Enzymkinetik. PTV.6 Seite 1 von 12 Prof. Dr. M. Brunner M.Eng. Philip Schmit. Praktikum PT. 1 Einleitung. 2 Theoretische Grundlagen

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1 Seite 1 von 12 Praktikumsvorbereitung 1 Einleitung Die Tatsache, dass man sich abends ein paar Bier genehmigen kann und diese am nächsten Morgen im eigenen Blutkreislauf noch kaum, bzw. nicht mehr nachweisbar sind, dafür jedoch sich unter Umständen starke Kopfschmerzen bemerkbar machen, ist einem ganz bestimmten Stoff im Körper zu verdanken: Der Alkoholdehydrogenase. Sie gehört zu den Enzymen, welche im Laufe dieser Versuchsreihe behandelt werden sollen. Allgemein wirken Enzyme als biochemische Katalysatoren, sie die Aktivierungsenergie herabsetzen. Speziell die Alkoholdehydrogenase ist entscheidend für den Abbau von Alkohol in unserem Körper, wobei das Produkt Acetaldehyd, welches in Folge dieses Abbaus entsteht, Kopfschmerzen verursacht, sie kann aber auch im Gegensatz hierzu Alkohol aufbauen, was beispielsweise bei der alkoholischen Gärung durch Hefe der Fall ist. Enzyme sind in unserem Körper für viele biochemische Reaktionen notwendig. Sie ermöglichen eine gewisse Einflussnahme auf die Reaktionsabläufe, insbesondere auf deren Geschwindigkeit. Diese Form der Einflussnahme soll in dieser Versuchsreihe untersucht werden. 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Allgemeine Eigenschaften der Enzyme Enzyme sind Proteine, die als Katalysatoren biologischer Reaktionen fungieren. Ohne ihre Anwesenheit würden die meisten, biochemischen Reaktionen unendlich langsam ablaufen, da die Aktivierungsenergie, die zu Beginn einer jeden Reaktion überwunden werden muss, zu hoch ist. Enzyme verändern also die Reaktionsgeschwindigkeit, indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen, haben jedoch keinen Einfluss auf die Lage des Reaktionsgleichgewichts. Enzyme beschleunigen also die Einstellung des Gleichgewichts zwischen Edukt (Substrat) und Produkt. [1] [2] Enzyme sind hochspezifisch, d.h. sie katalysieren nur eine einzige Reaktion (mit Ausnahme von wenigen Enzymen, die eine Klasse eng verwandter Reaktionen katalysieren), was sich durch ihre genaue dreidimensionale Struktur begründet. Sie sind, wie oben beschrieben, Proteine mit einem sog. aktiven Zentrum, welches auch Nichtproteinbestandteile, die prosthetischen Gruppen, enthalten kann. Diese Gruppen sind verantwortlich für die chemischen Eigenschaften des aktiven Zentrums, die durch Proteinseitenketten allein nicht ermöglicht werden können. Hier findet man oftmals Metallionen, wie z.b. Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, und Coenzymen (organische Verbindungen, meist aus Vitaminen gebildet). [1] Zu Beginn einer von einem Enzym katalysierten Reaktion wird der sog. Enzym-Substrat-Komplex gebildet, indem sich das Substrat an das aktive Zentrum des Enzyms aufgrund nichtkovalenter Kräfte bindet.

2 Seite 2 von 12 Die Struktur des aktiven Zentrums ist der des Substrats komplementär (Schlüssel-Schloss-Prinzip). Durch das Wechselwirken von aktivem Zentrum und Substrat wandelt sich der Enzym-Substrat- in einen Enzym-Produkt-Komplex um, indem durch eine chemische Reaktion das Substrat zum Produkt wird. Ist dieser Umwandlungsprozess abgeschlossen, löst sich das Produkt vom aktiven Zentrum und das Enzym ist frei für das nächste Substrat. Die Dauer dieser Reaktion beträgt wenige Millisekunden. Während der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes kommt es sowohl beim Enzym als auch beim Substrat zu Veränderungen. Die Veränderungen des Enzyms werden induzierte Anpassung genannt. Erst nach der induzierten Anpassung wird das Enzym katalytisch wirksam. [1] Es werden sechs verschiedene Typen von Enzymreaktionen unterschieden: 1) Oxido-Reduktasen: Sie katalysieren Oxidations- und Reduktionsvorgänge. Bsp.: Lactat-Dehydrogenase 2) Transferasen: Sie übertragen eine Gruppe von Substrat 1 auf Substrat 2. Bsp.: Transaminase 3) Hydrolasen: Sie spalten Bindungen hydrolytisch, also durch Reaktion mit Wasser. Hierzu gehören Esterasen, Glykosidasen, Peptidasen und Proteasen. Bsp.: Amylase 4) Lyasen: Sie lagern Gruppen an Doppelbindungen an oder entfernen sie unter Bildung von Doppelbindungen aus ihren Substraten. Bsp.: Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase 5) Isomerasen: Sie katalysieren die Isomerisierungs-Reaktion (Umwandlung von Verbindungen in eine Isomer-Struktur, d.h. die Summenformel bleibt unverändert, die räumliche Anordnung der Atome verändert sich jedoch). Bsp.: Triosephosphat-Isomerase 6) Ligasen: Sie katalysieren die Bildung von Bindungen unter gleichzeitiger Spaltung von ATP. Bsp.: Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen Der Enzymname setzt sich folgendermaßen zusammen: Substrat(e)/Reaktionstyp/Endsilbe-ase Bsp.: ADH: Alkoholdehydrogenase Substrat: Alkohol Reaktionstyp: Oxidation durch Abspaltung von Wasserstoff [1] [3] 2.2 Enzyme sind in ihrer Aktivität abhängig von ihrer Umgebung, der ph-wert, und die Temperatur spielen hierbei eine wesentliche Rolle. Außerdem stellen die Enzym- und Substratkonzentration, sowie die Kon-

3 Seite 3 von 12 zentration von anwesenden Hemmstoffen, bzw. Aktivatoren wichtige Faktoren dar. [1] Es gibt verschiedene Möglichkeiten, eine Aussage über die Aktivität eines Enzyms zu treffen. Hierzu werden die drei folgenden Begriffe definiert: Enzymaktivität: 1 = ä ( bei 25 C und definierten, wenn möglich optimalen Reaktionsbedingungen) Spezifische Aktivität: 1 (ein Maß für die Reinheit eines Enzympräparats) ä Molekulare Aktivität (Wechselzahl): 1 ( ) Die molekulare Aktivität gibt an, wie viele Male pro Minute ein Enzymmolekül den katalytischen Zyklus durchläuft; für die meisten Enzyme liegt sie im Bereich von min -1. (Biochemie, Christen Jaussi)[1] Die Thematik der wird im weiteren Verlauf unter Berücksichtigung folgender Annahmen behandelt: 1) Anfangsgeschwindigkeit = v 0 2) Substratkonzentration = c S Enzymkonzentration = c E c S >>c E 3) Bei den betrachteten Reaktionen handelt es sich nur um Einsubstratreaktionen. Die betrachtet immer nur die Anfangsgeschwindigkeit, da Geschwindigkeiten nur bei konstanter Substratkonzentration bestimmt werden können und diese im Laufe der Messung abnimmt. Dies lässt sich zu einem mit der Veränderung der Gleichgewichtslage und zum anderen mithilfe der Produkthemmung begründen. [4] Auch für enzymatische Reaktionen gilt bis zu einer gewissen Temperatur die Reaktionsgeschwindigkeits-Temperatur-Regel (kurz: RGT-Regel), die besagt, dass eine Temperaturerhöhung von 10 C eine Verdopplung der Reaktionsgeschwindigkeit zur Folge hat. Ab einer gewissen Temperatur kommt es jedoch zur Denaturierung der Enzyme, wodurch die RGT-Regel nicht mehr eingehalten werden kann. Zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration besteht ein linearer Zusammenhang, dessen Anfangswert im Ursprung liegt und dessen Steigung positiv ist. Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration kann mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung dargestellt werden: =! " # +! mit =%&'()&*+,-!h/(01(+2,(3 und " # =%(!h&,*(-240-3&03, Diese Gleichung beschreibt folgende Hyperbel:

4 Seite 4 von 12 Abbildung 1: Diagramm zur Michaelis-Menten-Gleichung, Quelle: Gibt es kein freies Enzym mehr, d.h. liegen alle Enzyme als Enzym-Substrat-Komplexe vor, dann ist die Maximalgeschwindigkeit erreicht. Die Michaeliskonstante entspricht der Substratkonzentration, bei welcher die halbe Maximalgeschwindigkeit erreicht wird. Ihr Kehrwert ist ein Maß für die Affinität des Enzyms (das Bestreben eine Bindung einzugehen) zu einem bestimmten Substrat. Sie liegt im Bereich von 0,01 1mM. Der Zusammenhang zwischen der Substratkonzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit kann aber auch alternativ mithilfe der Lineweaver-Burk-Gleichung, welche dem Kehrwert der Michaelis-Menten- Gleichung entspricht, dargestellt werden. Hier wird deutlich, dass ein linearer Zusammenhang zwischen dem Kehrwert der Geschwindigkeit und dem Kehrwert der Substratkonzentration besteht: 1 = 1 + " # 1! =9:1(0&3,0&;-!h0(33 <01 = >? =@<**-3,**, [1]

5 Seite 5 von 12 Abbildung 2: Diagramm zur Lineweaver-Burk-Gleichung, Quelle: ineweav_burk.vcsml.html, Aktivatoren und Inhibitoren Stoffe, die Einfluss auf die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion haben und weder Substrat noch Produkt sind, werden Aktivatoren, bzw. Inhibitoren genannt. Die Anwesenheit von Enzymaktivatoren hat eine beschleunigende Wirkung auf die Reaktionsgeschwindigkeit, die Anwesenheit von Inhibitoren hemmt diese. Diese beiden Möglichkeiten zur Einflussnahme auf die Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen sind sehr bedeutsam zur Regulierung des Stoffwechsels. Bisher sind sehr viel mehr Inhibitoren als Aktivatoren bekannt. Es wird zwischen reversiblen und irreversiblen Inhibitoren unterschieden. Im Falle der irreversiblen Hemmung bindet sich der Inhibitor dauerhaft an das Enzym und zerstört so dessen Funktion. Im Rahmen der reversiblen Inhibitoren wird wiederum zwischen verschiedenen Hemmtypen unterschieden, wobei hier auf drei eingegangen werden soll: 1) Die kompetitive Hemmung: Hier dockt der Inhibitor an das aktive Zentrum des Enzyms an und verhindert so die Entstehung eines Enzym-Substrat-Komplexes. Allerdings ist es möglich, durch Erhöhung der Substratkonzentration den Inhibitor vom aktiven Zentrum zu verdrängen. Dies bedeutet, dass bei hinreichend hoher Substratkonzentration trotz Anwesenheit eines Inhibitors die Maximalgeschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion erreicht werden kann. Bei Aufnahme einer Messkurve nach Lineweaver und Burk würde sich eine neue, die sog. apparente, bzw. scheinbare Michaeliskonstante " #,BB ergeben, wobei die Maximalgeschwindigkeit dieselbe bliebe. Es gilt folgender Zusammenhang: " #,BB =C1+! D " D E " #

6 Seite 6 von 12! D stellt hierbei die molare Konzentration des Inhibitors dar und " D ist die sog. Inhibitor- Konstante, welche die Affinität zwischen Enzym und Inhibitor beschreibt. Sie entspricht der Inhibitorkonzentration, bei welcher " #,BB =2" #. D.h. wenn " #,BB =2" #, dann gilt " D =! D. [5] 2) Die unkompetitive Hemmung: Bei dieser Art von Hemmung dockt der Inhibitor nicht an das freie Enzym an, sondern an den Enzym-Substrat-Komplex, sodass ein Enzym-Substrat-Inhibitor- Komplex entsteht. Dies verlangsamt oder verhindert vollständig die Umwandlung zum Enzym- Produkt-Komplex. Bei Auftragung nach Lineweaver und Burk ist festzustellen, dass sich in diesem Fall die Gerade parallel zur Geraden der ungehemmten Reaktion nach oben verschiebt, d.h. es stellen sich sowohl eine apparente Maximalgeschwindigkeit, als auch eine apparente Michaeliskonstante ein, die sich in gleichem Maße verändern. Es gelten folgende Zusammenhänge:,BB = G H und " I #,BB = >? G H [5] I J I J I 3) Die nichtkompetitive Hemmung: In diesem Fall dockt der Inhibitor nicht an das aktive Zentrum des Enzyms an, sondern an einer anderen Stelle, wodurch die Aktivität des Enzyms teilweise oder sogar vollständig gehemmt wird. Dies hat zur Folge, dass auch trotz Erhöhung der Substratkonzentration die Maximalgeschwindigkeit nicht erreicht werden kann. Bei einer Auftragung nach Lineweaver und Burk würde sich daher eine neue, die sog. apparente, bzw. scheinbare Maximalgeschwindigkeit #,BB einstellen, wobei die Michaeliskonstante dieselbe bliebe. Es gilt folgender Zusammenhang:,BB = 1+ K I > I In diesem Fall stellt " D die Inhibitorkonzentration dar, bei welcher,bb = L. [5] Abbildung 3: Diagramme zu Lineweaver-Burk in Abhängigkeit verschiedener Inhibitortypen, Quelle:

7 Seite 7 von Für den Versuch relevante theoretische Grundlagen In dem hier betrachteten Versuch wird das Enzym Lactatdehydrogenase (LDH) verwendet. Es spielt eine wichtige Rolle im anaeroben Stoffwechsel, in welchem es als Biokatalysator bei der Reduktion von Pyruvat zu Lactat fungiert. Dieser Prozess wird auch Milchsäuregärung genannt und findet oftmals bei Überlastung, z.b. von Muskelzellen statt. Diese Reaktion dient zur Gewinnung von NAD + und ist reversibel, d.h. mithilfe von LDH kann das während der anaeroben Verbrennung gebildete Lactat (z.b. bei Muskelkontraktion) wieder zu Pyruvat umgewandelt werden. Abbildung 4: Gleichung zur durch LDH katalysierten Reaktion, Quelle: www2.chemie.uni-erlangen.de/projects/vsc/chemiemediziner-neu/enzyme/ldh.html Zur Messung der Reaktionsgeschwindigkeit wird das photometrische Verfahren verwendet, wobei man sich hier den Unterschied der Absorptionsmaxima von NAD + und NADH zu Nutze macht. [5] Die Messung wird mithilfe eines Fotometers durchgeführt, welches folgendermaßen aufgebaut ist: Abbildung 5: Prinzipieller Aufbau eines Fotometers, Quelle: Der von der Lichtquelle ausgehende Strahl wird von der Blende gebündelt und durch die Küvette, die die Stoffprobe enthält, geleitet. Der Stoff ist jedoch nur für ein Teil des Lichtes durchlässig, welcher vom Fotodetektor registriert wird. Diesen Anteil nennt man Transmission. Der Anteil, der von der Probe absorbiert wird, nennt man Extinktion. Im Laufe der Versuchsreihe wird diese erfasst.

8 Seite 8 von 12 Die Berechnung der Konzentration erfolgt über das Lambert-Beer sche Gesetz, welches folgendermaßen definiert ist: M =N!(@OPQ) 1 Mit : E = Extinktion Ɛ = Extinktionskoeffizient c(nadh) = Konzentration NADH d = Küvettendicke Der Extinktionskoeffizient, sowie die Küvettendicke werden in der Versuchsanleitung angegeben.

9 Seite 9 von 12 3 Chemikalien ml Natrium-Phosphat-Puffer (Konzentration 0,1 und ph-wert 7,4) - 10 ml NADH (Konzentration 5 ) - 10 ml Na-Pyruvat (Konzentration 10 ) - 10 ml Oxamat (Konzentration 1 ) wird erst in der zweiten Versuchsreihe benötigt - Destilliertes Wasser - 10 ml LDH (Konzentration wird vom Betreuer angegeben und ist zu notieren) Die Enzymaktivität beträgt 290. Alle Lösungen sind, falls nicht vorhanden, anzusetzen. Es ist zu beachten, dass das Enzym LDH stets kühl gelagert wird. Hierzu steht eine Kühlbox mit Eis zur Verfügung. 4 Aufgaben und Versuchsdurchführung 4.1 Versuch 1: Untersuchung der Enzymaktivität In diesem Versuch untersuchen Sie die Enzymaktivität in Abhängigkeit der Substratkonzentration. Hierzu sind folgende Lösungen anzusetzen: Messung 1 Messung 2 Messung 3 Messung 4 Messung 5 Na-Phosphat-Puffer 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml NADH 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Na-Pyruvat 0,067 ml 0,167 ml 0,333 ml 0,667 ml 1,334 ml Destilliertes Wasser 2,70 ml 2,60 ml 2,434 ml 2,10 ml 1,433 ml Jeder Lösung sind jeweils 1 ml zu entnehmen und in eine Küvette zu pipettieren. Von dieser Probe ist nun mithilfe des Fotometers die Extinktion bei einer Wellenlänge von λ= 366 nm zu messen und zu notieren. Diese Messung soll zur Überprüfung nach 30 Sekunden wiederholt werden. Nun werden der Küvette 6,67 μl der LDH hinzugegeben und die Lösung wird mithilfe einer Pipette durchmischt. Dieses ist zuvor mit Wasser zu üben. Anschließend wird über einen Zeitraum von 10 Minuten die Extinktionminütlich gemessen und in die dafür vorgesehene Tabelle im Anhang notiert. Hierbei ist zu beachten, dass das Hinzugeben der LDH schnell erfolgt, damit die Messung unverzüglich erfolgen kann. Die LDH-Lösung ist nach jeder Verwendung wieder kühl zu lagern. Diese Vorgehensweise soll mit allen fünf Lösungen durchgeführt werden. Ziel des Versuchs:

10 Seite 10 von 12 Konstruieren Sie mithilfe Ihrer Messwerte sowohl die Michaelis-Menten-Kurve, als auch das Diagramm nach Lineweaver und Burk und berechnen Sie die Michaeliskonstante K m, sowie die Maximalgeschwindigkeit v max. Machen Sie sich hierzu klar, wie die Reaktionsgeschwindigkeit definiert ist und welcher Zusammenhang zwischen dieser und der Extinktion besteht. Überlegen Sie sich, wie Sie mithilfe Ihrer Messwerte die Anfangsgeschwindigkeiten der Reaktion erhalten. 4.2 Versuch 2: Untersuchung der Wirkung eines Inhibitors auf die Enzymaktivität Diese Messreihe dient zur Untersuchung des Inhibitors Oxamat und seinen Einfluss auf die Enzymaktivität. Hierzu sind folgende Lösungen anzusetzen: Messung 1 Messung 2 Messung 3 Messung 4 Messung 5 Na-Phosphat-Puffer 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml 6,67 ml NADH 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Na-Pyruvat 0,067 ml 0,167 ml 0,333 ml 0,667 ml 1,334 ml Oxamat 0,8 ml 0,8 ml 0,8 ml 0,8 ml 0,8 ml Destilliertes Wasser 1,9 ml 1,8 ml 1,634 ml 1,3 ml 0,633 ml Es wird nun weiter wie in der ersten Versuchsreihe verfahren. Ziel des Versuchs: Bestimmen Sie die Art des Inhibitors, indem Sie die Michaelis-Menten-Kurve, sowie das Diagramm nach Lineweaver und Burk konstruieren. Gehen Sie hierzu wie in Versuch 1 vor. Vergleichen Sie die beiden Messreihen miteinander. Welche Wirkung hat die Anwesenheit des Inhibitors? Machen Sie sich vor Versuchsdurchführung Gedanken darüber, wie Sie die geforderten Aufgaben bewältigen, damit Sie mögliche Rückfragen stellen und die Qualität Ihrer Messwerte grob beurteilen können.

11 5 Quellen Seite 11 von Literaturverzeichnis [1]: Christen/Jaussi: Biochemie, Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten. Berlin 2005, S [2]: Madigan/Martinko/Parker, Brock Mikrobiologie. Berlin 2000 [3]: [4]: 1.pdf, [5]: [6]: Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Diagramm zur Michaelis-Menten-Gleichung, Quelle: Abbildung 2: Diagramm zur Lineweaver-Burk-Gleichung, Quelle: /8/bc/kinetik/lineweaver_burk.vcsml.html, Abbildung 3: Diagramme zu Lineweaver-Burk in Abhängigkeit verschiedener Inhibitortypen, Quelle: Abbildung 4: Gleichung zur durch LDH katalysierten Reaktion, Quelle: www2.chemie.unierlangen.de/projects/vsc/chemie-mediziner-neu/enzyme/ldh.html, Abbildung 5: Prinzipieller Aufbau eines Fotometers, Quelle:

12 Seite 12 von 12 Anhang Versuchsreihe 1 Zeit Messung 1 Messung 2 Messung 3 Messung 4 Messung 5 0 s 30 s 0 s 15 s 30 s 45 s 60 s 75 s 90 s 105 s 120 s 135 s 150 s Versuchsreihe 2 Zeit Messung 1 Messung 2 Messung 3 Messung 4 Messung 5 0 s 30 s 0 s 15 s 30 s 45 s 60 s 75 s 90 s 105 s 120 s 135 s 150 s