Lernziele. Kursstunde Zellkultur / Virusisolierung. Institut für Virologie UNIKLINIK Köln. Eigenschaften von Viren. Praktikum der Mikrobiologie

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1 Praktikum der Mikrobiologie Kursstunde Zellkultur / Virusisolierung Institut für Virologie UNIKLINIK Köln Lernziele Anzüchtung von Viren aus Patientenmaterialien Kultivierung von Zellen Erkennen Virus-spezifischer zytopathischer Effekte Virusaufbau Eigenschaften von Viren Virion Hülle -Lipidmembran wie Zellmembran -macht empfindlich gegenüber Detergenzien/Äther Kapsid -Proteinmantel Nukleokapsid -Kapsid und Nukleinsäure Obligat intrazelluläre Vermehrung, d.h. nicht auf Nährböden anzüchtbar Keine Vermehrung durch Zweiteilung, sondern Neusynthese der Viruskomponenten in der infizierten Zelle und Zusammenbau filtrierbar (gilt auch für Mykoplasmen und Chlamydien) i.d.r. im Lichtmikroskop nicht sichtbar

2 Nachweis von Viren 1. Direkter Nachweis (1. Kurstag) - Virus ELMI Anzucht Anfärbung viraler Komponenten über spezifische Antikörper - Genom PCR, RT-PCR Anzucht von Viren Tiere Embryonierte Hühnereier Zellkultur 2. Indirekter Nachweis (2. Kurstag) -Antikörperantwort ELISA Neutralisationstest (Komplementbindungsreaktion) Hämagglutinations-Hemmtest Anzucht von Viren in der Zellkultur Anzucht von Viren in der Zellkultur Wichtig für Entdeckung neuer Viren Molekularbiologie der viralen Replikation Impfstoffentwicklung 1954: Nobelpreis (Poliovirus) Polioimpfstoff: - Anzucht auf Affennieren Zellen - heute: Zelllinien 2003: SARS Coronavirus 2009: Neue Influenza A H1N1-Impfstoff (Schweine-Grippe)

3 Anzucht von Viren: Zellkultur Gelingt nicht bei jedem Virus. Derzeit noch keine Anzucht von Hepatitis C Virus Noroviren Nicht in einschichtiger Zellkultur Papillomviren Zellkulturen Primäre Zellkulturen - aus adultem Gewebe - nicht subkultivierbar Semipermanente Zellkulturen - aus embryonalem Gewebe - begrenzt subkultivierbar Permanente Zellkulturen - aus Tumoren oder transformierten Zellen - unbegrenzt teilungsfähig Formen der Zellkultur Einzelschichtkulturen (Monolayer) 1. Primäre Zellkulturen versus permanente Zelllinien (transformierte oder Tumor-Zellen) 2. Adhärente (am Kulturboden haftende) versus Suspensions-Kultur (schwimmend) 3. Einschichtige ( Monolayer ) versus mehrschichtige Kultur Epitheliale Wuchsform polygonale, pflastersteinartig angeordnete Zellen Fibroblastoide Wuchsform langgestreckt, fischzugartig z.t. in Wirbeln angeordnete Zellen GMK = Green Monkey Kidney VH = Vorhaut-Fibroblasten

4 Folgen einer Virusinfektion Virale Infektion einer Zelle kann zur Zellschädigung führen Virus-bedingte Zellschädigung CPE = cytopathischer Effekt = lichtmikroskopisch sichtbare Veränderung des Zellrasens / der Zellsuspension Zytopathischer Effekt: Enteroviren Zytopathischer Effekt: Adenoviren GMK-Zellen (epithelial) uninfiziert GMK + Enteroviren Aufgelöster Zellrasen HeLa-Zellen (epithelial) uninfiziert HeLa + Adenoviren: Schwellung und Abrundung der Zellen, traubenförmiges Abheben

5 Zytopathischer Effekt: Herpes Simplex Virus Zytopathischer Effekt: Zytomegalie Virus HeLa + HSV-1 Focus infizierter Zellen HeLa + HSV-2 + Synzytien = mehrkernige Riesenzellen Vorhaut-Fibroblasten uninfiziert Vorhaut-Fibroblasten + Zytomegalie Virus Körner in einer Ähre Dauer: ca. 2-3 Wochen! Zellkultur - Virustypisierung Versuch 1: Materialien mit gelben Punkten Art und Zeitpunkt des zytopathischen Effekts (CPE) Zelltropismus der isolierten Viren Ether-Empfindlichkeit ether-empfindlich >> behüllte Viren ether-resistent >> nackte Viren Neutralistions-Test mit mono- oder polyklonalen Antikörpern Immunfluoreszenz-Test mit mono- oder polyklonalen Antikörpern ZM = Zellkulturmedium; AB = Antibiotika-Gebrauchslösung PBS = Phosphate Buffered Saline (phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)

6 Versuch 2: Materialien mit roten Punkten Versuch 1: Materialien mit gelben Punkten Trypsin 3 Minuten (nicht länger!) im 37 Brutschrank ZM = Zellkulturmedium; AB = Antibiotika-Gebrauchslösung PBS = Phosphate Buffered Saline (phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) Zellkulturarbeiten Zellkulturarbeiten Flaschen seitlich beschriften!! (nicht am Boden oder oben) Medium pipettieren! Handschuhe + Kittel tragen!

7 Sicherheitshinweis Infektiöse Viren Sicherheitshinweis Infektiöse Viren Schwangere Immunsupprimierte Einmalhandschuhe + Laborkittel tragen! Nach Beendigung der Arbeiten Hände desinfizieren!

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