Humane mesenchymale Stammzellen (HMSC): Differenzierung und Fusion mit anderen Zellarten

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1 Humane mesenchymale Stammzellen (HMSC): Differenzierung und Fusion mit anderen Zellarten Dissertation Zur Erlangung des Akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Manja Schulze geboren am in Halle/Saale Gutachter 1. Prof. Dr. Dr. Thomas Braun 2. Prof. Dr. Anna Wobus Datum der Verteidigung: urn:nbn:de:gbv: [

2 Diese Dissertation ist von der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Martin- Luther-Universität Halle-Wittenberg genehmigt worden. Hiermit versichere ich, Manja Schulze, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Die aus fremden Quellen übernommenen Gedanken oder Graphiken sind als solche kenntlich gemacht. Die vorliegende Arbeit wurde noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Manja Schulze Halle(Saale), den

3 Danksagung An erster Stelle möchte ich Prof. Dr. Dr. Thomas Braun für die Überlassung des interessanten Themas danken, der die Arbeit mit ständigem Interesse, motivierender Unterstützung und stetiger Diskussionsbereitschaft begleitet hat. PD. Dr. Eva Bober möchte ich für die gute Zusammenarbeit danken und ins Besondere für das Aufzeigen von beruflichen Perspektiven. Ein besonderer Dank gilt Dr. Herbert Neuhaus und Dr. Petra Neuhaus für die Hilfsbereitschaft, Unterstützung und ständige Gesprächsbereitschaft. Die konstruktiven Diskussionen haben oft zur Horizonterweiterung beigetragen und mich zu neuen Ideen angeregt. Besonders bedanken möchte ich mich für die Durchsicht meines Manuskripts. Für das gute Arbeitsklima möchte ich vor allem Julia, Annette, Undine, Annelies, Nicole, Jens, Daniela, und Stefan danken. Ganz besonders möchte ich meiner Familie und meinen Freunden danken, die mich immer liebevoll unterstützt haben und das Verständnis für meine Arbeit aufbrachten.

4 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Stammzellen-ein Überblick Fusionsereignisse bei mesenchymalen Stammzellen Die Entstehung von multinucleären Myotuben Ziele der Arbeit 9 2. Materialien Chemikalien und Materialen Gebrauchswaren Enzyme Chemikalien Antikörper primäre Antiköper sekundäre Antikörper Versuchstiere Kits DNA-Größenstandards Oligonucleotid-Sequenz Lösungen und Puffer Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden Gel-Elektrophoresematerialien Lösungen für RNA-Isolation Lösung für operativen Eingriff Lösungen für die Präparation von Geweben Materialien und Lösungen für die Zellkultur Zellen Zelllinien Primäre Zellen Medien und Lösungen für die Zellkultur 16

5 Wachstumsmedien Differenzierungsmedien zellbiologisches Enzym Färbelösung für vitale Zellen GFP-Adenovirus Lösungen für immunhistochemische Färbungen Lösungen für histologische Färbungen Zellkernfärbungen Lösungen für ß-Galaktosidase-Färbung Methoden Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standartmethoden RNA-Isolation mit Trizol Methoden der Polymerase-Ketten-Reaktion RT-PCR Amplifikation von DNA-Fragmenten mit Hilfe der PCR Sequenzierungen Methoden der Zellkultur Isolation von primären Zellen Isolation von humanen Knochenmarkzellen aus dem Hüftgelenkskopf Isolation von Satelliten-Zellen DiI-Markierung der HMSC Kryoschädigung und Injektion von DiI-markierten HMSC Generation und Analyse von chimären Mäusen Präparation von Embryonen Einbettung der Embryonen mittels Agarose Kryotomschnitte von Geweben Differenzierungsassays Adipogene Differenzierung Osteogene Differenzierung Chondrogene Differenzierung Infektion der humanen mesenchymalen Stammzellen mit GFP-exprimierenden Adenoviren Kokultivierungsexperiment 27

6 Kokultivierungsexperiment mit Zugabe von Zytokinen oder Antikörpern Kokultivierungsexperiment mit Polykarbonat-Filtermembranen Immunhistochemische und histochemische Färbungen Immunhistochemische Färbung von Zellen und Gewebeschnitten Doppelfärbung der chimären Myotuben mit zwei anti-maus-antikörpern Färbung der Zellkerne DAB-Färbung Oil-Red-Färbung von Kossa -Färbung Safranin-O-Färbung ß-Galactosidase-Färbung Photodokumentation Statistische Auswertung Ergebnisse Isolierung adulter Knochenmarkszellen und Untersuchung ihres Differenzierungspotentials Histochemischer Nachweis der Differenzierung der Knochenmarkszellen in drei mesenchymale Zelltypen HMSC exprimieren nach Induktion verschiedene gewebsspezifische mrnas Teilnahme von DiI-markierten HMSC an der Regeneration von murinen Muskelzellen Untersuchung des Mechanismus der Teilnahme der HMSC durch in vitro-experimente Kokultivierung der humanen mesenchymalen Stammzellen mit C2C12-Zellen Kokultivierungs-Experimnent mittels Polykarbonat-Filter Humane mesenchymale Stammzellen nehmen mittels Zellfusion an den sich bildenden Myotuben teil Fusionen zwischen HMSC und primären, von Satelliten-Zellen-abstammenden Myoblasten Humane mesenchymale Stammzellen erfahren keine myogene Reprogrammierung nach Fusion mit Myotuben Expression von humanem Vimentin in chimären Myotuben Koexpression von murinem Myogenin und der humanen

7 Prolyl 4-Hydroxylase in chimären Myotuben IL-4 steuert die Fusion von HMSC mit Myotuben HMSC exprimieren den IL-4-Rezeptor Histochemischer Nachweis des IL-4-Rezeptors Erhöhung der Fusionsereignisse nach IL-4-Zugabe Die Fusion von HMSC mit Myotuben wird durch Blockierung des IL-4- Signalweges eingeschränkt Teilnahme mesenchymaler adulter Stammzellen (MASC) an der Entwicklung der Skelletmuskulatur, aber nicht an der Herzentwicklung Der NFATC2- und NFATC2/3/IL-4-Signalweg ist erforderlich für Fusionen zwischen adulten mesenchymalen Stammzellen (MASC) und Muskelzellen in vivo Untersuchung des Fusions- und Differenzierungspotentials dermaler 56 Fibroblasten verschiedenen Ursprungs im Vergleich zu den HMSC Fusionen von dermalen Fibroblasten und Vorhautzellen nach Kokultivierung mit C2C12-Zellen Abschaltung der Myogenin-Expression von murinen Kernen in chimären Myotuben Die Fibroblasten zeigten eine geringere Fusionspotenz und IL-4-Rezeptor- Expression, als die HMSC Dermale Fibroblasten zeigen gegenüber den HMSC eine geringere Kompetenz der adipogenen Differenzierung 5. Diskussion Humane adulte Knochenmarkszellen haben ein multipotentes Differenzierungspotential Teilnahme von HMSC an der Regeneration von Muskelzellen nach Kryoschädigung Teilnahme von HMSC an der Bildung von Myotuben durch Fusion HMSC halten ihre endogene Expression aufrecht und führen zur Reprogrammierung muriner Myotubenkerne Regulation der Fusionsprozesse Mesenchymale Stammzellen nehmen durch eine NFAT/IL-4- vermittelte Fusion an der Muskelbildung teil 72

8 5.7. Potentielle Zielgene von IL Fusionsereignisse bei dermaler Fibroblasten und Vorhaut- Fibroblasten Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungen Lebenslauf Tagungsbeiträge und Puplikationen 101