Inhalt. I. Einleitung. Versuchsprotokoll V 5: Erstellung von Karyogrammen

Transkript

1 Versuchsprotokoll V 5: Erstellung von Karyogrammen Inhalt I. Einleitung II. Material und Methoden III. Ergebnisse IV. Diskussion V. Anhang, Literatur I. Einleitung Versuch 5 behandelte das Thema Karyogramme. Ein Karyogramm ist eine systematische Einteilung bildlich festgehaltener Chromosomen nach bestimmten Kriterien. Es dient dazu, mögliche Mutationen einzelner Chromosmen oder des Genoms zu erkennen und findet zum Beispiel Anwendung in der prä- und postnatalen Diagnostik, sowie in der Tumorzytogenetik. [Belge,2010] Um eine Einteilung zu erleichtern, kann auf verschiedene Färbemethoden zurückgegriffen werden. Krankheiten oder Fehlbildungen in Geweben können auf Veränderungen im Genom zurückzuführen sein. Um die Ursache für Symptome festzustellen wird in der Cytogenetik auf die Erstellung von Karyogrammen zurückgegriffen. Dazu werden aus Blut- oder Fruchtwasserproben entnommene, vorzugsweise in der Metaphase der Mitose befindliche, Chromosomen nach Länge, Lage des Centromers und Bänderung in Gruppen eingeteilt. Beim Menschen werden die 23 Chromosmenpaare in die Gruppen A bis G eingeteilt. Die zwei als Gonosomen bezeichneten Geschlechtschromosomen nehmen dabei gegenüber den 44 Autosomen eine Sonderstellung ein. Das X-Chromosom gehört formal zur Gruppe C, das Y-Chromosom zur Gruppe G. Hier kann also je nach Geschlecht eine Aufteilung des Pärchens stattfinden.die Länge der Chromosomen ist mit zunehmender Gruppe abnehmend. Hinsichtlich der Lage der Centromere kann zwischen vier verschiedenen Typen unterschieden werden: Metazentrisch, submetazentrisch und akrozentrisch. Als Grundlage für diese Klassifizierungen fungiert der Centromer-Index. Dieser stellt das Längenverhältnis des kürzeren parms zum längeren q-arm dar und errechnet sich aus folgender Formel: (p/(p+q))9 100 Als letztes Kriterium für die Einteilung dient die charakteristische Bänderung der Chromosomen. Zu beachten ist hierbei, dass stärker kondensierte Chromosomen weniger Banden zeigen, als weniger stark kondensierte. Üblich ist es, die p-arme in einem Karyogramm nach oben zeigen zu lassen. Als Färbemethode wird meistens auf das sogenannte G-Banding zurückgegriffen. In Folge der Behandlung mit Trypsin und der anschließenden Giemsa-Färbung erhält man das typische Bandenmuster. Trypsin ist eine Protease, die die Proteine aus der DNA entfernt. Da einige Bereiche früher repliziert werden als andere, liegen sie in weniger dicht gepackter Form vor und erleichtern es dem Enzym, die Proteine zu entfernen. Die Giemsa-Färbelösung bindet an DNA und Proteine. Eine Behandlung mit Trypsin (Verdauungsenzym) löst und zerstört Proteinstrukturen, die sich an der DNA befinden.aufgrund der unterschiedlichen Konzentrationen von Proteinen in den

2 verschiedenen DNA Bereichen,entstehen neben der verschiedenen Packungsdichte, durch die Lücken der entfernten Proteine durch Trypsin die sichtbaren Bandenmuster. [Munk, 2010] helle G-Banden dunkle G-Banden früh replizierend spät replizierend reich an transkribierten Genen arm an transkribierten Genen reich an konstitutiv exprimierten Genen und vielen gewebsspezifischen Genen meist gewebsspezifische Gene GC-reich AT-reich entsprechen den Interchromomeren entsprechen den Chromomeren Tabelle 1: Klassifizierung der Bandenformen [übernommen aus Munk, 2010] Nachdem nun also die Chromosomen in das Karyogramm eingeteilt wurden, lässt sich eine Karyotypformel erstellen. Diese sieht für gewöhnlich beim Menschen so aus: 46,XX oder 46,XY. Die Zahl vor dem Komma gibt Auskunft über die Gesamtzahl der Chromosomen. Hinter dem Komma ist die Kombination der Gonosomen angegeben. Die männliche Karyotypformel hat hier ein XY, die weibliche ein XX. Aber auch hier gibt es Variationen mit diversen Konsequenzen. Nachfolgend eine Tabelle mit einigen Variationen in der Gonosomen Anzahl und/ oder Kombination. Eine verminderte Chromosomenanzahl wird als Hypoploidie, eine erhöhte als Hyperploidie bezeichnet. Liegen zwei oder mehrere identische Gonosomen vor, so spricht man von Homomorphie. Ist dies nicht der Fall, so von Heteromorphie. [Munk, 2010] Gonosomenanzahl X Konsequenz XX XXX- XXXXX Turner-Syndrom Normaler weiblicher Chromosomensatz unauffällig Tabelle 2: Abweichungen in der Anzahl der Geschlechtschromosomen bei einer Frau [nach Belge, 2010] Gonosomenanzahl Y/YY XY XYY XXYXXXXY Konsequenz Letal Normaler Männlich Klinefeltermännlicher Syndrom Chromosomensatz XXYY/XXXYY/XXXXY Y Klinefelter-Syndrom Tabelle 3: Abweichung in der Anzahl der Geschlechtschromosomen bei einem Mann und deren Konsequenzen [nach Belge, 2010] Das Turner-Syndrom zeichnet sich durch ein fehlendes X-Chromosom aus. Phänotypisch äußert sich dies in Form von Minderwuchs, sowie der Ausbildung funktionsloser Ovarien. Die Karyotypformel ist 45,X0. [Munk, 2010] Im Gegensatz zum weiblichen Karyotyp ist ein fehlendes X-Chromosom bzw. ein überzähliges YChromosom im männlichen Karyotyp tödlich. [Belge, 2010] Das Klinefelter-Syndrom äußert sich in auffälligem Hochwuchs und der reduzierten Ausbildung sekundärer Geschlechtsmerkmale. Das Vorhandensein von zu vielen Y-Chromosomen bei Männern, sowie zu vielen X-Chromosomen bei Frauen hat normalerweise keine Auswirkungen. [Munk, 2010] Neben den Mutationen in der Gonosomenzusammensetzung kann es auch zu Veränderungen in der

3 Anzahl der Autosomen kommen. Das bekannteste Beispiel hierfür ist Trisomie 21, bzw. das DownSyndrom. Bei dieser Anomalie liegt das 21. Chromosom in dreifacher Ausführung vor. Folglich ist die Karyotypformel: 47,XX +21. Ursache hierfür kann beispielsweise eine non-disjunction während der ersten Reifeteilung der Meiose sein, oder eine Nichttrennung der Chromatiden während der zweiten Teilung. Phänotypische Auswirkungen sind neben den äußerlich sichtbaren Anzeichen, wie zum Beispiel der Form der Augen oder der Vierfingerfurche, eine ungewöhnliche Ausprägung kognitiver Eigenschaften.Durch das dreifache Auftreten des Chromosoms ist nur eine symptomatische Behandlung möglich, das Beseitigen der Folgen dieses Defekts ist bis heute nicht möglich. [ Neben Mutationen die ganze Chromosomen betreffen kann es auch zu Veränderungen innerhalb einzelner Chromosomen kommen. Mögliche Formen sind Deletionen einzelner Basen, Insertionen, Duplikationen, Inversionen oder Translokationen. Hier soll jetzt nur auf die letztgenannte weiter eingegangen werden, da diese für den Versuch am wichtigsten ist. Translokation beschreibt eine Versetzung eines Abschnittes von einem Chromosom auf ein anderes. Dies kann sowohl innerhalb eines homologen Chromosomen Paares, als auch außerhalb dessen passieren. Von einer reziproken Translokation spricht man, wenn ein gegenseitiger Austausch zwischen zwei Chromosomen stattfindet. Um eine genaue Angabe der Mutationen machen zu können, wird eine andere Art der Karyotypformel angewandt. Diese sieht wie folgt aus: ChromosomArmRegionBand Ein Beispiel für eine solche Ortsangabe könnte sein: 7q33= Chromosom7, langer q-arm, Region 3, Band 3 [Munk, 2010]. Allerdings bezieht sich diese nur auf eine Mutation innerhalb eines einzelnen Chromosoms. Um eine Translokationsangabe zu machen, wird die Formel etwas erweitert. Ein Beispiel für ein Lipom: 46,XX,t(3;12)(q28;q14). Es liegt also ein normaler Chromosomensatz vor, mit der Besonderheit, dass Bande q28 des Chromosoms 3 den Platz mit Bande q14 von Nummer 12 getauscht hat. Im Falle eines Lipoms, also eines gutartigen Fetttumors, ist das nicht weiter tragisch, da diese höchstens ein kosmetisches Problem darstellen. Allerdings könnte eine solche Translokation zwischen anderen Chromosomen auch Leukämien oder andere Krebsarten verursachen. Im Karyogramm ist eine solche Mutation anhand der veränderten Längen von Chromatiden zu erkennen wenn ein großes Stück gegen ein kleines ausgetauscht wurde. An diesem Kurstag sollten Karyogramme mit folgenden Eigenschaften erstellt werden: - weiblicher Karyotyp - Down-Syndrom (Trisomie 21) - Klinefelter-Syndrom - Translokation aus einer Lipom-Zelllinie II. Material und Methoden: Materialien: Klebefolie Kopien der jeweiligen Chromosomen-Aufnahme Schere Es wurden drei Kopien der jeweiligen Chromosomenaufnahme bereitgestellt. Zunächst wurden die Chromosomen auf Kopie 1 gezählt und zur Verdeutlichung der Centromer Lage mit Punkten versehen. Anschließend wurden diese aus Kopie 2 ausgeschnitten, die überlagerten aus Kopie 3.Die ausgeschnittenen Chromosomen sollten anhand der Größe und mithilfe eines Musters zurechtgelegt werden. Danach wurde Klebefolie zur Befestigung angebracht. Die Aufgabe war, ein komplettes Karyogramm zu erstellen und dieses auf Abweichungen und Mutationen zu untersuchen.

4 III. Ergebnisse: Die fertigen Karyogramme sahen wie folgt aus: Abbildung 1: Karyotyp mit 44 Autosomen und 2 regulären, weiblichen Gonosomen (XX) Abbildung2: Karyotyp mit 47 Chromosomen, davon 45 Autosomen und zwei Gonosomen (XX). Das 21. Chromosom liegt dreifach vor.

5 Abbildung 3: Karyotyp mit 46 Chromosomen (44 Autosomen, 2 Gonosomen), mit Unregelmäßigkeiten an den Chromosomen 3 und 12. Chromosom ist deutlich verlängert, 12 verkürzt. Sehr gut erkennbar sind die unterschiedlichen Erscheinungsformen der Chromosomen, die bei allen Karyogrammen ähnlich oder gleich sind. Die Gruppeneinteilung der Chromosomen erfolgt nach Größe. Außerdem ist die Bänderung, sowie die Lage des Contromers beim jeweiligen Chromosom gleich. Zum Beispiel sind die Chromosomen Eins und Zwei die Größten, während 21 und 22 die Kleinsten sind. Neben der Größe sind auch Unterschiede in der Strukur erkennbar. Die ersten drei Chromosmen sind metazentrisch, während die kleinen Chromosomen der letzten beiden Gruppen akozentrisch sind. Durch die individuelle Struktur jedes Chromosoms sind direkte Vergleiche zwischen den Karyogrammen gut möglich, da jedes Chromosom klar zu identifizieren ist. IV. Diskussion: Abbildung 1 zeigte eine normale Anzahl Chromosomen. Zwei der 46 Chromosomen sind Gonosomen des Typs X. Folglich handelt es sich um ein normales Karyogramm einer weiblichen Person. Abbildung 2 zeigt das Karyogramm einer weiblichen Person mit Trisomie 21. Zu erkennen ist dies an der dreifachen Ausführung des 21. Chromosoms. Eine Trisomie kann, wie in der Einleitung beschrieben, unter anderem durch ein Ausbleiben der Chromatiden Trennung während der zweiten meiotischen Teilung entstehen. Die Folgen der Trisomie 21, bzw. des Down-Syndroms, sind phänotypisch sichtbar. Das Krankheitsbild äußert sich durch Kleinwüchsigkeit, einer veränderten Form der Augen und einer ungewöhnlichen Ausprägung kognitiver Funktionen. Das dritte Karyogramm weißt Translokationen an den Chromosomen 3 und 12 auf. Hierbei ist die Bande q28 des dritten Chromosoms mit der Bande q14 des zwölften Chromsoms vertauscht. Diese Translokation der Banden ist typisch für ein Lipom, einen gutartigen Fetttumor. Wie in der Einleitung dargestellt, verursachen Lipome in der Regel nur kosmetische Probleme, eine gesundheitliche Einschränkung ist daher auszuschließen.[munk, 2010] Da Tumor-Gewebe sehr teilungsaktiv ist, sind Mutationen in solchem Gewebe relativ häufig, beeinflussen das Genom des Organismus aber nicht. Das letzte Karyogramm wies einen Chromosomensatz mit 47 Chromosomen auf. Die Formel betrug

6 47, XXY. Demnach ist der Proband männlich, besitzt aber ein weiteres X-Chromosom. Diese Anomalie ist als Klinefelter-Syndrom bekannt. Das Syndrom äußert sich in Form von hohem Wuchs, langen Gliedmaßen und einer reduzierten Ausprägung der Geschlechtsmerkmale. V.Literatur BELGE et al. (2010): Praktikum Genetik WS 2010/2011, Universität Bremen MUNK (Hrsg) (2010): Genetik, 1. Auflage, Thieme, Stuttgart Stand: , 0:30