u. DRENCKHAHN (2008) beschrieben und hier im Folgenden zusammengefasst. Die in der Regel parallel zu den Venen laufenden Lymphgefäße finden ihren Ursprung in einem blind beginnenden kleinen Lymphkapillarnetz, dem Rete lymphocapillare. Das Endothel in diesem Bereich ist, im Gegensatz zu den kontinuierlichen Zellverbindungen der Blutgefäße, diskontinuierlich. Diese Verbindungen des Lymphendothels werden als button like junctions bezeichnet (BALUK et al. 2007). Die Lymphendothelzellen überlappen einander und bilden mäanderförmige Intrazellularspalte. Diese Spalte, im Zusammenhang mit einer fehlenden Basallamina und einem ausgeklügelten Filamentbündel-System, ermöglichen die Aufnahme von Gewebsflüssigkeit und deren Bestandteilen, ohne dass bei erhöhtem interstitiellen Flüssigkeitsdruck die Lymphkapillaren kollabieren. Der Einstrom von Flüssigkeit in die Kapillaren ist ein durch den Druck bestimmter Mechanismus. Steigt der Gewebsdruck, wird die Flüssigkeit durch die Spalten der Lymphendothelzellen hindurchgedrückt. Die Einflussventile klappen dabei nach innen und bieten dem Einstrom Platz. Sobald der Druck in den Lymphkapillaren den Gewebsdruck übersteigt werden die Intrazellularspalte durch das Hochdrücken der Einflussventile wieder verschlossen. Die aufgenommene Flüssigkeit wird über Präkollektoren weiter transportiert. Im Gegensatz zu den Kapillaren besitzen die Präkollektoren nun Klappen, die die Lymphe daran hindern retrograd zu fließen. Die Präkollektoren münden in die größeren Kollektoren, welche nicht nur die Klappen im Inneren besitzen, sondern außerdem mit einer feinen Muskelschicht aus glatten Myozyten umhüllt sind. Ein Abschnitt von Klappe zu Klappe innerhalb der Kollektoren wird als Lymphangiom bezeichnet. Lymphangiome kontrahieren, induziert durch die Schrittmacherfunktion der Muskelzellen (Myozyten) (OHTANI u. OHTANI 2008 A). Während der Transport von Lymphe grundsätzlich durch Körperposition, Atembewegung und nicht gefäßassoziierter Muskelaktivität gestaltet wird (FOLDI u. FOLDI 2006), bieten die Myozyten der Kollektoren in Kombination mit den Klappen, die den Lymphrückfluss verhindern, eine eigene, zusätzliche Komponente zum gerichteten Lymphtransport, der Lymphpropulsion. Die Kollektoren unterteilen sich in afferente und efferente Kollektoren. Die afferenten sind die pränodalen Lymphgefäße, die die Lymphe zu den Lymphknoten hin leiten. Die efferenten 7

20 Literaturübersicht leiten die Lymphe von den Lymphknoten weg; sie sind somit postnodal. Zwischen ihnen liegen die Lymphknoten. Bei zwei nacheinander geschalteten Lymphknoten ist das efferente Gefäß gleichzeitig das afferent des nachfolgenden Knotens. Die efferenten Kollektoren leiten die Lymphe weiter in die großen Lymphstämme, die Trunci lymphatici. Die Lymphstämme schließen sich ihrerseits zu Lymphgängen (Ductus lymphatici), zu welchen auch der Milchbrustgang (Ductus thoracicus) gehört, zusammen und münden in den rechten und linken Venenwinkel. Der linke Venenwinkel nimmt die Lymphe aus der linken Körperhälfte, den Beinen und aller Bauchorgane und somit den größeren Teil der Lymphe auf (FOLDI u. FOLDI 2006). Die Lymphe aus der oberen rechten Körperhälfte und den Organen der rechten Brusthöhle (zusammen der sogenannte rechte obere Körperquadrant) fließt in den rechten Venenwinkel und anschließend über das Blutgefäßsystem ab. Im Ductus thoracicus kommen von den im Interstitium anfallenden Flüssigkeitsmengen nur ca. 2-3 Liter pro Tag an, denn auf ihrem Weg über das Lymphsystem wird der Lymphe an verschiedenen Stellen des Lymphsystems Wasser entzogen. Eine Station dafür sind die initialen Lymphgefäße (Kapillaren und Präkollektoren). Eine andere Station ist der Lymphknoten. Hier lässt sich feststellen, dass die Osmolarität der Lymphe vor dem Eintritt in den Lymphknoten geringer ist als nach ihrem Austritt, was zu dem Schluss führt, dass ca. 35% des Wassers und der Elektrolyte aus der afferenten Lymphe im Lymphknoten an das Blutplasma zurückgegeben werden (OHTANI et al. 2003). Über den genauen Transportmechanismus und die daran beteiligten Strukturen ist noch vieles unklar (OHTANI u. OHTANI 2008 B). Da jedoch festgestellt werden konnte, dass der Membrankanal Aquaporin-1 (AQP-1) vielzählig an Blutgefäßen, initialen Lymphgefäßen und innerhalb des Lymphknotens an speziellen postkapillären Venulen (HEV) exprimiert wird, geht man von einer Beteiligung von AQP-1 am Lymph-Plasma-Strom aus (OHTANI et al. 2003). Der Lymphknoten wird somit sowohl durch seinen Beitrag zum Immunsystem als auch durch seine Fähigkeiten zur Wasserresorption zum Schlüsselelement des Lymphgefäßsystems. 8

21 Literaturübersicht 2.3. Anatomischer Aufbau des Lymphknotens Der anatomische Aufbau des Lymphknotens gliedert sich in verschiedene Segmente. Ein Segment stellt eine funktionelle Einheit des Lymphknotens dar, wobei ein Lymphknoten aus nur einem oder vielen Segmenten bestehen kann (WILLARD-MACK 2006). Umhüllt wird der Lymphknoten durch eine bindegewebige Kapsel, von der aus feine Trennwände, die Trabekel, in das Innere des Lymphknotens und zwischen die einzelnen Segmente ziehen. Einzelheiten zum anatomischen Aufbau und die Verteilung der Immunzellen können bei PABST (2008) nachgelesen werden. Es folgt eine Zusammenfassung. In den Lymphknoten hinein münden die afferenten Lymphgefäße, die die Lymphe in die Randsinus leiten. Die lymphatischen Sinus umgeben und durchziehen die einzelnen Segmente. Sie werden, je nach Literatur, unterteilt in Randsinus, Intermediärsinus und Marksinus, oder in subkapsulären, trabekullären, transversen und medullären Sinus (WILLARD-MACK 2006). Über dieses System wird die Lymphe aus ihren Drainagegebieten in den Lymphknoten transportiert und optimal verteilt. Einen Abfluss findet die Lymphe über efferente Lymphgefäße, die wie Vene und Arterie über den Hilus des Lymphknotens in ihn eintreten. Während viele afferente Lymphgefäße in den Lymphknoten münden, führt in der Regel nur ein einziges Lymphgefäß vom Lymphknoten weg (WILLARD-MACK 2006). Ein Segment lässt sich vom Rand zum Hilium in 3 Zonen aufteilen: Cortex, Paracortex und Medulla. Lymphozyten sind im Cortex zu Follikeln angesammelt, sogenannten Noduli lymphoidei. Man kann diese Follikel wiederum in Primär- und Sekundärfollikel unterteilen. Primärfollikel bestehen nur aus einer Lymphozytenart. Sekundärfollikel unterteilen sich in eine Corona und ein Keimzentrum. Im Keimzentrum findet die Differenzierung vom B-Lymphozyten statt. Follikel sind reich an FDCs und B-Lymphozyten. Dagegen sind T-Lymphozyten hier nur in geringer Zahl aufzufinden. Diese sind größtenteils in dem Paracortex beheimatet. Hier können auch die IDCs aufgefunden werden. Im Bereich der Medulla sind wenige Lymphozyten sowie Plasmazellen, die als Antikörper- Produzenten dienen, vorhanden. Der Paracortex beinhaltet neben den zahlreichen T-Lymphozyten noch spezialisierte postkapilläre Venulen. Diese besitzen bei den meisten Spezies ein kubisches Endothel, weshalb sie als hochendotheliale Venulen (HEV) bezeichnet werden. Es ist bekannt, dass Lymphozyten über die HEVs in den Lymphknoten eintreten können (OHTANI u. OHTANI 9

22 Literaturübersicht 2008), dass sie über diesen Weg auch wieder aus dem Lymphknoten austreten können, ist bisher nur für das Schwein nachgewiesen (BINNS et al. 1985). Abbildung 1.: Schema der Kompartimentierung des Lymphknotens PABST (2008): Die Abbildung stellt die Aufteilung in Cortex, Paracortex und Medulla, den Blut- und Lymphfluss, sowie die verschiedenen Zellen des Lymphknotens dar. 10

23 Literaturübersicht 2.4. Entstehung des Lymphsystems Die Entstehung des Lymphsystems ist ein Prozess, der noch nicht vollends geklärt ist. ALITALO u. CARMELIET (2002) haben in ihrem Review zu den molekularen Mechanismen der Lymphangiogenese die wichtigsten Thesen und Tatsachen zusammengefasst. Es wird beschrieben, dass 1902 Sabin die Theorie begründete, dass aus embryonalen Venen Endothelzellen knospen und sich daraus ein primitiver Lymphsack bildet. Das periphere Lymphsystem soll nach seiner Theorie von diesem primären Lymphsack sprießen und sich zu Lymphkapillaren ausbilden. Weiterhin wird in dem Review auf heutige genetische Studien verwiesen, die zeigen, dass sich venöse Endothelzellen, angeregt durch bislang unbekannte Signale, zu lymphatischen Endothelzellen differenzieren und so Lymphgefäße sprießen. Außerdem beschreiben sie als eine weitere These die Entstehung des Lymphsackes aus dem Mesenchym durch Vorläuferzellen, den Lymphangioblasten. Der initiale Lymphsack hat zunächst keine Gefäßverbindung. Diese entwickelt sich erst im weiteren Verlauf. ALITALO u. CARMELIET (2002) gehen von einer Kombination dieser beiden Thesen zur Entstehung des Lymphsystems aus. Gesichert ist, dass das primitive Blutgefäßsystem aus Vorläuferzellen, den Angioblasten, entsteht. Der Prozess wird als Vaskulogenese bezeichnet (ALITALO u. CARMELIET 2002). Im weiteren Verlauf verfeinern und differenzieren sich diese Strukturen zusehends und man spricht von der Angiogenese (ALITALO u. CARMELIET 2002). Die Entstehung des Lymphgefäßsystems, die Lymphangiogenese, schließt sich unmittelbar an (ALITALO u. CARMELIET 2002). Die Wachstumsfaktoren aus der VEGF-Familie spielen bei der Stimulation und Lenkung der Angiogenese und insbesondere der Lymphangiogenese eine zentrale Rolle (ALITALO u. CARMELIET 2002) VEGF-C und VEGF-R3 ALITALO u. CARMELIET (2002) beschreiben weiter, dass der Vascular Endothelial Growth Factor Rezeptor-3 (VEGFCR-3) zunächst in Blutendothelzellen exprimiert wird und nach Differenzierung zu Lymphendothelzellen auch an diesen zu finden ist. VEGFCR-3 ist ein Rezeptor für den Wachstumsfaktor Vascular Endothelial Growth Factor - C (VEGF-C). Dieser Rezeptor wurde neben Lymphatic Vessel Hyaluronan Receptor - 1 (LYVE-1) und Prospero- Related Homeobox Transcprition Factor - 1 (Prox-1) in der Arbeit von TAMMELA u. ALITALO von 2010 an allen sich entwickelnden Lymphgefäßen detektiert. Im ausgereiften Zustand 11

24 Literaturübersicht werden diese Rezeptoren an den einzelnen Lymphgefäßabschnitten jedoch unterschiedlich stark exprimiert (TAMMELA u. ALITALO 2010). VEGF-C und VEGFCR-3 sind also immer dort zu finden, wo neue Lymphgefäße sprießen, sowohl im Embryo als auch bei Regenerationen während eines Krankheitsprozesses (ALITALO u. CARMELIET 2002). VEGF-C fungiert dabei als Stimulator für das Wachstum, die Migration und das Überleben von Lymphendothelzellen (ALITALO u. CARMELIET 2002). Auf die Stimulation von VEGF-C auf die Lymphangiogenese wird in weiteren Übersichten in der Literatur verwiesen. In dem Review von LOHELA et al. (2003) wird die Bedeutung von VEGF-C für die Lymphangiogenese deutlich. Auch NORRMEN et al. (2011) beschreiben kürzlich, dass VEGF-C der einzige Wachstumsfaktor ist, der spezifisch auf die Entwicklung von Lymphgefäßen gerichtet ist. Wie fatal das Fehlen von VEGF-C ist, führen ALITALO et al. (2005) in einem weiteren Review aus. Hier wird beschrieben, dass das Fehlen von VEGF-C in Mäuse-Embryonen zu einer kompletten Abwesenheit von Lymphgefäßen führt Pathologie Wird die Integrität des Lymphsystem gestört, hat dies weitreichende Folgen für den Organismus, insbesondere bezogen auf den Flüssigkeitshaushalt. Es bildet sich ein Lymphödem aus. Diese pathologische Akkumulation von Gewebswasser resultiert aus einem gestörten Gleichgewicht zwischen lymphatischen Lasten und der lymphatischen Transportkapazität (ROCKSON 2010). Störungen können primärer oder sekundärer Natur sein. Ihre Einteilung erfolgt daher auch in primäres Lymphödem und sekundäres Lymphödem Das primäre Lymphödem Insbesondere kongenital hereditäre Erkrankungen, wie beispielsweise die Krankheit Milroy Disease oder das Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom, führen zu einem primären Lymphödem. Milroy Disease ist eine autosomal dominant vererbbare Krankheit, die zu einem primären Lymphödem insbesondere in den Beinen führt (BUTLER et al. 2007). Sie kann bereits bei der Geburt ausgebildet sein oder nach 2 Lebensjahren in Erscheinung treten (WARREN et al. 12

25 Literaturübersicht 2007). Ursache für die Krankheit ist eine Mutation des Gens flt 4. Dieses kodiert für den VEGF-Rezeptor-3 (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008). Defekte dieses Rezeptors führen zu einer fehlerhaften Entwicklung oder gar einer Aplasie der peripheren Lymphkanäle (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008). Beim Hypotrichose-Lymphödem-Teleangiektasie-Syndrom steht als Auslöser eine Mutation des Transkriptionsfaktor-Gens SOX18 in Verdacht (IRRTHUM et al. 2003). Auch bei dieser Erkrankung ist ein Lymphödem insbesondere in den Beinen zu beobachten (IRRTHUM et al. 2003). Primäre Lymphödeme sind sehr selten. Deutlich häufiger treten sekundäre Lymphödem auf. Sie entstehen immer dann, wenn durch äußere Einflüsse das Lymphsystem gestört wird Das sekundäre Lymphödem An der Spitze der Ursachen eines sekundären Lymphödems steht eine Infektion mit Parasiten. Weltweit waren 2009 schätzungsweise 120 Millionen Menschen mit Fadenwürmern infiziert (PFARR et al. 2009) Filariose Die sogenannte Filariose ist die häufigste Erkrankung nach Malaria und Tuberkulose (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008) und somit ein beträchtliches Problem auf der Welt. In der Regel findet eine Infektion mit den Nematoden (Fadenwürmern) Wuchereria bancrofti, Brugia malayi und Brugia timori statt (PFARR et al. 2009). Nach ihrer Invasion in den Körper, gelangen diese in das Lymphgefäßsystem. Es entstehen Granulome um die Würmer, was zu einer retrograden Lymphangitis und Lymphadenitis führt (PFARR et al. 2009). Es schließt sich eine Dilatation der Gefäße an, die in einer verminderten Effektivität des Lymphtransportes resultiert (PFARR et al. 2009). Ein Lymphödem ist eine typische klinische Präsentation der Infektion (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008). 13

26 Literaturübersicht Lymphangitis Auch eine Lymphangitis kann zu einem sekundären Lymphödem führen. Sie wird verursacht durch eine Entzündung von Lymphgefäßen während einer Infektion mit beispielsweise Bakterien, Viren oder Pilzen (RADHAKRISHNAN u. ROCKSON 2008) Brustkrebstherapie Auch wenn die Filariose die weltweit häufigste Ursache eines sekundären Lymphödems ist, so ist sich in den Industrienationen eine ganz andere vorherrschend: die Brustkrebstherapie (ALITALO et al. 2005). Auch andere sekundäre Faktoren, wie Unfälle, bei denen die Lymphknoten geschädigt werden, oder auch weitere Krebsarten wie Vulva-, Zervix- oder Peniskarzinome so wie Hautkrebs können zu sekundären Lymphödemen führen. Insbesondere wird im Folgenden aber auf die Brustkrebstherapie eingegangen, da Brustkrebs die häufigste Krebserkrankung der Frau ist. Die geschätzten jährlichen Brustkrebsneuerkrankungen lagen 2009 in den USA bei 27% (JEMAL et al. 2009) aller bösartigen Tumoren und führten die Liste der Krebsneuerkrankungen bei Frauen an. Die Problematik des Brustkrebses liegt in der Metastasierung. Einzelne Zellen lösen sich vom Tumor ab und wandern über afferente Lymphgefäße in den drainierenden Lymphknoten. Sind regionäre Lymphknoten in der Achsel betroffen, müssen diese entfernt werden. Das chirurgische Entfernen von Lymphknoten führt zu einem Trauma des Lymphgefäßsystems und damit zu einem gestörten Transport von Gewebswasser. Das Resultat kann ein sekundäres Lymphödem im ipsilateralen Arm sein. Die Inzidenz eines Armlymphödems nach Brustkrebstherapie liegt bei bis zu 30% (WILLIAMS et al. 2005). Die Rate für Lymphödeme nach einer kompletten Ausräumung der Achsel in Kombination mit einer Entfernung der Brust (Mastektomie) liegt zwischen 24% und 49% (WARREN et al. 2007). Auch bei anderen Krebsarten, wie beispielsweise Vulva- oder Zervixkarzinomen, müssen bei Befall regionäre Lymphknoten ausgeräumt werden. Die Entfernung der inguinalen Lymphknoten kann ebenfalls zu einem Lymphödem führen. Die Inzidenz liegt hierbei nach einigen Studien sogar bei 40% (WILLIAMS et al. 2005). 14

27 Literaturübersicht Die Behandlung von Brustkrebs hat sich im Laufe der Zeit gewandelt. Hat man früher oft direkt nach Brustkrebserkennung eine Mastektomie vollzogen, so ist man im Laufe der Zeit dazu übergegangen, den Tumor und die regionalen Lymphknoten auszuräumen und das restliche Brustgewebe zu erhalten. Heutzutage bedient man sich einer Methode, bei der nach Tumordiagnose und unter der Entfernung des Tumorgewebes eine Sentinel Lymph Node (SLN, Wächterlymphknoten) Biopsy durchgeführt wird. Der Wächterlymphknoten ist der erste Lymphknoten, der das Tumorgebiet drainiert. Er wird unter einer SLN Biopsie entnommen und auf Metastasen untersucht. Sollten histologisch keine Metastasen auffindbar sein, wird nicht weiter interveniert (GIULIANO et al. 2011). Sind Metastasen vorhanden, müssen regionäre Lymphknoten entfernt werden (GIULIANO et al. 2011). Man erhofft sich durch die Methode eine minimale Morbidität (GOLDBERG et al. 2011). Trotz verbesserter Inzidenz für ein Lymphödem, erkranken allerdings auch unter der Methode der SLN Biopsie weiterhin bis zu 22% (GOLDBERG et al. 2011). Die meisten Quellen geben eine Inzidenz von 3-7% an (GOLDBERG et al. 2011). Bei einer lokalen Bestrahlung des Gewebes, wie es häufig zusätzlich notwendig ist, steigt die Inzidenz noch weiter Folgen eines sekundären Lymphödems Die Folgen eines sekundären Lymphödems sind für die betroffenen Frauen weitreichend. Sie äußern sich in psychischen Beschwerden wie ein negatives Körpergefühl, das Gefühl der Isolation, Traurigkeit, Hilflosigkeit und Ängsten (MORGAN et al. 2005), aber auch in physischem Leiden wie Schmerzen (MORGAN et al. 2005). Die Mobilität der Gliedmaße wird zudem eingeschränkt, so dass alltägliche Arbeiten zum Teil nicht mehr möglich werden (MORGAN et al. 2005). Die Schwellung hat weiter zur Folge, dass die Hautqualität verschlechtert wird (MORGAN et al. 2005) und dadurch schlecht heilende Infektionen mit Bakterien und Pilzen möglich werden. In besonders schlimmen, aber seltenen, Fällen kann ein chronisches Lymphödem zu einer Ausbildung des Stewart-Treves-Syndroms (STS) führen. Das STS ist ein aggressives Lymphangiosarkom der oberen Extremitäten (CHUNG et al. 2000). Die Überlebenszeit der Patientinnen nach Diagnose eines STS liegt zwischen nur 8 und 15 Monaten (CHUNG et al. 2000). 15

28 Literaturübersicht Konservative Therapie eines sekundären Lymphödems Die Therapie von sekundären Lymphödemen erfolgt nahezu ausschließlich symptomorientiert. Sie basiert hauptsächlich auf einer Kompression des Ödemgebietes von peripher nach zentral. So werden unter anderem viellagige unelastische Bandagen benutzt, welche um die Gliedmaße gewickelt werden oder es wird eine kontrollierte Kompressionstherapie verfolgt, in der die Größe der Kompressionsstrümpfe nach und nach reduziert wird (WARREN et al. 2007). Auch eine entstauende manuelle Lymphdrainage wird in Verbindung mit Hauthygiene und körperlicher Aktivität durchgeführt (WARREN et al. 2007). Diese Art der Therapie führt zu einer Volumenabnahme der betroffenen Gliedmaße zwischen 40 und 60% (WARREN et al. 2007). Allerdings müssen diese Therapiemaßnahmen ein Leben lang und zum Teil mehrmals pro Woche durchgeführt werden. Dies bedeutet für die Patientinnen einen kaum zu bewältigenden Aufwand Chirurgische Therapie eines sekundären Lymphödems Eine adäquate chirurgische Therapie für das sekundäre Lymphödem fehlt bisher (MEHRARA et al. 2011). Aus dieser Problematik heraus wurden in der Vergangenheit viele unterschiedliche Methoden untersucht. In der Arbeit von MEHRARA et al. (2011) wurde kürzlich eine Übersicht verschiedener chirurgischer Therapieansätze dargestellt. Hier wurden die Methoden in reduktive und physiologische Methoden eingeteilt. Zu den reduktiven Methoden zählen die direkte Exzision und die Liposuktion. Bei der direkten Exzision wird das ödematöse Gewebe großzügig chirurgisch entfernt und eine Verbindung des oberflächlichen Lymphsystems mit dem tiefen geschaffen. Die Ergebnisse sind nicht dokumentiert. Eine Problematik der Wundheilung sowie Infektionen und Schmerzen werden vermutet. Die Liposuktion ist das Absaugen von Fettgewebe. Durch den reduzierten Umfang der betroffenen Gliedmaße empfinden die meisten Patientinnen nach diesem Eingriff zunächst eine Linderung der Symptome. Die Re-Akkumulation von Gewebsflüssigkeit findet jedoch sehr schnell statt. Zu den physiologischen Methoden zählt z.b. der lymphatische Bypass. Beim lymphatischlymphatischen Bypass werden die beschädigten Lymphgefäße mit gesunden Lymphgefäßen einer anderen Körperregion chirurgisch verbunden. Beim lymphatikovenösen Bypass wird ein Lymphgefäß mit einer oberflächlichen Vene verbunden. Die Ergebnisse einer 16

29 Literaturübersicht lymphatischen Bypass-Operation waren bisher sehr unstet und variierten zwischen keiner Verbesserung des Lymphödems bis hin zu einer moderaten Reduktion. Auch eine Flap interposition, also eine Eingliederung eines Gewebssegmentes mit intakter Vaskularisation, wird beschrieben. Es wird hierbei ein Teil eines gesunden, subkutanen Gewebes chirurgisch entfernt und in eine geschädigte Körperregion transplantiert. Diese Prozedur wird aufgrund ihrer schlechten Ergebnisse nur noch sehr selten durchgeführt. Als eine weitere physiologische Methode führen MEHRARA et al. (2011) die Lymphknotentransplantation auf. Die Basis der Lymphknotentransplantation ist das chirurgische Entfernen eines intakten Lymphknotens aus einer gesunden Körperregion und sein anschließendes Verbringen in das geschädigte Areal. Aktueller Bestandteil der Forschung ist die avaskuläre Transplantation von Lymphknotenfragmenten. Bereits am Schaf (TOBBIA et al. 2009), Schwein (PABST u. ROTHKOTTER 1988, ROTHKOTTER u. PABST 1990, BLUM et al. 2010), an der Maus (TAMMELA et al. 2007) und an der Ratte (BLUM et al. 2006, HADAMITZKY et al. 2009, SOMMER et al B) wurde gezeigt, dass diese Methode möglich ist. Neben der alleinigen Transplantation von Lymphknotenfragmenten kam bei HADAMITZKY et al. (2008) die Gabe von Platelet Rich Plasma (PRP) zur Anwendung. PRP ist Plasma mit vielen Blutplättchen, welches durch ein mehrschrittiges Verfahren aus dem Blut gewonnen wurde. Es enthält Wachstumsfaktoren wie transforming growth factor beta, platelet-derived epidermal growth factor und die vaskulär endothelialen Wachstumsfaktoren C und D. Das PRP wurde den Tieren in das Drainagegebiet der Transplantate injiziert. Es konnte ein positiver Effekt auf die Regeneration der transplantierten Lymphknotenfragmente gezeigt werden. In der Praxis gestaltet sich die Herstellung von PRP als sehr aufwendig und könnte im Zusammenhang mit einer klinischen Verwendung nur in bestimmten dafür ausgestatteten medizinischen Stätten durchgeführt werden. Eine andere Methode ist es, direkt einen bei der Lymphangiogenese beteiligten vaskulär endothelialen Wachstumsfaktor zu verwenden. TAMMELA et al. (2001) haben dahingehend Versuche an Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie haben gezeigt, dass sich eine Therapie mit Wachstumsfaktoren positiv auf die Regeneration von Lymphgefäßen auswirkt. Um eine Therapiemöglichkeit für das Lymphödem zu ergründen, muss ein adäquates Tiermodell geschaffen werden, das die Konditionen unter einer Lymphknotenentfernung widerspiegelt und zu einer Ödembildung führt. Die Notwendigkeit eines geeigneten Modells 17

30 Literaturübersicht haben HADAMITZKY et al. (2008) zusammengefasst. Zwar gibt es bereits Modelle für Hunde (CHEN et al. 1989) und Kaninchen (CASLEY-SMITH et al. 1977), sowie Großtiermodelle für Schafe (TOBBIA et al. 2009); ein Tier-Modell für die Ratte fehlte bislang jedoch gänzlich. SOMMER et al. (2012 A) haben nun ihre Erfolge bei der Findung eines solchen Modells veröffentlicht. Auf der Basis dieses Tiermodells wurde die avaskuläre Transplantation autologer Lymphknotenfragmente in Kombination mit der Gabe von VEGF-C durchgeführt (SOMMER et al B). Es erfolgte nach der Entfernung der Lymphknoten aus der rechten Leiste eine Bestrahlung des Gebietes. Anschließend wurde eine avaskuläre Transplantation von autologen Lymphknotenfragmenten aus der linken in die rechte Leiste vorgenommen. Jedes der Tiere erhielt 6,67 µg VEGF-C an den postoperativen Tagen 1, 2 und 5. Ein positiver Effekt der Verwendung von VEGF-C auf die Lymphknotenregeneration und den Wiederanschluss an das Lymphgefäßsystem im Drainagegebiet konnte nachgewiesen werden (SOMMER et al B). 18

31 Literaturübersicht 2.6. Ziel dieser Arbeit Die Durchführbarkeit einer avaskulären autologen Lymphknotentransplantation wurde durch die oben genannten Arbeiten bestätigt. Die Gabe von VEGF-C hat sich dabei als positiv herausgestellt. Parameter, wie Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation der VEGF-C Applikation sind jedoch bislang noch nicht untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, auf der Basis des etablierten Tiermodells von SOMMER et al. (2012 B) ein Applikationsschema mit Fokus auf Dosis, Zeitpunkt und Lokalisation, für VEGF-C zu entwickeln um verbesserte Raten im Bereich der Lymphknotenregeneration, sowie des Wiederanschlusses des Lymphgefäßsystems zu erzielen. Eine erfolgreiche Lymphknotentransplantation würde vor allem der Prävention von sekundären Lymphödemen z.b. nach Brustkrebsbehandlung dienen. 19

32 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1. Allgemeines Alle folgenden Untersuchungen und Versuchstechniken wurden dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Sitz Oldenburg) unter der Antragsnummer /1420 angezeigt und von diesem genehmigt Vorversuch Der Vorversuch wurde mit 7 Ratten durchgeführt. Informationen zu den Tieren, der Haltung, prä- und postoperativen Versorgung sowie der Chirurgie und anschließenden Methode zur Aufbereitung der Proben sowie den Auswertungskriterien können aus den Kapiteln entnommen werden. Die Tiere wurden wie die Kontrollgruppe (Gruppe E) behandelt und bekamen daher kein VEGF-C. Außerdem unterschied sich die Vorversuchsgruppe durch eine achtwöchige Ruhephase von der Kontrollgruppe (4 Wochen Ruhephase) und ihre Proben wurden ausschließlich lichtmikroskopisch untersucht Tiere Für die Versuchsreihen wurden insgesamt 90 junge, erwachsene und gesunde weibliche Lewis Ratten von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Jedes Tier wog im Schnitt 200g und hatte somit ein Alter von 8 bis 12 Wochen erreicht. 20

33 Material und Methoden 3.4. Gruppengröße Die Tiere wurden in 5 Gruppen eingeteilt. Gruppe A bestand aus 10 Tieren und die Gruppen B bis E aus je 20 Tieren. In Gruppe B wurde eine Ratte wegen des andauernden und hochgradigen autoaggressiven Verhaltens nach Verletzung der distalen und medialen Phalanx des 3. Digitus der linken Vorderpfote frühzeitig aus dem Versuch genommen. Sie wurde mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Gruppe B dezimierte sich somit auf 19 Tiere Haltung Die Tiere wurden nach ihrer Ankunft zu fünft in Spezifiziert Pathogen Frei Haltung (SPF-Haltung) im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover untergebracht und mit standardisiertem Total Pathogen Frei Futter (TPF-Futter) und Osmose Filter gereinigtem Wasser ad libitum versorgt. Sie wurden in 4S-Käfigen (Höhe 21cm, Grundfläche 1370 cm 2 ) gehalten. Die Hell-Dunkel-Phasen waren so eingestellt, dass in den Räumen 14 Stunden Helligkeit und 10 Stunden Dunkelheit herrschte. Alle Ratten erhielten vor Versuchsbeginn eine einwöchige Eingewöhnungszeit um den Stress für die Tiergruppen zu minimieren Präoperative Versorgung Am Operationstag wurde jedem Tier mindestens 30 Minuten und maximal 1,5 Stunden vor dem Eingriff eine Dosis von 5mg/kg Carprofen (Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin, Deutschland) subkutan injiziert. Die Tiere wurden vom Operationsgeschehen mit einem Tuch über dem Käfig abgeschirmt und so weit wie möglich vom OP-Tisch entfernt untergebracht. Dies diente dazu möglichst standardisierte Bedingungen für das Einzeltier zu schaffen und Stress und Aufregung möglichst gering zu halten. 21

34 Material und Methoden 3.7. Chirurgie Die Operation erfolgte im Prinzip wie in der Veröffentlichung von SOMMER et al. (2012 B) beschrieben. Alle 89 Ratten wurden zur Narkoseeinleitung in eine mit 4-5%igem Isofluran (Isofluran Baxter, Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) geflutete Kammer verbracht. Nach Rasur der rechten Leisten- und Kniekehlregion wurde die Inhalationsnarkose über eine Maske bei 1,5-2,5%igem Isofluran aufrechterhalten. Das Einzeltier wurde zunächst in Bauchlage gelagert. Anschließend wurde die OP Region in der Kniekehle mit Softasept Spray (Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) desinfiziert. Es folgte ein ca. 1cm kurzer Hautschnitt in der Fossa poplitea und die Freipräparation der Muskulatur. Zwischen den Muskelsträngen wurden die Kniekehllymphknoten, die Lymphonodi poplitei, aufgesucht und stumpf entfernt. Die Entfernung diente dazu, die Möglichkeit einer Übernahme der Drainage durch die Kniekehllymphknoten zu verhindern und zu gewährleisten, dass ausschließlich afferente und damit unfiltrierte Lymphe im Bereich der Transplantation ankommt. Nach Stillung eventueller Blutungen wurde der Hautschnitt subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial (Marlin violett, Catgut GmbH, Markneukirchen, Germany) der Stärke 5-0 verschlossen. Zusätzlich wurden, ebenfalls mit dem resorbierbaren Nahtmaterial der Stärke 5-0, Einzelhautnähte zum Verschluss der Wunde verwendet. Anschließend wurde die Ratte in Rückenlage gelagert und es wurde nach einer Hautdesinfektion mit Softasept Spray ein knapp 1cm kurzer Hautschnitt in der rechten Leistengegend vollzogen. Nach Freipräparation des subkutanen Fettgewebes wurden die Leistenlymphknoten, die Lymphonodi inguinales, aufgesucht und stumpf entfernt. Drei der Lymphknoten wurden von verbleibendem Fettgewebe und Lymphgefäßresten befreit und jeweils einer der Pole wurde entfernt (BLUM et al u. SOMMER et al B). Es folgte eine Modifikation zu der Methode von SOMMER et al. (2012 B) (Kapitel ) chirurgische Modifikationen Nach der Polentfernung, schloss sich nun eine modifizierte Variante zu der von SOMMER et al. (2012 B) verwandten Technik an. Im Gegensatz zu einer einfachen Schlinge aus nicht resorbierbarem Nahtmaterial, auf die die Transplantate aufgefädelt wurden und die an dem subkutanen Fettgewebe befestigt wurde, wurde hier mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial (Prolene, Ethicon GmbH, Norderstedt, Germany) der Stärke 5-0 ein Teil des subkutanen 22

35 Material und Methoden Fettgewebes zunächst nur einmal durchstochen. Anschließend wurden die drei fragmentierten Lymphknoten aufgefädelt, das Fettgewebe erneut durchstochen und das Nahtmaterial somit auf der gegenüberliegenden Seite der Transplantate verknotet. Dies diente dazu, die Transplantate vor mechanischen Einflüssen des Knotens zu schonen. Verschlossen wurde das Transplantationsgebiet subkutan mit resorbierbarem Nahtmaterial und zusätzlichen Hautnähten Operationsabschluss Das Wundareal wurde sowohl in der Kniekehle als auch in der Leiste mit Aluminium Spray (MeproVet, Mepro Dr. Jäger&Bergmann GmbH, Vechta Deutschland) versorgt und die Tiere wachten unter meiner tierärztlichen Beobachtung in einem separaten Käfig mit einer Wärmequelle (Rotlichtlampe) auf. Das Erwachen dauerte je nach Individuum etwa 2-5 Minuten. Im Anschluss an die Operation und nach vollständigem Erwachen (ca. 30 Minuten) aus der Narkose wurden die Tiere wieder in ihre ursprünglichen Gruppen zurückgeführt Postoperative Versorgung An den darauf folgenden 3 Tagen erhielten alle Tiere unabhängig von ihrer Gruppenzugehörigkeit subkutan eine Analgesie (5mg/kg Rimadyl, Pfizer GmbH, Berlin, Deutschland) zur Linderung des postoperativen Schmerzes und es erfolgte eine regelmäßige Visite der Tiere durch mich über die komplette Versuchslaufzeit. 23

36 Material und Methoden 3.9. Die Gruppen Für die Versuchsgruppen wurde VEGF-C (VEGF-C rr, ReliaTech GmbH, Wolfenbüttel, Deutschland) in sterilem Phosphate Buffered Saline (PBS) gelöst. Für eine Ampulle à 100µg VEGF-C wurden 1700µl steriles PBS verwendet. In Gruppe A (n=10) erhielt jedes Tiere eine Dosis von 6,67µg VEGF-C (120µg der VEGF-C/PBS- Lösung) intradermal in die Bauchwand der rechten Körperhälfte in die unmittelbare Nähe des Transplantationsgebietes an den postoperativen Tagen 1, 2 und 3 (Abb.2.). Die Tiere aus Gruppe B (n=19) erhielten die gleiche Dosis VEGF-C und zum gleichen Zeitpunkt wie Gruppe A; einziger Unterschied war die Lokalisation. Die Injektion erfolgte intradermal in die mediale Seite des rechten Oberschenkels (Abb.2.). Den Ratten aus Gruppe C (n=20) wurde die gleiche Dosis VEGF-C an der gleichen Lokalisation wie in Gruppe B intradermal injiziert, doch die Injektion erfolgte zu einem anderen Zeitpunkt, nämlich an den Tagen 14, 15 und 16 post OP (Abb.2.). Die Injektionsparameter Zeitpunkt und Lokalisation in Gruppe D (n=20) waren die gleichen wie in Gruppe B. Die Dosis und damit auch die Injektionsmenge der VEGF-C/PBS-Lösung war in Gruppe D verdoppelt worden. Jedes Tier erhielt in dieser Gruppe eine Dosis von 13,34µg VEGF-C (Abb.2.) und damit ein Injektionsvolumen von 240µl der Lösung. Hinweis: Im Verlauf der Färbeverfahren konnten aus technischen Gründen die Proben eines Tieres aus dieser Gruppe wohl lichtmikroskopisch, jedoch nicht weiter immunhistochemisch untersucht werden. Das Tier wurde in dem immunhistochemischen Teil der Auswertung nicht berücksichtigt, so dass sich hierbei die Anzahl der Gruppe auf n=19 reduzierte. Die Gruppe E (n=20) diente als Kontrollgruppe und wurde neben der, für alle Versuchstiere gleichen, Analgesie-Verabreichung und der regelmäßigen Visite keiner weiteren Intervention unterzogen (Abb.2.). Die Gruppen A-C und die Gruppe E wurden verblindet ausgewertet. Die Verblindung, bei der die Tiere randomisierte Nummern zugeteilt bekamen, diente dazu, möglichst unvoreingenommene Bedingungen für die Auswertung zu schaffen. 24