Zwischenbericht. über das DFG-Projekt "Pathotypdifferenzierung" Aufklärung der Wechselbeziehungen zwischen genotypischer Determination und

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1 Zwischenbericht über das DFG-Projekt "Pathotypdifferenzierung" zum Thema: Aufklärung der Wechselbeziehungen zwischen genotypischer Determination und phänotypischer Modulation der Virulenz bodenbürtiger Phytomykosen am Beispiel der Schwarzbeinigkeit (Gaeumannomyces graminis) bei Getreide Geschäftszeichen: Au 120/1-2 Bearbeitungszeitraum: Sachbeihilfe-Bewilligung: Projektleiter: Dr. C. Augustin 1

2 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 3 2. Aufgabenstellung 4 3. Stand der Realisierung Überblick zu den durchgeführten Untersuchungen Identifizierung und Differenzierung mit der RAPD-PCR Entwicklung einer Schnellidentifizierungmethode Untersuchungsobjekte, -verfahren und -methoden Ergebnisse Inter- und intravarietale Differenzierung der Isolate des G/P-Komplexes mittels RAPD-PCR Zuordnung der mit der RAPD-PCR gefundenen Hauptmustergruppen zu Arten und Varietäten des G/P-Komplexes und Vergleich mit anderen Differenzierungsmethoden Vergleich der RAPD-PCR mit anderen DNA-Fingerprintmethoden (Kooperation mit dem IACR Rothamsted) und taxonomische Zuordnung Vergleich der RAPD-PCR-Analysen mit Untersuchungen zur Morphologie, Physiologie und Pathogenität der Pilzisolate Charakterisierung der Stellung der neu identifizierten Hauptgruppe E innerhalb des G/P-Komplexes Überprüfung der Eignung der RAPD-PCR zur intravarietalen Differenzierung und zur Charakterisierung der räumlichen Verteilung der Pilze des G/P-Komplexes Verifizierung der mittels RAPD-PCR bestimmten intravarietalen Untergruppierungen Erprobung der RAPD-PCR zur Charakterisierung der räumlichen Verbreitung der differenzierten Haupt- und Untergruppen des G/P-Komplexes Schnellidentifizierung der Pilze des G/P-Komplexes direkt aus infizierten Pflanzenwurzeln Wertung und Ausblick Wertung und Schlußfolgerung für die Weiterführung der Arbeiten Für die letzte Phase des Projektes vorgesehene Arbeiten 23 Literatur Zusammenfassung 2

3 Das Ziel dieses Projektabschnittes bestand darin, das molekulargenetische Verfahren der RAPD 1 - PCR zu einem zuverlässigen und effizienten Hilfsmittel für die eindeutige Identifizierung und Differenzierung der phytopathogenen Pilze des Gaeumannomyces/Phialophora (G/P)-Komplexes weiterzuentwickeln. Darüber hinaus sollte mittels spezifischer Primer eine Methode zur direkten Identifizierung dieser Pilze aus infizierten Pflanzenwurzeln als Grundlage für die Einschätzung des aktiven Potentials der verschiedenen Pathotypen im Freiland geschaffen werden. Hierzu erfolgte zunächst eine Ausweitung der mit Hilfe der RAPD-PCR vorgenommenen Analysen auf 1076 Isolate unterschiedlicher geographischer Herkunft aus eigenen Freilanderhebungen bzw. internationalen Stammsammlungen. Zur Verifizierung der mit Hilfe dieser PCR-Technik gewonnenen Befunde und zum Herstellen eindeutiger Zuordnungen zu den bekannten Arten und Varietäten dieser Pilzgruppe dienten sowohl weitere, unterschiedlich selektive, molekulargenetische DNA-Fingerprint-, als auch ausgewählte klassische und physiologische Klassifizierungsmethoden sowie die Ermittlung der Pathogenität. Als Resultat der ausgedehnten RAPD-PCR-Analysen konnten die im ersten Projektabschnitt gefundenen Hauptmustergruppen A und B durch die Gruppen C, D und E ergänzt werden. Die mit der RAPD-PCR ermittelten Befunde stimmten gut mit Resultaten der verschiedenen molekulargenetischen und herkömmlichen Verfahren überein. Als Ergebnis dieser Überprüfungen ließen sich die PCR-Mustergruppen A, B, C klar den entsprechenden Varietäten von G. graminis sowie die Mustergruppe D der Art G. cylindrosporus/p. graminicola zuordnen. Demgegenüber repräsentiert die Mustergruppe E nach ersten mit großer Wahrscheinlichkeit eine bisher noch nicht beschriebene Gaeumannomyces- Gruppe. Für einige Isolate, die vordem mittels klassischer bzw. phänotypischer Methoden bestimmt worden waren, konnte die taxonomische Zuordnung aufgrund eindeutiger PCR-Muster korrigiert und präzisiert werden. Am Beispiel von an G. graminis var. tritici vorgenommenen Untersuchungen zur Klassifizierung der Pilze des G/P-Komplexes auf der intravarietalen Ebene erbrachten zudem den Nachweis, daß die RAPD-PCR eine noch detailliertere Differenzierung gestattet als die Hybridisierungsexperimente mit Hilfe einer rdna-sonde nach WARD & GRAY (1992). Darüber hinaus vermittelten die RAPD-PCR-Analysen erste Einblicke in die Wechselbeziehungen zwischen Standort- und Bewirtschaftungsfaktoren auf die räumliche Verbreitung diverser Haupt- und Untergruppen des G/P-Komplexes. Verschiedene Anhaltspunkte deuten auf ein komplexes, aber durchaus charakteristisches Reaktionsmuster einzelner Untergruppen hin. 1 RAPD (Random Primed Amplified Polymorphic DNA)-PCR entspricht der AP (Arbitrarily Primed)-PCR 3

4 Parallel dazu konnte auf der Grundlage der RFLP-Analyse eines amplifizierten ITS-5,8S- Fragments ein Verfahren zum schnellen Nachweis bzw. zur Differenzierung der verschiedenen Arten und Varietäten der Pilze des G/P-Komplexes direkt im infizierten Wurzelgewebe geschaffen werden. Der Vorzug dieser Methode liegt offensichtlich in der damit gegebenen Möglichkeit, bekämpfungsrelevante Pathotypen schnell und mit geringem Aufwand zu erfassen, nicht aber in der exakten Differenzierung der Isolate auf intravarietaler Ebene. 2. Aufgabenstellung Die von pilzlichen Schaderregern aus der taxonomischen Gruppierung des Gaeumannomyces/Phialophora (G/P)-Komplexes hervorgerufene, sogenannte Schwarzbeinigkeit gehört zu den wichtigsten Krankheiten im Getreidebau. Eigene Untersuchungen haben ergeben, daß sich hierfür im wesentlichen nur wenige, in ihrem Vorkommen aber extrem variable und differente Pathotypen, die vorrangig der Art Gaeumannomyces graminis var. tritici anzugehören scheinen, verantwortlich zeichnen. Bemühungen, diese Befunde mit Hilfe herkömmlicher Methoden zu überprüfen und zu präzisieren, hatten aufgrund der außerordentlich geringen morphologischen Unterschiede zwischen all den nah verwandten Vertretern dieses taxonomischen Komplexes nur einen begrenzten Erfolg. Die Entwicklung alternativer Verfahren, die eine schnelle und eindeutige Identifizierung bzw. Differenzierung der verschiedenen Isolate des G/P-Komplexes erlauben, stellt daher eine wichtige Voraussetzung für die Diagnose, Prognose und biologische Bekämpfung der Schwarzbeinigkeit dar. Hauptanliegen des gesamten Forschungsvorhabens ist es daher, hierzu durch die Entwicklung und Adaptierung von speziell auf diesen Schadpilz ausgerichteten molekulargenetischen Identifizierungsmethoden einen wesentlichen Beitrag zu leisten. Wie im 1. Zwischenbericht dargestellt, hat sich die RAPD-PCR als prinzipiell zur Differenzierung der verschiedenen Pilzisolate des G/P-Komplexes geeignet erwiesen. Jedoch war es bis dahin mit Hilfe dieses Verfahrens noch nicht möglich, eine sichere Zuordnung zwischen den gefundenen Pilzgruppen und den einzelnen Arten und Varietäten des G/P-Komplexes vorzunehmen sowie die für diesen Zweck am besten geeigneten Primer klar zu bestimmen. Da dies jedoch Voraussetzung für den gezielten Einsatz dieser molekulargenetischen Methode in den geplanten Nachfolgeuntersuchungen ist, mußten in Übereinstimmung mit den Forderungen der Gutachter in der sich anschließenden Phase der Arbeiten zunächst folgende Aufgabenstellungen realisiert werden: 4

5 1. Weitere Optimierung der RAPD-PCR zur verbesserten Identifizierung der Isolate des G/P- Komplexes. 2. Zuordnung der sich aus der RAPD-PCR ergebenden Mustergruppen zu Varietäten und intravarietalen Gruppen (Untergruppen) des G/P-Komplexes unter Verwendung neuer, in der Literatur beschriebener Fingerprintmethoden. 3. Suche nach spezifischen PCR-Primern zur direkten Identifizierung der Schaderregerpilze aus infizierten Pflanzenwurzeln. 3. Stand der Realisierung 3.1. Überblick zu den durchgeführten Untersuchungen Identifizierung und Differenzierung mit der RAPD-PCR 1. Schritt: Ausweitung und Vertiefung der Differenzierung mittels RAPD-PCR Zunächst sollte anhand der Ausdehnung der Untersuchungen auf 1076 Isolate unterschiedlicher geographischer Herkunft aus eigenen Freilanderhebungen bzw. internationalen Stammsammlungen die im ersten Projektabschnitt (AU 120/1-1) gefundene Eingruppierung der Pilzisolate nach RAPD- PCR-Hauptmustergruppen A und B (1. Zwischenbericht) überprüft werden. Darüber hinaus war die Möglichkeit zur weiteren Subklassifizierung ausgewählter Hauptmustergruppen zu testen. 2. Schritt: Zuordnung der Isolate zu Arten und Varietäten a) Vergleich mit anderen molekulargenetischen Methoden Im Rahmen einer Kooperation mit dem IACR Rothamsted wurden verschiedene, unterschiedlich selektive DNA-Fingerprintmethoden, wie z.b. die Amplifikation und Restriktionsanalyse von rdna Bereichen (ITS) und ein Screening mit Hilfe einer rdna-sonde zur Verifizierung der Ergebnisse der RAPD-PCR und zur Zuordnung der gefundenen Isolategruppen zu Arten und Varietäten angewendet. Es zeigte sich zunächst, daß die Befunde der verglichenen Methoden gut übereinstimmten. b) Vergleich mit klassischen Differenzierungsmethoden und Präzisierung der Zuordnung Die mit der RAPD-PCR erhaltenen Differenzierungsergebnisse wurden mit Befunden aus klassischen morphologischen und physiologischen Untersuchungen verglichen. Insbesondere bei den Isolaten von G. graminis var. tritici und graminis zeigte sich eine höhere Variabilität in der Pathogenität gegenüber jungen Weizenpflanzen als bisher bekannt. Um die Ursachen hierfür in Zukunft schneller und präziser aufklären zu können, wurde mit dem Institut für Rhizosphärenforschung und Pflanzenernährung im ZALF begonnen, zusätzlich einen Schnelltest 5

6 zur Einschätzung der Pathogenität der Pilzisolate anhand der enzymatischen Abwehrreaktion der Pflanzen (Peroxidaseaktivität gegenüber Pilzinfektion) zu entwickeln. 3. Schritt: Verifizierung der intravarietalen Subklassifizierung und Charakterisierung der räumlicher Verteilung der spezifischen Untergruppen (Testversuche) Die nach Anwendung der RAPD-PCR vorgenommene, detailliertere Untergruppierung von G. graminis var. tritici wurde mit Ergebnissen der Differenzierung aus Hybridisierungsexperimenten mittels einer rdna-sonde von WARD & GRAY (1992) verglichen. Darüber hinaus wurde getestet, ob sich dieses Verfahren zur Ermittlung des Einflusses von Standort- und Bewirtschaftungsfaktoren auf die räumliche Verbreitung diverser Haupt- und Untergruppen des G/P-Komplexes eignet Entwicklung einer Schnellidentifizierungsmethode Es wurde geprüft, ob es auf der Grundlage der Amplifikation eines spezifischen ITS-5,8S- Fragments und anschließender Restriktionsanalyse dieser Region möglich ist, die verschiedenen Arten und Varietäten der Pilze des G/P-Komplexes direkt im infizierten Wurzelgewebe schnell nachzuweisen und zu differenzieren Untersuchungsobjekte, -verfahren und -methoden Untersuchte Pilzisolate: Insgesamt wurden 1076 Isolate des Gaeumannomyces/Phialophora- Komplexes getestet. Davon entstammten 1042 Isolate Weizen-, Roggen- und Gerstenpflanzen von verschiedenen Versuchsstandorten in Nordostdeutschland (eigene Stammsammlung), 34 Isolate der Stammsammlung des Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS) bzw. der Stammsammlung des IACR Rothamsted (GPDATA collection of soil-borne fungi). Als Kontrollstämme fanden Pilze der Gattungen Phoma, Alternaria, Fusarium, Trichoderma und Selenophoma Verwendung. Molekulargenetische Charakterisierung der Pilzisolate DNA-Isolation: Als Ausgangsmaterial für die PCR-Analysen diente von Agarplatten gewonnenes Pilzmycel oder mit Pilzen des G/P-Komplexes infizierte Pflanzenwurzeln. In beiden Fällen erfolgte die Extraktion der DNA nach GARDES et al. (1991). Die Pilz-DNA für die Hybridisierungsexperimente wurde nach einer Methode von LEE & TAYLOR (1990) aus Flüssigkulturen gewonnen. PCR-Analysen: 6

7 1. RAPD-PCR: Die entsprechenden Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Der Reaktionsansatz beinhaltet ng Pilz-DNA, 1 x Standard Polymerase- Puffer, je 0,2 mm Deoxynukleotidtriphosphate, 1,75 mm Magnesiumchlorid, 25 pmol Dekamerprimer und 2,5 U Taq DNA Polymerase (Promega, Madison USA). Die Amplifikation wurde in einem OmniGene (Hybaid) Thermocycler nach folgendem Programm durchgeführt: Anfangsdenaturierung 3 min bei 95, 40 Cyclen zu je 20 s bei 93 C, 60 s bei 36 C und 90 s bei 72 C, zum Abschluß 6 min bei 72 C. Die PCR-Produkte wurden in 2%igen Agarosegelen aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Als Längenstandard diente der Marker VI (Boehringer Mannheim). 2. Alternative DNA-Fingerprintmethoden: Die Amplifikation der ITS-Region erfolgte mit den Primern ITS4/ITS5 nach der Methode von WARD & AKROFI (1994). Die amplifizierten rdna- Fragmente wurden mit DdeI verdaut und in Agarosegelen aufgetrennt. Die Amplifikation mit den Primern KS1F/KS2R wurde nach einer Vorschrift von WARD (1995) durchgeführt. Zur Amplifikation mit den Primern psndna2p/pits4 fand die Reaktionsvorschrift von BRYAN et al. (1995) in modifizierter Form Verwendung. So wurde die Annealingtemperatur von 50 auf 56 C erhöht und zu Reaktionsbeginn eine Anfangsdenaturierung (5 min bei 94 C) durchgeführt. Restriktionsanalysen: Zur Verdauung der amplifizierten Produkte fanden gemäß den vom Hersteller vorgeschriebenen Prozeduren folgenden Restriktionsenzyme Verwendung: AluI, HinfI, MspI, TaqI, ScrF, CfoI, HaeIII und DdeI. Die Fragmente wurden in 3%igen Metaphor-Agarose- Gelen (Biozym) aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Als Längenstandard dienten die Marker V und VI (Boehringer Mannheim). Southern Hybridisierung: Die Pilz-DNA wurde mit EcoRI gespalten und in 0,8%igen Agarosegelen aufgetrennt. Anschließend wurde die DNA durch Vakuum-Blotting auf Nylon- Membranen übertragen. Als Sonde fand ein mitochondriales rdna-fragment (WARD & GRAY, 1992) Verwendung. Die Hybridisierung erfolgte mit dem Digoxigenin (DIG) labelling and detection system (Boehringer Mannheim). Morphologische und physiologische Parameter zur Charakterisierung der Pilzisolate Zur Bestimmung der Form der Hyphopodien fanden mikroskopische Untersuchungen an den Coleoptilen und an der äußeren Wurzelschicht von 4-6 Wochen alten infizierten Weizenpflanzen statt. Alle Pilzisolate wurden auf der Basis der drei Hauptformen der Hyphopodien (einfach, leicht gelappt und gelappt) eingruppiert (WALKER, 1980). 7

8 Zusätzlich erfolgte die Testung der Reaktion der Pilzisolate auf einem für G. graminis var. tritici spezifischen Selektivmedium (SM-GGT3) nach JUHNKE et al. (1984), bei welchem jedoch auf die Zugabe von 1-(3,5-dichlorophenyl)-3-methoxymethylpyrrolydin-2,4-dion (Hoe00703) verzichtet wurde. Charakterisierung der Pathogenität der Pilzisolate Die Pathogenität der Isolate wurde mit Hilfe eines standardisierten Tests (AUGUSTIN, 1989) unter Verwendung junger Weizenpflanzen (Sommerweizen Sorte Mario ) ermittelt. Um zukünftig schneller Aussagen zur Pathogenität der einzelnen Pilzisolate zu erhalten, wurde die enzymatische Abwehrreaktion anhand der Messung der Peroxidase-Aktivität näher untersucht. Hierzu erfolgte zunächst die Anzucht der Pflanzen und Pilzisolate wie im o. g. standardisierten Testverfahren. Nach 14tägiger Anzucht wurde begonnen, jeweils einen Teil der Pflanzen wöchentlich zu ernten und die Peroxydaseaktivität zu ermitteln. Dazu wurden die Pflanzenwurzeln in Extraktionspuffer (3ml/g Frischgewicht, 2 M NaCl in 50 mm Tris-HCl, ph 8,0) gemörsert und anschließend deren Peroxidaseaktivität nach einer Methode von MAEDER et al. (1977) photometrisch bestimmt Ergebnisse Inter- und intravarietale Differenzierung der Isolate des G/P- Komplex mittels RAPD-PCR Wie bereits erwähnt, sollten im zweiten Projektteil durch die kombinierte Analyse mit den im ersten Untersuchungsabschnitt ausgewählten Dekamerprimern OPB-06, OPB-07 und OPB-17 eine große Anzahl weiterer Feldisolate des G/P-Komplexes bzw. Isolate aus internationalen Stammsammlungen charakterisiert werden. Im Ergebnis dieser Untersuchungen war es möglich, neben den im ersten Projektabschnitt gefundenen Gruppen A und B drei weitere Hauptmustergruppen (C, D und E) eindeutig zu differenzieren (Abb. 1-3, Tab.1, Anhang). Es zeigte sich darüber hinaus, daß die verwendeten Primer in sehr differenzierter Weise zur inter- und intravarietalen Charakterisierung der untersuchten Pilzisolate beitrugen. Mit Hilfe der Primer OPB-07 (Abb. 1) bzw. OPB-17 (nicht gezeigt) konnten jeweils 5, für beide Primer hinsichtlich der Isolateeinteilung identische Mustergruppen mit charakteristischen Banden bzw. Bandenmustern gefunden werden. Zusätzlich erlauben diese Primer eine Subklassifizierung bestimmter Gruppen innerhalb der Hauptmustergruppen anhand von weiteren charakteristischen 8

9 Banden. Für die Hauptgruppe A ergab sich z. B. aus entsprechenden Analysen eine Unterteilung in die Untergruppen A1 und A2 und innerhalb der A1-Isolate eine Aufgliederung in die Sondertypen A1-600, A1 3 und A1 4 (Abb. 2). Mit dem Primer OPB-06 wurden 4 Hauptmustergruppen gefunden, die mit den unter Verwendung der Primer OPB-17 bzw. OPB-07 ermittelten Gruppen A, B, D und E übereinstimmen (Abb. 3). Die Isolate der Hauptgruppe C konnten zwar ebenfalls von denjenigen der anderen Hauptgruppen unterschieden werden, sie wiesen aber beim Einsatz dieses Primers kein einheitliches Bandenmuster auf. Dennoch eignet sich auch dieser Primer zur intravarietalen Differenzierung. Mit seiner Hilfe wurde ein als A2 10 bezeichneter, spezieller Typ der A-Isolate gefunden (Abb. 2). Im übrigen konnten alle mit dem Primer OPB-06 als A2 10 -Typ identifizierten Pilzisolate durch Analysen mit dem Primer OPB-07 als typische A2-Isolate bestätigt werden. Ausgehend von diesen Befunden dürfte sich der Primer OPB-06 auch zur weiteren Subklassifizierung der Gruppen B und D verwenden lassen. Abb. 1: RAPD-PCR Muster von Isolaten des G/P-Komplexes nach Amplifikation mit dem Primer OPB 07. Spur 1-4: Hauptmustergruppe A (Ggt)- Isolate: 57.5, , G33, G163. Spur 5-8: Hauptmustergruppe B (Ggg) - Isolate: 16.3, G165, G197, G227 Spur 9-12: Hauptmustergruppe C (Gga) - Isolate: 179, 175, PO86/441, ABL2 Spur Hauptmustergruppe D (Gc/Pg) - Isolate: 541-1bc, c1, a, P7 Spur Hauptmustergruppe E (neu) - Isolate: K7, K8/2, K11/2, K4 Als Größenstandard wurde der Marker VI (Boehringer-Mannheim) verwendet. 9

10 Abb. 2: Subklassifizierung der Isolate von G. graminis var. tritici mit den Primern OPB 06 und OPB 07. Die Pfeile kennzeichnen die charakteristischen Banden, die zur Differenzierung der entsprechenden Untergruppen genutzt werden. Als Größenstandard wurde der Marker VI (Boehringer-Mannheim) verwendet. Abb. 3: RAPD-PCR Muster von Isolaten des G/P-Komplexes nach Amplifikation mit dem Primer OPB 06. Spur 1-4: Hauptmustergruppe A (Ggt) - Isolate: G33, 41.3, 7.3, Spur 5-8: Hauptmustergruppe B (Ggg) - Isolate: 60.2, 64.4, 16.3, Spur 9-12: Hauptmustergruppe C (Gga) - Isolate: A2, ABL2, PO86/441, PO86/439. Spur Hauptmustergruppe D (Gc/Pg) - Isolate: c1, a, 96/1-2b, 96/2-2. Spur Hauptmustergruppe E (neu) - Isolate: K7, K8/2, K11/2, K4 Als Größenstandard wurde der Marker VI (Boehringer-Mannheim) verwendet. 10

11 Zuordnung der mit der RAPD-PCR gefundenen Hauptmustergruppen zu Arten und Varietäten des G/P-Komplexes und Vergleich mit anderen Differenzierungsmethoden Vergleich der RAPD-PCR mit anderen DNA-Fingerprintmethoden (Kooperation mit dem IACR Rothamsted) und taxonomische Zuordnung Um die mittels RAPD-PCR gefundenen Hauptmustergruppen taxonomischen Einheiten der Pilze des G/P-Komplexes (Arten und Varietäten) zuordnen zu können, wurden typische Vertreter aller Gruppen und Untergruppen mit Hilfe weiterer bekannter DNA-Fingerprintmethoden analysiert. Wesentliche Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 1 (Anhang) dargestellt. Mit Hilfe der spezifischen Primer KS1F/KS2R (SCHESSER et al., 1991), konnten zunächst die gegenüber Weizen pathogenen Varietäten Gaeumannomyces graminis var. tritici und Gaeumannomyces graminis var. avenae (Ggt und Gga) anhand charakteristischer Bandengrößen klar von der diesbezüglich apathogenen Varietät Gaeumannomyces graminis var. graminis (Ggg) unterschieden werden. So verbergen sich hinter den unter Verwendung der RAPD-PCR festgestellten Hauptgruppen A und C mit hoher Wahrscheinlichkeit Vertreter der Varietäten tritici oder avenae (Tab.1, Anhang), da alle hier eingeordneten Isolate nach der Amplifikation die für die genannten Varietäten charakteristische Bande von 600 bp (WARD, 1995) aufwiesen. Analog dazu scheint es sich bei den Isolaten der Gruppe B wegen der für sie typischen, um eine Größenordnung von 500bp variierenden Bande, nach WARD (1995) um charakteristische Repräsentanten der Varietät graminis zu handeln. Zur weiteren Differenzierung wurden die Isolate speziellen Analysen auf Basis der Amplifikation mit den Primern ITS4/ITS5 und nachfolgender Restriktionsanalyse der nichtkodierenden Bereiche der rdna (ITS) und der 5.8S rdna (WARD & AKROFI, 1994) unterzogen. Die RFLP-Analyse dieser Region ermöglichte sowohl die Unterscheidung zwischen den Varietäten von G. graminis als auch zwischen G. graminis und G. cylindrosporus/p. graminicola. Insgesamt ergibt sich aus dem Vergleich der Ergebnisse all dieser Analysen folgende Zuordnung der RAPD-PCR-Hauptgruppen zu taxonomischen Einheiten des G/P-Komplexes: Die Isolate der RAPD-PCR-Gruppe A gehören der Varietät G. graminis var. tritici an, die Pilze der Gruppe B können der Varietät G. graminis var. graminis/p. sp. (lobed hyphopodia) zugeordnet werden. Die Gruppe C entspricht der Varietät G. graminis var. avenae und die Isolate der Gruppe D gehören der Art G. cylindrosporus/p. graminicola an. Lediglich die Isolate der Gruppe E ließen sich keiner bekannten Art bzw. Varietät des G/P-Komplexes zuordnen. Verschiedene Indizien deuten darauf 11

12 hin, daß es sich hierbei möglicherweise um eine bisher noch nicht beschriebene Gaeumannomyces- Gruppe handeln könnnte (vgl. Abschnitt ) Vergleich der RAPD-PCR-Analysen mit Untersuchungen zur Morphologie, Physiologie und Pathogenität der Pilzisolate Parallel zu der unter dargestellten Verwendung alternativer DNA-Fingerprintmethoden wurden die Ergebnisse der RAPD-PCR-Analysen mit Hilfe bewährter Verfahren zur Charakterisierung morphologischer und physiologischer Merkmale (Hyphopodienform und Selektivmediumtest) und der Pathogenität der Isolate verglichen. Hierbei ging es nicht zuletzt um die Überprüfung der unter Verwendung herkömmlicher Verfahren vorgenommenen Zuordnung der Pilzisolate zu taxonomischen Einheiten des G/P-Komplexes. Es zeigte sich, daß die mit verschiedenen Methoden gewonnenen Resultate nur geringfügig voneinander abwichen (Tab.1, Anhang). Für die Hauptgruppen B, C und D stimmten die Ergebnisse der taxonomischen Klassfizierung auf der Grundlage der Form ihrer Hyphopodien nach WALKER (1981) mit denen aus molekulargenetischen Untersuchungen vollständig überein. Alle Isolate der Gruppe B (Ggg) wiesen deutlich gelappte Hyphopodien, alle Isolate der Gruppe C (Gga) einfache und alle Isolate der Gruppe D (G. cylindrosporus/p. graminicola) leicht gelappte Hyphopodien auf. In ähnlicher Weise gilt das auch für die mit Hilfe des physiologischen Farbtestes auf dem modifizierten Selektivmedium SM-GGT3 (JUHNKE et al.,1984) erzielten Befunde. So reagierten im Farbtest alle Isolate der Gruppen A und C (Varietäten Ggt und Gga ) positiv (Braunfärbung), während sämtliche Isolate der Gruppen B, D und E keine Verfärbung des Mediums hervorriefen. An jungen Weizenpflanzen durchgeführte Pathogenitätsuntersuchungen ließen erkennen, daß die Gruppen A und C (Ggt bzw. Gga) überwiegend Isolate stark variabler Pathogenität enthielten. Demgegenüber erwiesen sich die Isolate der RAPD-PCR-Gruppe D (G. cylindrosporus/p. graminicola) wie erwartet als durchgehend apathogen. Analog zu den Befunden im ersten Zwischenbericht und in Übereinstimmung mit den Resultaten anderer Autoren (WARD & AKROFI, 1994; BRYAN et al., 1995) ergaben sich nur in solchen Fällen, wo die phänotypische Differenzierung wegen der hohen Variabilität der untersuchten Merkmale zu keinen schlüssigen Ergebnissen geführt hatte, Korrekturen in der bisherigen Zuordnung der Isolate. So ließ sich z. B. das Hafer infizierende Isolat 180, das aufgrund seiner kurzen Ascosporen bislang Ggt zugerechnet wurde (WARD & GRAY, 1992), mit Hilfe der verwendeten DNA-Fingerprintmethoden eindeutig als Vertreter von Gga identifizieren. Damit fand auch die Auffassung von YEATES (1986), daß sich die Ascosporenlänge wegen der Überlappung der Größenbereiche bei Ggt und Gga nur begrenzt zur Klassifizierung der Isolate des G/P-Komplexes eignet, ihre Bestätigung. Das gleiche trifft im Grunde genommen auch für die Merkmalskombination Hyphopodienform/Pathogenität zu. 12

13 Dementsprechend gehört z. B. Isolat G2 (CBS), das wegen seiner für Ggg als charakteristisch angesehenen, gelappten Hyphopodien bisher dieser Varietät zugeordnet war (WALKER, 1980), infolge der Ergebnisse der molekulargenetischen Analysen der Varietät Ggt an. Diese Zuordnung stimmt im übrigen viel besser mit dem physiologischen Profil dieses Isolates und seiner pathogenen Wirkung auf Weizen überein. Nach Beobachtungen von NILSSEN (1972) und eigenen Befunden (z. B. Isolat G163) weisen auch andere Vertreter der Varietät Ggt diese relativ ungewöhnliche Merkmalskombination auf. Auch für die durch extrem große Variabilität in der Pathogenität gekennzeichneten Isolate von G. graminis var. graminis/phialophora sp. (WARD & GRAY, 1992; ELLIOTT et al., 1993; WARD & AKROFI, 1994; FOULY et al., 1996) erbrachten die molekulargenetischen Methoden größere Klarheit bezüglich der tatsächlich ihr zugehörigen Isolate. Ingesamt erlaubte die RAPD-PCR nur in wenigen Fällen keine sichere Zuordnung der untersuchten Isolate des G/P-Komplexes. Solche Ausnahmen stellen die Isolate 122, G1 und P1 dar, für die bislang widersprüchliche Befunde vorliegen (vgl. Tab.1). Als Ursachen kommen neben den durch zu lange Lagerung bedingten Veränderungen an den Isolaten auch ursprüngliche Fehlbestimmungen in Frage. Im Hinblick auf zukünftige Untersuchungen zur Erkennung der Zusammenhänge zwischen genetischer Determination und phänotypischer Ausprägung phytopathogener Merkmale wurde zusätzlich mit der Entwicklung eines Schnelltestes zur Einschätzung der Pathogenität von Pilzisolaten des G/P-Komplexes begonnen (Kooperation mit dem Institut für Rhizosphärenforschung und Pflanzenernährung des ZALF). Ausgangspunkt dafür war die Beobachtung, daß bei der Bildung von Lignitubers als typische Abwehrreaktion der Pflanzen gegenüber den Pilzen des G/P-Komplexes deutliche Unterschiede in deren Art, Form und Anzahl auftraten. Es ist bekannt, daß die Enzymgruppe der Peroxidasen maßgeblich in diese Abwehrreaktionen (Bildung von Lignin) involviert ist (YOUNG et al. 1995). Sollten sich enge Beziehungen zwischen Intensität der Ligninausbildung und den Peroxidaseaktivitäten nachweisen lassen, bestände die Möglichkeit mit Hilfe eines leicht handhabbaren Enzymtestes die Pathogenität der Pilzisolate schnell und präzise einzuschätzen. Wie die Ergebnisse zeigen, ergaben sich bereits nach zwei Wochen zwischen den einzelnen pilzlichen Behandlungsvarianten signifikante Unterschiede in der Wurzelmassebildung und der Peroxidase-Aktivität (Abb.4). Über die Zeit (6 Untersuchungswochen) verändert sich die Enzymaktivität nur unwesentlich (Abb. 5). Insgesamt konnte eine enge Beziehung zwischen der Stärke der Pathogenität (Reduzierung der Wurzelmasse) und der Steigerung der Peroxidaseaktivität 13

14 nachgewiesen werden (Korrelationskoeffizient-0,7 bis -0,9). Demzufolge scheint die Bestimmung der Peroxidaseaktivität der befallenen Pflanzen tatsächlich eine attraktive Methode zur schnellen Einschätzung der Pathogenität der Pilzisolate darzustellen. Dieser Befund stimmt im übrigen mit Literaturergebnissen zu inkompatiblen Reaktionen zwischen Pflanze und Pathogenen überein (z. B. KERBY und SOMMERVILLE, 1990; REIMERS et al., 1992). 0,7 0,6 d d bc c 0,08 0,07 Wurzelfrischmasse in g 0,5 0,4 0,3 0,2 a b c a ab b 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 Delta Peroxidaseaktivität 0,1 a a 0,01 Wurzelfrischmasse 0 0 Delta Peroxidaseaktivität Kontrolle G139 G142 G174 G227 G33 Varianten R. Remus, ZALF, Inst. Rhizosphährenforschung Abb. 4: Einschätzung der Abwehrreaktion von junger Weizenpflanzen anhand der Beziehung zwischen Wurzelfrischmasse und Peroxidaseaktivität zwei Wochen nach Infektion mit unterschiedlich pathogenen G. graminis Isolaten. 14

15 0,08 0,07 Delta Peroxidaseaktivität 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0, Messung 3. Messung 2. Messung 1. Messung G139 G142 G174 G227 G33 Kontrolle Varianten R. Remus, ZALF, Inst. Rhizosphärenforsch. Abb. 5: Veränderung der Peroxidaseaktivität in den Wurzeln junger Weizenpflanzen nach Infektion mit unterschiedlich pathogenen G. graminis-isolaten. Über einen Zeitraum von 6 Wochen (1. Messung in 2. Woche) Charakterisierung der Stellung der neu identifizierten Hauptgruppe E innerhalb des G/P-Komplexes Wie unter dargestellt, zeigten sieben, auf Feldversuchen der Universität Kiel gewonnene Pilzisolate, ein von den anderen 4 RAPD-PCR-Gruppen stark differentes Bandenmuster (Abb. 1+3). Da die PCR-Muster der genannten Isolate jedoch hohe Übereinstimmungen aufwiesen, wurden sie gemeinsam einer vorläufig mit E bezeichneten Gruppe zugeordnet. Daß es sich bei diesen Isolaten tatsächlich um Vertreter des G/P-Komplexes handeln muß, ging aus Untersuchungen zur Amplifikation der ITS-Region mit den Primern psndna2p/pits4 (BRYAN et al., 1995) hervor. Es konnte das für die G. graminis-isolate typische, 650 bp große Fragment gefunden werden. Analogien in der negativen Reaktion im physiologischen Farbtest nach JUHNKE et al. (1984), deuteten zunächst auf eine nahe Verwandschaft der Isolate der Hauptgruppe E mit G. graminis var. graminis und G. cylindrosporus/p. graminicola hin (vgl ). Um dies zu überprüfen, wurde die amplifizierte ITS-Region der E-Isolate mit den Enzymen AluI, HinfI, MspI, TaqI, ScrF, CfoI, HaeIII und DdeI gespalten und die Restriktionsmuster mit denen der 3 Varietäten von G. graminis sowie von G. cylindrosporus/p. graminicola verglichen. Im Anschluß daran konnte unter Verwendung der Methode von NEI & LI (1979) anhand des Anteils gemeinsamer 15

16 Restriktionsfragmente der PCR-Produkte der einzelnen Stämme die relative genetische Distanz der ITS-Region zwischen den Vertretern des G/P-Komplexes abgeschätzt werden (Tab. 2). Tabelle 2. Matrix der paarweisen genetischen Distanzen zwischen den ITS-Genotypen des Gaeumannomyces/ Phialophora-Komplexes a a Die Zahlen über der Diagonale repräsentieren den Anteil der gemeinsamen Fragmente in Bezug auf die jeweilige Gesamtzahl der Banden zwischen den Genotyppaaren. Die Zahlen unter der Diagonale repräsentieren die abgeschätzten genetischen Distanzen (in %) nach Nei und Li (1979). Wie die Analyse zeigt, besteht die geringste genetische Distanz der Isolate der RAPD-PCR-Gruppe E zu Ggg, gefolgt von Ggt, G. cylindrosporus/p. graminicola und Gga. Hierbei ist jedoch zu beachten, daß der genetische Abstand zwischen den E-Isolaten und denen von Ggg wesentlich größer ist als der Abstand innerhalb der drei Varietäten von G. graminis. Die in Tab. 2 dargestellten genetischen Distanzen konnten des weiteren für die Konstruktion eines Phylogramms nach der UPGMA 2 -Methode genutzt werden (Abb. 6). Auch hier wird deutlich sichtbar, daß die E- Isolate verwandtschaftlich zwischen den drei Varietäten von G. graminis und der Art G. cylindrosporus/p. graminicola liegen müssen. Nachfolgende Vergleiche mit Restriktionsmustern, die anhand von DNA-Sequenzdaten (EMBL/Genebank) erzeugt wurden, zeigten, daß ebenso keine vollständige Übereinstimmung mit den nahe verwandten Pilzen Gaeumannomyce incrustans und Magnaporthe grisea besteht. Aufgrund fehlender Sequenzdaten und Referenzstämme war es bislang nicht möglich, die Isolate der Gruppe E mit Gaeumannomyces leptosporus und Gaeumannomyces caricis zu vergleichen. Eine nähere Verwandschaft der Isolate aus der E-Gruppe mit diesen Arten erscheint jedoch eher unwahrscheinlich, kommt doch G. leptosporus (Ophioceras leptosporum) vorrangig saprophytisch an totem Pflanzenmaterial, z.b. von Umbelliferae, vor und beschränkt sich G. caricis auf die Infektion von Cyperaceae (WALKER, 1980). 2 Unweighted pair group average (SNEATH & SOKAL, 1973) 16

17 Abb. 6: Darstellung der Verwandtschaftsbeziehungen der ITS-rDNA-Genotypen der Arten und Varietäten des G/P- Komplexes zur Hauptmustergruppe E (phylogenetischer Baum). Insgesamt legen die bisher gewonnenen Resultate den Verdacht nahe, daß die Hauptgruppe E eine bislang noch nicht beschriebene Gaeumannomyces-Gruppe repräsentiert. Zur Überprüfung dieser Vermutung bedarf es jedoch weitergehender Experimente. Darin müssen neben molekulargenetischen Analysen Untersuchungen zur Physiologie, Morphologie, Pathogenität und zum Wirtsspektrum der Isolate der E-Gruppe enthalten sein Überprüfung der Eignung der RAPD-PCR zur intravarietalen Differenzierung und zur Charakterisierung der räumlichen Verteilung der Pilze des G/P- Komplexes Verifizierung der mittels RAPD-PCR bestimmten intravarietalen Untergruppierungen Zur Überprüfung der mit Hilfe der RAPD-PCR erzielten Ergebnisse zur Subklassifizierung der Hauptgruppe A fanden analoge Analysen unter Anwendung der speziell bei der intravarietalen Differenzierung von Ggt bewährten, ribosomalen DNA-Sonde GggMR1 (WARD & GRAY, 1992) statt. Wie die Untersuchungen ergaben, stimmten die mit beiden Methoden erhaltenen Befunde zur Klassifizierung der Ggt-Isolate eindeutig überein. Alle Isolate, die sich nach RFLP-Analyse unter Verwendung der rdna-sonde GggMR1 als Typ T1 kennzeichnen ließen, entsprechen dem RAPD- PCR-Typ A2. Die Isolate des RFLP-Typ T2 sind mit dem RAPD-PCP-Typ A1 identisch. Zugleich konnte aber auch festgestelllt werden, daß die RAPD-PCR ein höheres Auflösungsvermögen als die ribosomale Sonde besitzt, denn die Verwendung der Sonde gestattete anders als die RAPD- PCR keine weitere Differenzierung der Isolate innerhalb der Untergruppen (vgl. Abschnitt ). 17

18 Erprobung der RAPD-PCR zur Charakterisierung der räumlichen Verbreitung der differenzierten Haupt- und Untergruppen des G/P-Komplexes Um herauszufinden, ob sich die RAPD-PCR für die in Zukunft geplanten Ermittlungen zu Wechselbeziehungen zwischen Standort- und Bewirtschaftungsfaktoren und räumlicher Verbreitung diverser Haupt- und Untergruppen des G/P-Komplexes eignet, wurden auf ausgewählten Standorten entsprechende Testexperimente ausgeführt. Nach den ersten Befunden weisen die verschiedenen molekulargenetisch differenzierten Pilzgruppen des G/P-Komplexes bezüglich ihrer geographischen Verteilung ein stark differierendes Erscheinungsbild auf. Verschiedene Indizien deuten zudem auf ein komplexes, aber durchaus charakteristisches Reaktionsmuster einzelner Untergruppen hin. So scheinen die phytopathologisch bedeutsamen RAPD-PCR-Hauptgruppen A und B (Ggt und Ggg) inklusive ihrer Untergruppen A1 und A2 prinzipiell überall in Europa vorzukommen. Andererseits reagierten aber speziell die Untergruppen A1 und A2 bzw. die in ihnen enthaltenen Sondertypen an ausgwählten Meßpunkten über einen längeren Zeitraum ganz individuell auf Veränderungen in der Anbaufolge der Wirtspflanzen im Kontext mit spezifischen, bislang nur zum Teil identifizierten Standortparametern (Tab 3). Ingesamt wurde bei den Untersuchungen deutlich, daß sich RAPD-PCR gut zur Aufklärung derartiger Zusammenhänge eignet. Tab. 3: Auftreten der RAPD-PCR-Hauptmustergruppen, einschließlich ihrer Untergruppen in Abhängigkeit von der Anbaufolge (Angaben in %, WR = Winterroggen). Termin Vor- Haupt- Hauptgruppe Untergruppe Sondertypen A1 Sondertypen A2 frucht frucht A B A1 A2 A1 n A1 3 A1 4 A1 600 A2 n A2 10 Jun 96 Brache WR Nov 96 WR WR Mrz 97 WR WR Jun 97 WR WR Nov 97 WR Brache Schnellidentifizierung der Pilze des G/P-Komplexes direkt aus infizierten Pflanzenwurzeln Wie diesbezügliche Untersuchungen zeigten, ist es über die Amplifikation eines spezifischen rdna-fragments, daß die ITS1/ITS2 Region und das 5.8S Gen einschließt, in Verbindung mit einer anschließenden Restriktionsanalyse der entsprechenden PCR-Produkte möglich geworden, die Schaderreger des G/P-Komplexes direkt in infiziertem Wurzelgewebe nachzuweisen. Bereits 18

19 aufgrund der unterschiedlichen Größe der mit Hilfe der Primer psndna2p und pits4 (BRYAN et al., 1995) amplifizierten ITS-Region konnten alle Isolate der Art G. graminis einschließlich ihrer Varietäten graminis, tritici und avenae klar von den Isolaten der Art G. cylindrosporus/p. graminicola unterschieden werden. In Übereinstimmung mit Ergebnissen von BRYAN et al. (1995) ergab sich für die Vertreter von G. graminis eine Fragmentgröße von 650 bp, während bei G. cylindrosporus/p. graminicola stets ein ca. 670 bp großes Fragment ermittelt wurde. Mittels der nachfolgenden Spaltung der Fragmente mit dem Enzym DdeI ließen sich auch noch die einzelnen Varietäten des G/P-Komplexes anhand von charakteristischen Restriktionsmustern differenzieren (Abb. 7). Abb. 7: Identifizierung und Differenzierung der Pilze des G/P-Komplexes direkt aus infizierten Pflanzenwurzeln durch Restriktionsanalyse einer spezifischen rdna-region. Spur 1, 2: Ggt, Spur 3, 4: Ggg, Spur 5-7: Gga, Spur 8-10: Gc/Pg. V, VI: Größenmarker (Boehringer- Mannheim) Eine Subklassifizierung der Varietäten, wie sie durch die RAPD-PCR gestattet wird, ist allerdings mit Hilfe der RFLP-Analyse dieses rdna-fragments nicht möglich. Dennoch besitzt die Methode den großen Vorteil, daß aufgrund der hohen Spezifität der verwendeten Primer die rdna der Pilze des G/P-Komplexes aus infiziertem Wurzelgewebe sowohl von sterilen Pflanzen als auch von Pflanzen aus Feldversuchen selektiv amplifiziert werden kann. Dadurch entfallen aufwendige Pilz- Isolationsprozeduren und die Herstellung von Reinkulturen. Neben dem direkten Nachweis der entsprechenden Schaderreger aus der Pflanzenwurzel eröffnet die Methode die attraktive Möglichkeit, die Pilze des G/P-Komplexes auch direkt aus Bodenproben, die infiziertes Pflanzenmaterial enthalten, zu identifizieren und zu differenzieren. 4. Wertung und Ausblick 19

20 4.1. Wertung und Schlußfolgerung für die Weiterführung der Arbeiten Die Ergebnisse der Untersuchungen haben zunächst einmal deutlich gemacht, daß es sich bei der RAPD-PCR-Technik um ein präzises und zuverlässiges Verfahren zur eindeutigen Differenzierung und Klassifizierung aller dem G/P-Komplex zugehörigen Pilzisolate handelt. Dies wird durch die damit erreichte Klassifizierung von (zumindest) fünf Hauptmustergruppen und die damit mögliche, sehr weitgehende Differenzierung der Isolate auf intravarietaler Ebene belegt. Darüber hinaus hat sich auch die gewählte Vorgehensweise, die mit Hilfe der RAPD-PCR vorgenommen Untersuchungen mit anderen unterschiedlich selektiven molekulargenetischen Differenzierungsmethoden sowie herkömmlichen (morphologischen und physiologischen) Klassifizierungsmethoden zu kombinieren und zu vergleichen, als sehr erfolgreich erwiesen. Zum einen ist es auf diese Weise grundsätzlich möglich geworden, molekulargenetisch differenzierte Hauptmustergruppen der Isolate eindeutig definierten taxonomischen Einheiten (Arten und Varietäten) des G/P-Komplexes zuzuordnen. Darin eingeschlossen ist offensichtlich eine Option zur Identifizierung bislang unbekannter Gaeumannomyces-Gruppen (z. B. Hauptgruppe E, vgl. Abschn ). Damit ist auch klar geworden, daß die mit Hilfe der mittels RAPD-PCR vorgenommene Differenzierung der Isolate des G/P-Komplexes einen eindeutigen phylogenetischen Bezug hat. Zum anderen ergaben sich aus der Kombination der Untersuchungsmethoden günstige Voraussetzungen zur Überprüfung und Präzisierung der bisher vorgenommenen Zuordnungen der Pilzisolate zu Arten-und Varietäten des G/P-Komplexes. Tatsächlich gelang es mit Hilfe molekulargenetischer Identifizierungsverfahren, insbesondere der RAPD-PCR, in wenigen, aber wichtigen Einzelfällen eine korrektere Zuordnung spezieller Isolate (z. B. Eingruppierung der Isolate mit der Merkmalskombination stark pathogen/gelappte Hyphopodien zu G. graminis var. tritici, vgl. Abschn ) zu erreichen. Vor allem aber eröffnet die gezielte Anwendung dieses speziell für die Pilze des G/P-Komplexes angepaßten molekulargenetischen Differenzierungsverfahrens (RAPD-PCR) neue Aussichten zur Klärung verschiedener Fragen im Zusammenhang mit der Entwicklung von Diagnose, Prognose und biologischer Bekämpfung der Schwarzbeinigkeit. Das betrifft vor allem die Aufklärung der Ursachen für die extreme Variabilität der Pathogenität der Isolate und des räumlich-zeitlichen Auftretens der einzelnen Arten, Varietäten und Untergruppen der Pilze des G/P-Komplexes. So müssen zur exakten Beurteilung der phytopathogenen Relevanz der gefundenen Subklassifizierung zunächst die Zusammenhänge zwischen den differenzierten Untergruppen und den in dieser Hinsicht wesentlichen Merkmalsausprägungen geklärt werden. Eine entscheidende Rolle bei der Einschätzung des phytopathogenen Risikopotentials spielt die Ermittlung des spezifischen Virulenzverhaltens der verschiedenen Pilzisolate. Wie anhand der eigenen Ergebnisse deutlich 20

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