Online-Überwachungsmethoden mit spezieller Beachtung der Durchflusszytometrie

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1 Weiterbildungskurse Online-Überwachungsmethoden mit spezieller Beachtung der Durchflusszytometrie Von: Hans Peter Füchslin und Annette Rust Hans Peter Füchslin Dr. sc. nat. / Dipl. Natw. ETH Bachema AG Rütistrasse Schlieren Veranstaltungsort: 1

2 Online-Überwachungsmethoden unter besonderer Beachtung der Durchflusszytometrie Autoren: Hans Peter Füchslin und Annette Rust Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 2. Begriffe 3. Chemisch-Physikalische Online-Parameter 4. Schritt für Schritt zur Online-Überwachung 5. Mikrobiologische Online-Überwachungsmethoden 6. Durchflusszytometrie 7. Schlussfolgerungen 8. Referenzen 1. Einleitung Die Wasserversorger müssen zu jeder Zeit Trinkwasser von hoher Qualität zur Verfügung stellen. Dies wird periodisch mit Messungen von physikalischen, chemischen und mikrobiologischen Parametern überprüft. Da Trinkwasser kontinuierlich produziert wird, wäre aber auch eine kontinuierliche Überwachung wünschenswert. Seit Ende der 70er-Jahre mit der Entwicklung von Sensoren und der dazugehörigen Datenübertragung ist die Online-Kontrolle im Trinkwasserbereich ein Thema (Slipper, 1985; Sakazaki, 1997). Zur Überprüfung der Wasserqualität des Rohwassers und des aufbereiteten Trinkwassers kommen nach dem heutigen Stand der Technik diverse Online-Methoden zum Einsatz. Die Online-Kontrolle des Trinkwassers wird aber zurzeit weder in den entsprechenden Verordnungen noch in den geltenden Richtlinien sinngemäss erwähnt. Online-Parameter ermöglichen Aussagen über die generelle Wasserqualität. Sie sind aber in ihrer Aussagekraft beschränkt und können Laboranalysen nicht ersetzen. Insbesondere für mikrobiologische Parameter sind noch keine zuverlässigen Online-Methoden verfügbar. Neben der Messung von Parametern, die über die chemische und physikalische Wasserqualität Auskunft geben können, werden hydraulische Parameter (Bsp. Druck, Durchflussrate, Wasserstand etc.) und technische Betriebsparameter online gemessen. Die folgenden Ausführungen beschränken sich auf die Online-Messung der Qualitätsparameter. Tabelle 1 gibt einen Überblick über wichtige Messparameter und ihre Bedeutung (Hargensheimer et al., 2002). 2

3 2. Begriffe Biomonitoring Überwachung von Testmedien (in unserem Fall Trinkwasser), mit lebenden Organismen (Bsp. Fische oder Daphnien). Anhand von Veränderungen des Verhaltens oder des Zustands der Organismen können Veränderungen der Wasserqualität erkannt werden. Online-Messung Direkte Messung eines Messparameters in kurzen Zeitabständen mit einer Sonde, die direkt im Durchflussystem im Trinkwasser installiert ist, mit Resultatübertragung über ein elektronisches Netzwerk (Bsp. Internet). Im Gegensatz dazu steht die Offline-Messung, bei der Stichproben genommen werden und im Labor analysiert werden. Stand der Technik Technische Möglichkeiten zu einem bestimmten Zeitpunkt, die Produkte, Prozesse und Dienstleistungen betreffen, basierend auf entsprechenden gesicherten Erkenntnissen von Wissenschaft, Technik und Erfahrung. Der Stand der Technik beinhaltet auch die wirtschaftliche Machbarkeit. Dies heisst nicht, dass jedes Unternehmen sich den Stand der Technik leisten kann, aber die Mehrheit im betreffenden Sektor. 3

4 3. Chemisch-Physikalische Online-Parameter Die heute am häufigsten im Einsatz stehenden Online-Messmethoden sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Chemische und physikalische Online-Parameter. Parameter / Einheit Temperatur / C ph-wert / ph Leitfähigkeit / µs/cm Freies Chlor / mg/l, ppm UV-Absorption bei 254nm / m -1 Sauerstoff / mg/l, ppm Chlorid / mg/l, ppm Messprinzip Elektronisches Thermometer Selektive Sonde für Wasserstoffionenkonzentration Conductometrische Sonde Sonde für Chlor (Cl 2 ) Fotometrische, spektrale Absorption bei 254 nm Lichtwellenlänge Selektive Lumineszenz- Sonde Selektive Sonde für Chlorid-Ionen Einsatz Indikator für Veränderungen der Herkunft des Wassers oder Stagnationen. Grund- und Quellwasser weisst ganzjährig in der Regel eine Temperatur von 8 bis 15 C auf. Gepumptes Grundwasser ist i.d.r. tiefgründigeres Grundwasser als Quellwasser, und weist im Jahresverlauf eine geringere Temperaturschwankungen auf. Es hat oft eine charakteristische, eigene Temperatur. Indikator für Veränderungen der Herkunft des Wassers, ev. Mikrobiologische Aktivität. Der ph- Wert wird hauptsächlich durch die Geologie der Herkunftsregion des Wassers bestimmt und sollte zwischen liegen. Indikator für die Veränderung der Konzentration von gelösten Salzen. Die elektr. Leitfähigkeit sollte zwischen µs/cm liegen und innerhalb der periodischen Routinemessungen über längere Zeiträume (Jahre) keine grösseren Schwankungen aufweisen. Desinfektionskontrolle Indikator für eine starke Veränderungen der Konzentration von organischen Inhaltsstoffen Indikator mikrobiologische Aktivität (Bsp. bei Stagnation), Veränderungen der Herkunft des Wassers. Indikator für Einflüsse aus dem Einzugsgebiet (Bsp. erhöhter Streusalzeinsatz) Ammonium, Nitrat / mg/l, ppm Trübung / Partikelzähler / NTE, NTU oder TE/F Selektive Sonden für Ammonium und Nitrat Turbidimeter: Lichtquelle und Absorptionsmessung Indikatoren für eine Verunreinigung durch Düngemittel oder Abwasser Indikator für suspendierte Teilchen und Mikroorganismen 4

5 4. Schritt für Schritt zur Online-Überwachung Bei der Planung der Online-Überwachung von Trinkwasser müssen folgende Fragen beantwortet werden. a) Wahl der Online-Parameter Je nach Kontrollpunkt in der Trinkwasserversorgung können technisch und wirtschaftlich sinnvolle Online-Parameter gewählt werden, die entsprechend ihrem Einsatzort als Indikatoren für mögliche Veränderungen dienen können (s. Tabelle 1). b) Standort der Messpunkte Online-Messeinrichtungen können an verschiedenen Stellen der Wasserversorgung platziert werden: Rohwasser Die Qualität des Rohwasser kann sich je nach Witterung und Jahreszeit (Bsp. nach länger anhaltenden Regenereignissen im Einzugsgebiet der Fassung) ändern (Auckenthaler et al., 2002). Beispielsweise kann eine erhöhte Trübung die UV- Desinfektion beinträchtigen und das Rohwasser muss bei Überschreitung eines Toleranzwertes verworfen werden. Nach Aufbereitung Zur Kontrolle des Aufbereitungsprozesses bietet sich eine Online-Messung an. So kann zum Beispiel die Dosierung von Netzschutzmittel oder das Einstellen des ph- Wertes überprüft werden. Netz Kontaminationen im Netz können mit Online-Messungen erkannt werden. So können Bautätigkeiten kontrolliert und das Verteilnetz vor Sabotage geschützt werden. Ausserdem können mit Temperaturmessungen Stagnationen im Netz festgestellt werden. c) Messmethodik Ein weites Spektrum von verschiedenen chemischen und physikalischen Online- Messmethoden wird bereits angeboten. Durch Entwicklung und Forschung werden in den nächsten Jahren vermutlich weitere Methoden auch im Bereich Mikrobiologie auf den Markt kommen d) Messintervalle Der Situation angepasst können Zeitintervalle für Messungen bestimmt werden. So können im Stunden-, Halbstunden-, Minuten- bis Sekundentakt automatisch Messungen durchgeführt und aufgezeichnet werden. e) Kalibrierung der Messgeräte Gemäss Angaben des Herstellers müssen die Online-Messgeräte in regelmässigen Abständen überprüft und bei Bedarf justiert werden. f) Speicherung und Transfer der Messdaten Verschiedene Formen der Datenübertragung via Internet, Funk und internem Netz sind möglich. Heute bietet sich das Internet als einfache Lösung an. Es muss aber die Gefahr von Hackerangriffen in Betracht gezogen und eventuell Gegenmassnahmen getroffen werden. 5

6 g) Auswertung und Verwendung der Messdaten Die Messdaten werden vielfach nicht nur abgespeichert, sondern auch automatisch ausgewertet. So werden bei Überschreitung von Toleranzwerte technische Alarme ausgelöst oder das Rohwasser verworfen. h) Vorkehrungen gegenüber Stromunterbrüchen Bei aller gewünschten Automatisierung sollte die Wasserversorgung auch bei einem allfälligen Stromausfall oder Ausfall der Steuerung gewährleistet sein. 5. Mikrobiologische Online-Überwachungsmethoden Es wird unterschieden zwischen dem direkten Nachweis von Mikroorganismen und der Überwachung von Trinkwasser mit lebenden Organismen (Biomonitoring). Die Wasserversorgung Zürich betreibt ein Biomonitoring mit Forellen und Daphnien (Wasserversorgung Zürich online). Biomonitoring kann generell anzeigen, wenn das Wasser in seiner Qualität beeinträchtigt ist. Allerdings kann die Reaktionszeit wie auch das Spektrum der Substanzen, bei denen die eingesetzten Organismen durch ihr verändertes Verhalten Alarm schlagen, stark variieren. Der hohe Aufwand für diese Systeme verhindert momentan eine Anwendung in kleineren Werken oder einen Einsatz zur Überwachung des Netzes. Der direkte Online-Nachweis von Mikroorganismen wird gemäss unseren Kenntnissen zurzeit von keiner Wasserversorgung standardmässig angewendet. Direkter Nachweis von Mikroorganismen Es gibt Ansätze zu einer Online-Messung, doch sind die Methoden generell noch zu wenig empfindlich, zu anfällig auf Störungen oder zu wenig schnell (Mays, 2004; States et al., 2004; EPA, 2005). Bei den folgenden Methoden könnte es aber in absehbarer Zukunft zumindest zu Online-ähnlichen Anwendungen kommen: Durchflusszytometrie Der Begriff Durchflusszytometrie (Zytometrie = Zell-Vermessung) beschreibt ein Messverfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Es erlaubt die Auszählung und Analyse von Zellen, die in hohem Tempo einzeln an einem Lichtstrahl in einer Messkammer vorbei fliessen. Nachweis von Adenosintriphosphat (ATP) Der ATP-Nachweis wird allgemein mit dem Vorhandensein von Bakterien verbunden. Verschiedene Kits, die eine einfache und schnelle Messung ermöglichen, sind auf den Markt. Diese Nachweismethoden sind sehr einfach und sehr schnell: Extrazellulare oder intrazellulare ATP kann innerhalb von Minuten gemessen werden. PCR Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode, um die Erbsubstanz DNA im Reagenzglas zu vervielfältigen. Dazu wird ein Enzym verwendet, die DNA-Polymerase. So kann die DNA von speziellen Mikroorganismen detektiert werden. Microarrays Microarray ist eine Sammelbezeichnung für moderne molekularbiologische Untersuchungssysteme, die die parallele Analyse von mehreren tausend 6

7 Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials erlauben. Es gibt verschiedene Formen von Microarrays, die manchmal auch als "Genchips" oder "Biochips" bezeichnet werden, weil sie wie ein Computerchip viele Informationen auf kleinstem Raum enthalten können. Immunoassay Als Immunassays (engl.: Immunoassay) werden zusammenfassend eine Reihe von Methoden in der Bioanalytik bezeichnet, deren gemeinsames Grundprinzip die Erkennung und damit der Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Phase durch die Bindung eines Antigens an einen Antikörper ist. In den USA wird als Schutz vor Terrorangriffen intensiv an Online-Methoden im mikrobiologischen Bereich geforscht. Es könnte deshalb in absehbarer Zukunft zu technischen Lösungen in diesem Bereich kommen. 6. Durchflusszytometrie Seit mehr als 20 Jahren wird die Durchflusszytometrie in der medizinischen Praxis, zum Beispiel zum Zählen von Blutzellen, eingesetzt. Dagegen ist sie bisher in der Trinkwassermikrobiologie wenig verbreitet, wohl vor allem deshalb, weil Bakterien sehr viel kleiner als menschliche Zellen und damit schwieriger zu erfassen sind. Technisch verbesserte und kostengünstigere Geräte finden neuerdings Eingang in die mikrobiologische Überwachung von Trinkwasser. An der Eawag, dem Wasserforschungsinstitut des ETH-Bereichs, wurden verschiedene durchflusszytometrische Analysemethoden für den Trinkwasserbereich entwickelt (Hammes & Egli, 2005; Berney et al., 2007; Hammes et al., 2008; Egli & Hammes, 2010; Füchslin et al., 2010; Kötzsch, 2010). Die klassischen mikrobiologischen Untersuchungsmethoden (z.b. aerobe, mesophile Keime) basieren auf Kultivierungsverfahren, die je nach Verfahren längere Inkubationen erfordern, so dass die Ergebnisse erst nach mehreren Tagen vorliegen. Bei der Durchflusszytometrie werden sofort und direkt die vorhandenen Bakterienzellen in einer Wasserprobe gezählt. Mit spezieller Färbetechnik kann auch eine Aussage über den physiologischen Zustand jeder einzelnen Zelle erhalten werden. Die Durchflusszytometrie hat somit ein Potential, um zur mikrobiologischen Online- Messmethode entwickelt zu werden und ist eine sinnvolle Ergänzung zu den klassischen Kultivierungsmethoden. Messprinzip Das Erbgut-Molekül, die DNA, der Zelle wird vorgängig mit einem DNA-Farbstoff namens SYBR Green I angefärbt, um so mit Hilfe der SYBR Green-spezifischen Grünfluoreszenz die mikrobiologische Zellen von DNA-freien, anorganischen Partikeln unterscheiden zu können (Figur 1). Die Mikroorganismen werden einzeln durch eine Glaskapillare geschleust, die von einem Laserstrahl durchdrungen wird. Trifft der Lichtstrahl auf eine Zelle, wird ein Teil der Strahlung abgelenkt und über Linsen-, Spiegel- und Filtersysteme auf einen Lichtdetektor umgeleitet und erfasst. Mittels elektronischer Signaldetektion können bis zu 1000 Zellen pro Sekunde gezählt werden, wobei die benötigte Probemenge nur ca. 2 Milliliter beträgt. Die Nachweisgrenze liegt bei etwa 200 Zellen pro ml. 7

8 Messung im Durchflusszytometer er Rotfluoreszenz durch SYBRGreen Hintergrund Bakterienzellen Grünfluoreszenz durch SYBRGreen Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoff anfärben Wasserprobe Figur 1: Messprinzip der Durchflusszytometrie 6.1 Durchflusszytometrische Analysemethoden im Trinkwasserbereich a) Bestimmung der Bakterienzellkonzentration Es kommen eindeutig mehr Bakterien im Trinkwasser vor, als im Labor kultiviert werden können. Die Konzentration der frei lebenden Bakterien im Trinkwasser liegt zwischen 10 4 und 10 5 Zellen pro ml. Bei der Keimzahl werden nur die kolonienbildenden Bakterien nachgewiesen, was erfahrungsgemäss gerade mal 1 bis 0,1 % der gesamten mikrobiologischen Population entspricht. Ausserdem dauert es mindestens drei Tage, bis auf den Agarplatten Kolonien ausgezählt werden können. Es erstaunt, dass trotz der geringen Aussagekraft der Keimzahl, dieser Parameter weltweit als genereller mikrobiologischer Qualitätsindikator eingesetzt wird und nicht die Zellkonzentration. Dies könnte damit zu tun haben, dass früher die manuelle Auszählung von Zellen unter dem Mikroskop die einzige Möglichkeit war, Bakterienzellen direkt zu zählen. Diese Art der Zellkonzentrationsbestimmung ist aber für Routinekontrollen zu arbeits- und zeitintensiv. Heutzutage kann aber die Anzahl der bakteriellen Zellen pro ml durchflusszytometrisch viel einfacher und präziser bestimmt werden (Hammes, et al., 2008). Bakterielle Zellen werden mit DNA-Farbstoffen wie SYBR Green in 15 Minuten angefärbt und anschliessend 8

9 automatisch in wenigen Minuten mit einem Durchflusszytometer ausgezählt (Figur 1). Die Bakterienzellzellkonzentration ist ein genereller mikrobiologischer Parameter für die Wasserqualität, welcher mit der heutigen Technik in weniger als 20 Minuten präzise bestimmt werden kann. Mit unserem transportablen Durchflusszytometer können wir Verkeimungsprobleme vor Ort in wenigen Stunden lokalisieren. b) Bestimmung der biologischen Stabilität Ob Wasser auch noch nach längerem Aufenthalt in Wasserreservoiren, Abfüllanlagen oder in Flaschen nicht verkeimt, kristallklar und geschmacklich einwandfrei bleibt, entscheidet vielfach die Konzentration an biologisch rasch verfügbarem organischem Kohlenstoff (engl. assimilable organic carbon, AOC). Je höher der AOC-Gehalt, desto schneller können Bakterien sich vermehren und somit mikrobielle Verunreinigungen verursachen. Die Folgen sind Erhöhung der Zahl der aeroben, mesophilen Keime, der Trübung und geschmackliche Veränderungen. Wasserversorgungen sollten deshalb den AOC-Gehalt möglichst tief und somit das Wasser biologisch stabil halten. Mit der Durchflusszytometrie kann dieser AOC- Gehalt in einem dreitägigen Bakterienvermehrungstest quantitativ bestimmt werden (Hammes & Egli, 2005). Nicht nur das Rohwasser, sondern das ganze Verteilnetz kann auf mögliche AOC-Probleme kontrolliert werden. c) Bestimmung des physiologischen Zustandes der Bakterienzellen Die Durchflusszytometrie ist nicht nur in der Lage die Zahl der vorhandenen Bakterienzellen zu bestimmen, sondern auch die Stoffwechselaktivität von jeder einzelnen Bakterienzelle durch Anfärbung mit Vitalfarbstoffen (Berney, et al., 2007). So kann die Atmungsaktivität, die Estereraseaktivität (Aktivität eines speziellen Stoffwechselenzyms), das Membranpotential und die Membranintegrität gemessen werden. Dies kann für die Überwachung von Desinfektionsprozessen wie zum Beispiel der Chlorung oder der Ozonung nützlich sein. 7. Schlussfolgerung Die Vorteile der Online-Messung für die Trinkwasserversorgung sind klar gegeben: praktisch lückenlos werden automatisch verschiedene Parameter gemessen, abgespeichert und ausgewertet. Bei Überschreitung von Toleranzwerten kann das verantwortliche Personal informiert und aufgeboten werden. Für einige chemischphysikalische Parameter ist dies schon heute realisiert. Dank der Fortschritte in Sensor- und Kommunikationstechnik werden die Kontrollsysteme weiter verbessert und weitere Parameter insbesondere im mikrobiologischen Bereich zur Anwendung gebracht. Die Online-Kontrollsysteme werden in Zukunft immer mehr helfen effizient und effektiv die Qualität des Trinkwassers zu kontrollieren. Weitergehende Laboranalysen werden aber auch weiterhin nötig sein. 9

10 8. Referenz Auckenthaler, A., Raso, G. & Huggenberger, P. (2002). Particle transport in a karst aquifer: natural and artificial tracer experiments with bacteria, bacteriophages and microspheres. Water Sci Technol 46, Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U. & Egli, T. (2007). Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Appl Environ Microbiol 73, Egli, T. & Hammes, F. (2010). Neue Methoden für die Wasseranalytik. Gas, Wasser, Abwasser (GWA) 90, EPA (2005). Technologies and techniques for early warning systems to monitor and evaluate drinking water quality: A state-of-the-art review. Füchslin, H. P., Kötzsch, S., Keserue, H.-A. & Egli, T. (2010). Rapid and quantitative detection of Legionella pneumophila applying immunomagnetic separation and flow cytometry. Cytometry Part A 77A, Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Koster, O. & Egli, T. (2008). Flowcytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes. Water Res 42, Hammes, F. A. & Egli, T. (2005). New method for assimilable organic carbon determination using flow-cytometric enumeration and a natural microbial consortium as inoculum. Environ Sci Technol 39, Hargensheimer, E., Conio, O. & Popovicova, J. (2002). Online monitoring for drinking water utilities AWWA. Kötzsch, S. (2010). Beurteilung von Kunststoffen in Kontakt mit Trinkwasser: BioMig: Ein verbessertes Methodenpaket zur Bestimmung des Verkeimungspotenzials. Gas, Wasser, Abwasser (GWA) 90, Mays, L. W. (2004). Water supply systems security. New York: The McGraw-Hill Companies. Sakazaki, S. (1997). Network management systems. In IWSA World Congress. Madrid: National Report. Slipper, M. J. (1985). The application of ICA to water supply and distribution management. Aqua 5, States, S., Newberry, J., Wichtermann, J., Kuchta, J., Scheuring, M. & Casson, L. (2004). Rapid analytical techniques for drinking water security investigations. Journal AWWA 96, Wasserversorgung Zürich online: 10

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