Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2

Transkript

1 Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2 Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Inst f. unter Helmut Dolznig Inst. F. MedUni Wien Präsentation: Ernst Müllner / Georg Weitzer

2 Der praktische Teil der 2. Übung findet statt am: Zentrum für Pathobiochemie und Währingerstraße 10 Übungssaal I, 1. Stock

3 Enzymatische Methoden Enzymatische Reaktionen Enzym = E Substrat = S Produkt = P Coenzym (Cosubstrat) = CoE E +S ES EP E + P E + S + CoE ES-CoE EP-CoE E + P + CoE Coenzym verändert sich zunächst (CoE à CoE ), wird aber in einer anderen Reaktion wiedergewonnen, daher auch der Name Cosubstrat

4 Enzymatische Reaktionen ein anderes Beispiel E + S 1 + S 2 à S 1 -E-S 2 à E-P à E + P Das aktive Zentrum des Enzyms fixiert die Substrate in einer optimalen Position, um deren Reaktion zu erleichtern.

5 Was Sie wissen sollten: Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren) wird beeinflusst durch ph- Wert (Optimum, aber auch Denaturierung) Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung) Hemmstoffe (in der Medizin: Medikamente!) kompetitive (erhöhen den K m Wert) nicht-kompetitive Anmerkung: bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren ein Agonist (Substrat) und ein Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Antagonist nicht an der Substrat-Bindungsstelle.

6 Enzymatische Reaktionen ph-wert Optimum am Beispiel der Verdauungs-Enzyme Pepsin (im Magen) und Trypsin (im Darm). Typisches Temperatur Optimum der Enzymaktivität bei 37 C Einzelne Enzyme können durchaus davon abweichen.

7 Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion gilt: K m = [E] x [S] [ES] v = v max x [S] [S] + K m K m entspricht der Substrat- Konzentra(on, bei der das Enzym mit der HälGe der maximalen Geschwindigkeit arbeitet. Michaelis-Menten Gleichung Die Reak(onsgeschwindigkeit v einer enzyma(schen Reak(on in Abhängigkeit von der Substratkonzentra(on [S] nach der Michaelis- Menten Gleichung kann auch grafisch dargestellt werden.

8 Graphische Darstellung der Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion v In diesem Bereich: Bestimmung der Substratkonzentration In diesem Bereich: Bestimmung der Enzymmenge v... Umsatzgeschwindigkeit v max... Maximale Reaktionsgeschwindigkeit [S] K m = [S] bei v max / 2 (K m = Michaelis-Menten Konstante) ([S] = Substratkonzentration)... daher K m in mol/l Abbildung aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) es gilt: [E] = [ES]

9 Umwandlung der Kurve höherer Ordnung in eine lineare Funktion durch einen doppelt-reziproken Plot

10 Lineweaver-Burk Diagramm y = k x x + d y = d + k x x 1 / v = 1 / v max + (K m / v max ) x 1 / [S] Geradengleichung k = Steigung Durch Umformung der Michaelis- Menten Gleichung in eine doppelt- reziproke Form kann die Reak(onsgeschwindigkeit einer enzyma(schen Reak(on in einem Lineweaver- Burk Diagramm dargestellt werden. Dies hat vor allem für die Auswertung der Daten Vorteile. k = (1 / v max ) / (1 / K m )

11 Beispiel 1 Kine5sche Untersuchung der Lactatdehydrogenase: Bes5mmung der K m durch Messung der Reak5ons- Geschwindigkeit bei verschiedenen Substrat- Konzentra5onen v modifiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg [S]

12 Was macht die Lactatdehydrogenase? C 2 H 5 OH-COOH + NAD + CH 3 CO-COOH + NADH + H + Lactat COO gemessene Reaktionsrichtung Pyruvat COO Coenzym / Cosubstrat HO C H C O CH 3 CH 3 Diagnose von Herzinfarkt durch die Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen im Blut Kreatinkinase (CK-MB) Laktatdehydrogenase (LDH) LDH in der Leistungs-Diagnostik im Sportbereich

13 Was macht NAD +? Nico(namid- Adenin- Dinucleo(d ist ein Elektronen transpor(erendes Coenzym, das an zahlreichen Redox- Reak(onen des Stoffwechsels beteiligt ist. Dabei kann es reduziert werden und maximal zwei Elektronen (dann geschrieben als NADH) aufnehmen. Hier gezeigt am Beispiel der Umwandlung (Oxida(on) von Ethanol zu Acetaldehyd, durch das Enzym Alkohold- dehydrogenase, ADH.

14

15 Absorptionsspektrum von NAD + und NADH Im Gegensatz zu NAD + zeigt NADH ein starkes Absorptionsmaximum bei 340 nm (langwelliges UV-Licht). Im Zuge der Reaktion von Pyruvat zu Lactat nimmt (durch gleichzeitige Umwandlung von NADH in NAD + ) die Absorption von UV-Licht ab. modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg 340

16 Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität und Darstellung der Ergebnisse in einem Lineweaver-Burk Diagramm LDH spielt vor allem eine Rolle bei einer Nebenreaktion der Glykolyse im Citratzyklus. -1 / K app Durch die Umwandlung von Lactat zurück zu Pyruvat in der Leber (Cori Zyklus) wird NADH produziert, das seinerseits als energielieferndes Co-enzym der Atmungskette zur ATP Bildung beiträgt. Im Praktikum wird hingegen die Umwandlung von Pyruvat in Lactat gemessen, wobei NAD+ gebildet wird.

17 Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] = [Pyruvat] nochmals: gemessen wird die Reaktion in der Richtung vom Pyruvat zum Lactat, wobei NADH in NAD+ umgewandelt wird. zunächst Herstellung einer Verdünnungsreihe Ergänzung, H. Goldenberg

18 Probenvorbereitung alle Volumina in µl Ergänzung, H. Goldenberg Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird die Reaktion gestartet

19 Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität Zusatz von LDH niedrige Pyruvatkonzentration hohe Pyruvatkonzentration modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg k = v für gegebene [S]

20 Lambert-Beersches Gesetz E = ε x c x d E = log (1/T) = log (I 0 /I) E = Extinktion ε = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke T = Transmission I 0 I Lichtquelle Photometer Prisma Detektor Küvette d = 1 cm

21 Photometer

22 Messung der Extinktionsänderung bei jeder Substratkonzentration E = ε x c x d c = E / (ε x d) Δc / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion messen (wie in der Grafik zuvor dargestellt).

23 Arbeitsplatz

24

25 Auswertung der Messdaten durch Umwandlung in ein Lineweaver-Burk Diagramm... Zusatz von LDH Jedes k (Steigung links) entspricht einem Punkt im Diagramm rechts.

26

27 ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, I)

28 ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, II) nicht alles muss immer stimmen...

29 Berechnung der v max Ergänzung, H. Goldenberg Δc(s) / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v

30 Geschafft!

31 Beispiel 2 Bestimmung der LactatdehydrogenaseAKTIVITÄT im Serum bei verschiedenen Enzymmengen v in diesem Bereich (= bei hoher Substrat- Konzentration) arbeitet man zur Bestimmung der Enzymmenge... modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg [S]

32 Beispiel 2... während man eine (relativ) große Enzymmenge einsetzt um Substratkonzentrationen zu bestimmen. v modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg [S]

33

34 Experimentelle Vorbereitungen Ergänzung, H. Goldenberg 1. Lösungen 2 bis 4 mischen 2. LDH Lösung zugeben 3. Abnahme der NADH Konzentration messen

35 Gemessen wird wieder die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von der Enzymmenge Zusatz von LDH k = ΔE / min wenig Enzym viel Enzym modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg Aktivität (U/l) = ΔE / min x Konstante