Reinigung und Charakterisierung der Cynarosid-7-0-ß-D-Glucosidase aus der Arzneidroge Cynarae foiium und Cynara scolymus L.

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1 WS? Reinigung und Charakterisierung der Cynarosid-7-0-ß-D-Glucosidase aus der Arzneidroge Cynarae foiium und Cynara scolymus L. Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nümberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Birgit Nüßlein aus Scheßlitz

2 Einleitung 1 Allgemeines 1 Cynara scolymus L.: Systematik, Botanik, Verbreitung und Anbau 2 Inhaltsstoffe 4 Caffeoylchinasäuren 4 Flavonoide 6 Sesquiterpenlactone 7 Sonstige Inhaltsstoffe 9 Pharmakologie und Toxikologie 10 Anti-dyspeptische und choleretische Wirkungen 10 Lipidsenkende und anti-atherosklerotische Wirkungen 12 Hepatoprotektive, anti-oxidative und anti-inflammatorische Wirkungen 14 Verträglichkeit und Nebenwirkungen 15 Enzyme in Drogen 15 0-Glucosidasen des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels 17 Problemstellung 19 B Ergebnisse 20 1 Abbau endogener Flavonoide und Kaffeesäure-Derivate in Cynarae foiium 20 2 Enzym-Aktivitäten in Protein-Rohextrakten aus Cynara scolymus L Vorversuche mit der Droge Cynarae foiium Enzymatisches Profil eines Proteinextraktes aus Cynarae foiium Glucosidase-Aktivität in Drogenmustern verschiedener Hersteller Charakterisierung der /3-Glucosidase-Aktivität im Rohextrakt aus Cynarae foiium Reaktionskinetik Bestimmung des Temperatur-Optimums Bestimmung des idealen Puffersystems Einfluss von Protease-Inhibitoren im Rohextrakt aus Cynarae foiium 24

3 2.2 Enzymaktivität in frischen und getrockneten Blättern von Cynara scolymus L Einfluss unterschiedlicher Trocknungstemperaturen Enzymaktivität in frischem und getrocknetem Blattmaterial von Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Polyphenol-Oxidase-Aktivität im Protein-Rohextrakt Extrahierbarkeit der 0-Glucosidase- Aktivität bei unterschiedlichen ph-werten Stabilität der /3-Glucosidase-Aktivität im Rohextrakt Stabilität der (3-Glucosidase-Aktivität im Rohextrakt bei 4 C Stabilität der /S-Glucosidase-Aktivität im Rohextrakt aus frischen Blättern von Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' bei 37 C 31 3 C7G aus Cynarae foiium Reinigung der C7G aus Cynarae foiium Fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung Säulenchromatographische Reinigung Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6 FF Anionenaustausch-Chromatographie an Source 30Q Gelfiltration an Superdex 200 pg Reinigungsbilanz Alternative Reinigungsschritte Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR Anionenaustausch-Chromatographie an Resource Q Molekulare Eigenschaften der C7G aus Cynarae foiium Chromatofokussierung an Mono P SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen Kohlenhydratanteil der C7G Bestimmung des Kohlenhydratgehalts mittels Resorcin-Schwefelsäure-Test PAS-Färbung Deglycosylierung 51

4 3.2.4 Inkubation der C7G mit Hydrolasen Inkubation mit Inulinase Inkubation mit Trypsin Inkubation mit Pronase Nachweis der /S-Glucosidase-Aktivität nach SDS-PAGE Immunologische Untersuchung der C7G Dot-Blot Westem-Blot Kinetische Charakterisierung der C7G Temperatur-Optimum und Aktivierungsenergie ph-optimum Einfluss verschiedener Puffersysteme auf die Aktivität der C7G Kinetische Konstanten und Substratspezifität Flavonoid- und Cumaringlycoside Nitrophenylglycoside 67 4 C7G aus Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Reinigung der C7G aus Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung Säulenchromatographische Reinigung Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6 FF Anionenaustausch-Chromatographie an Source 30Q Gelfiltration an Superdex 200 pg Reinigungsbilanz Molekulare Eigenschaften der C7G aus Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Chromatofokussierung an Mono P SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Nachweis der 0-Glucosidase-Aktivität nach SDS-PAGE PAS-Färbung Partielle Sequenzierung und Sequenz-Homologien der C7G aus Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' 79 ffl

5 4.3 Teilreinigung der C7G aus getrockneten Blättern von Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung Säulenchromatographische Reinigung Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6 FF Anionenaustausch-Chromatographie an Source 30Q Gelfiltration an Superdex 200 pg Reinigungsbilanz Chromatofokussierung an Mono P SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 87 C Diskussion 89 D Material und Methoden Pflanzenmaterial ' Cynarae foiium Cynara scolymus L Inkubation von Drogenpulver Gewinnung der Protein-Rohextrakte Extraktion aus Cynarae foiium Extraktion aus Cynara scolymus L. cv. 'Gobbo di Nizza' Enzymtests Flavonoidglycoside und Esculin Nitrophenylglycoside Bestimmung der Polyphenol-Oxidase Inkubation der C7G mit Hydrolasen Inkubation mit Inulinase Inkubation mit Trypsin Inkubation mit Pronase Bestimmung diverser Enzymaktivitäten mittels API ZYM-System 118 IV

6 5 Entsalzen und Einengen von Proteinlösungen Gelpermeationschromatographie Dialyse Ultrafiltration Fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung Analytik Dünnschichtchromatographie (DC) Hochleistungsflüsigkeitschromatographie (HPLC) Resorcin-Schwefelsäure-Test Proteinbestimmung Fast-Protein-Liquid-Chromatographie (FPLC) Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) Phenylsepharose 6 FF high sub Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) Source30Q ResourceQ Chromatofokussierung MonoP Gelfiltration Superdex 200 pg Sephacryl S-300 HR Gelelektrophorese Gelzusammensetzung und Probenvorbereitung Färbemethoden Coomassie-Färbung Silberfärbung PAS-Färbung Bestimmung der C7G-Aktivität nach SDS-PAGE (Zymogramm) Bestimmung des Molekulargewichts Bestimmung des Kohlenhydratanteils (Deglycosylierung) 133 V

7 9 Immunologische Nachweisverfahren 9.1 Dot-Blot Lösungen und Puffer Verwendete Immunseren und Antikörper Vorgehensweise 9.2 Western-Blot Lösungen und Puffer Verwendete Antikörper Vorgehensweise Bestimmung des Molekulargewichts der erkannten Antigene 10 Protein-Sequenzierung 11 Verwendete Chemikalien und Verbrauchsmaterial 11.1 Chemikalien 11.2 Verbrauchsmaterial 11.3 Puffer 12 Geräte E F Zusammenfassung Literaturverzeichnis VI