Charakterisierung von Transportsignalen bei Endothelinrezeptoren

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1 harakterisierung von Transportsignalen bei ndothelinrezeptoren vorgelegt von Diplom-Biologin Jana Melzer Von der akultät III Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur rlangung des akademischen Grades Doktor der aturwissenschaften Dr. rer. nat. Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. Ulf tahl 1. Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Roland auster 2. Berichter: PD Dr. med. Alexander Oksche Tag der wissenschaftlichen Aussprache: Berlin 2007 D83

2 eopold mil und Guido

3 Danksagung An dieser telle möchte ich mich besonders bei Herrn Prof. Dr. Walter Rosenthal für die Überlassung des spannenden Themas und die Bereitstellung optimaler Arbeitsbedingungen zur Anfertigung dieser Arbeit bedanken. Ich danke vielmals meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. Alexander Oksche, für seine herzliche Betreuung während der Zeit meiner Doktorarbeit und für seine hilfreiche Unterstützung trotz der räumlichen ntfernung in der letzten Phase der ertigstellung. Zudem danke ich allen Mitarbeitern des MP Berlin und des Instituts für Pharmakologie der U Berlin für die tolle Zusammenarbeit und für die schöne Zeit des xperimentierens. Herrn Prof. Dr. Roland auster danke ich für seine unkomplizierte und freundliche Übernahme der Begutachtung dieser Arbeit. Meinen ltern und Geschwistern danke ich für ihre stetige Unterstützung und ihr Vertrauen in mich. Mein Dank gilt auch meinen reunden für die schönen Momente der Ablenkung. Ich danke meinem Mann Guido, der mich stets in allen erdenklichen ituationen liebevoll unterstützt hat. Ohne ihn wäre die ertigstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Und ganz besonders dankbar bin ich für meinen ohn eopold mil, der in allen ebensumständen ein mich wärmender onnenschein ist. I

4 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 ummary 2 1 inleitung G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Rezeptoraktivierung und ignalweiterleitung Desensitivierung von G-Protein-gekopppelten Rezeptoren Rezeptor-vermittelte ndozytose Die ndotheline und ndothelin-rezeptoren Zielsetzung 14 2 Materialien und Methoden Materialien Reagenzien und Verbrauchsmaterialien nzyme und Antikörper ndothelin-rezeptor-iganden Größenstandards und its Verwendete Organismen coli-tämme ukaryontische Zelllinien lonierungsvektoren und Plasmide lonierungsvektoren. coli Plasmide Oligonukleotide Primer zur equenzierung Primer zur lonierung Mutageneseprimer Methoden Zellkultur und Transfektion ultivierung von H293- und M-Zellen Transfektion infrieren und Auftauen von Zellklonen ultivierung und onservierung von. coli-tämmen Antibiotika und andere Mediumzusätze Herstellung kompetenter Bakterien Transformation von. coli mit Plasmid-DA Präparation von Plasmid-DA paltung der DA mit Restriktionsenzymen Generierung von blunt ends bei linearen DA-ragmenten Dephosphorylierung von DA-ragmenten igation von DA-ragmenten ällung der DA DA-onzentrationsbestimmung Agarosegelelektrophorese lution von DA-ragmenten aus Agarosegelen equenzierung von Plasmid-DA Polymerasekettenreaktion (PR) Ortsgerichtete Mutagenese D-Polyacrylamidgelelektrophorese oomassie-ärbung Immunoblot Bestimmung der Proteinkonzentration Überexpression und Aufreinigung von GT-usionsproteinen GT-Pulldown 40 II

5 nzyme-linked-immunosorbent-assay (lisa) Immunopräzipitation Bindungsassay Membranpräparation über Percoll-Gradienten aser-canning-mikroskopie 46 3 rgebnisse Bedeutung des Tyrosin-Motivs im -Terminus des ndothelin-b- Rezeptors für die Internalisierung T B -Rezeptoren mit Aminosäureveränderungen im -Terminus lonierung eines pitops in den -Terminus des T B -Rezeptors tabil exprimierende H293 Zelllinien influss des -Terminus auf die Internalisierung des T B -Rezeptors Untersuchung der Internalisierung mittels IA aser-canning-mikroskopie von H293-Zellklonen Untersuchungen zum lysosomalen Abbau des wildtypischen und des mutierten T B -Rezeptors Identifizierung von Interaktionspartnern des T B -Rezeptors GT-Pulldown onstruktion von GT-usionsproteinen harakterisierung der GT-usionsproteine GT-Pulldown und achweis der Arrestin3-Interaktion o-immunopräzipitation zum achweis der Arrestin3-Interaktion Membranpräparation zum achweis der Arrestin3-Interaktion influss von Arrestin3 auf die Internalisierung des T B -Rezeptors Arrestin-Rekrutierung nach Agoniststimulation des T B -Rezeptors Untersuchung des influsses von Arrestin3 auf die Internalisierung des T B - Rezeptors Internalisierung des T B -Rezeptors in M-Zellen Untersuchung weiterer potentieller ignale im -Terminus des T B - Rezeptors 74 4 Diskussion Identifizierung des Internalisierungssignals Interaktion des T B -Rezeptors mit Arrestin3 und AP Modulation der T B -Rezeptorinternalisierung durch o-xpression von Arrestin und Dynamin Arrestin-unabhängige Internalisierung Intrazelluläre Verteilung des T B -Rezeptors bei -terminalen Veränderungen 89 5 iteraturverzeichnis 90 6 Publikationen Publikationen Posterpräsentationen orschungspreis 100 Abbildungsverzeichnis 101 Tabellenverzeichnis 103 Abkürzungen 104 ebenslauf 106 III

6 Zusammenfassung Zusammenfassung ndothelinrezeptoren (T A - und T B -Rezeptor) vermitteln die physiologischen ffekte von ndothelin 1 (T1), welches einer der stärksten Vasokonstriktoren ist. Beide Rezeptoren gehören zur großen amilie der G- protein-gekoppelten Rezeptoren. s ist bekannt, dass der T A -Rezeptor über den recycling-weg internalisiert und zurück zur Plasmamembran transportiert wird, wohingegen der T B -Rezeptor nach T1-timulation in die ysosomen transportiert und abgebaut wird und einer down-regulation unterliegt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass im -Terminus des T B -Rezeptors ein GYXX-Motiv lokalisiert ist, das für die Internalisierung wichtig ist. Mit Hilfe von IA-xperimenten und aser-canning-mikroskopie (M) an stabilen Zellklonen, die den wildtypischen oder eine mutierte orm des T B - Rezeptors exprimierten, konnte gezeigt werden, dass Mutationen in diesem Motiv zu einer verzögerten Internalisierung nach T1-timulation führen. Dabei ist der Austausch des Tyrosins ausreichend, um die Internalisierung zu vermindern. Das GYXX-Motiv ist auch als lysosomales ortierungsmotiv beschrieben. s konnte jedoch durch low-temperature-pag gezeigt werden, dass der Transport des T B -Rezeptors in ysosomen nicht durch Mutationen in diesem Motiv beeinflusst wird. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Internalisierung des T B - Rezeptors Arrestin-unabhängig verläuft. M an lebenden H293-Zellen, die transient den T B -Rezeptor und Arrestin3.GP co-exprimierten, deutete auf eine schwache Arrestin-Rekrutierung zur Plasmamembran hin. Das Arrestin-ignal war jedoch unter stimulierten Bedingungen nicht erhöht. Jedoch konnte durch M an M-Zellen, die einen knock-out in den Genen für Arrestin2 and Arrestin3 (M-arr2 -/- /arr3 -/- ) aufwiesen, eine Arrestinunabhängige Internalisierung des T B -Rezeptors nachgewiesen werden. Untersuchungen zu weiteren potentiellen Motiven im -Terminus des T B - Rezeptors ergaben, dass ein coiled-coil-motiv influss auf den intrazellulären Transport ausübt. 1

7 ummary ummary ndothelin receptors (T A and T B ) mediate the physiological effects of endothelin 1 (T1) representing one of the most potent vasoconstrictors. Both receptors belong to the large family of G-protein coupled receptors. It is known that the T A receptor utilizes the recycling pathway and re-appears on the plasma membrane, whereas the T B receptor is transported to lysosomes upon T1 stimulation and subsequently degraded and downregulated. In this study it was shown that the -terminus of the T B receptor harbours a GYXX motif which is mainly important for proper internalization. nzyme-linked immunosorbent assay and laser scanning microscopy (M) of cell clones stably expressing wildtype and mutant T B receptors with alteration within this motif revealed a delayed sequestration of mutant receptors upon T1 stimulation. The substitution of a single tyrosine within this motif is sufficient enough reducing the internalization. As the GYXX motif is described as a lysosomal targeting motif, it was shown by lowtemperature D-PAG that the lysosomal trafficking of the T B receptor does not seem to be affected by mutations of this motif. urthermore, the ligand induced internalization of the T B receptor occurred to be independent of arrestin3. The arrestin3 recruitment was analyzed by M of living H293 and cells transiently expressing the T B receptor and arrestin3.gp where only weak recruitment could be detected. Interestingly, the arrestin3 signal was not increased under stimulated conditions. ubsequently, live cell imaging with M of mouse embryonic fibroblasts carrying a double knockout for arrestin2 and arrestin3 (M-arr2 -/- /arr3 -/- ) showed the independence of arrestin3 in the internalization process of the T B receptor. urther analysis of potential sorting motivs within the -terminus of the T B receptor revealed that a coilded-coil motiv may be involved in intracellular trafficking of the receptor. 2

8 inleitung 1 inleitung 1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bilden die größte amilie der membranständigen Rezeptoren. eit ca. 20 Jahren werden sie als eine Proteinfamilie angesehen und untersucht. rst im Jahre 1986 fielen equenzhomologien zwischen zwei physiologisch sehr unterschiedlich wirkenden Rezeptoren dem β2-adrenergen Rezeptor und dem Rhodopsin auf. Auf dieser Basis wurde eine große amilie von diesen Rezeptoren postuliert (Dixon et al. 1986). Die lonierung und equenzanalyse weiterer Vertreter dieser lasse bestärkten diese Theorie (ubo et al. 1986; Dohlman et al. 1987; rielle et al. 1987; Masu et al. 1987). Bis heute sind ca Mitglieder der amilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bekannt (Ji et al. 1998), wobei allein mehrere hundert dem olfaktorischen ystem zugeordnet sind (Buck and Axel 1991). Die Aktivierung dieser Rezeptoren erfolgt durch eine Vielzahl von timuli wie icht, alzium, Duftstoffe oder Pheromone, Aminosäuren, Peptide, ukleotide und Proteine und viele andere mehr (arhammar et al. 1993; Brown et al. 1996; Rozengurt 1998; hichida and Imai 1998; Horn et al. 2003; Gaillard et al. 2004; alazar et al. 2007). Die verschiedenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wurden aufgrund von equenzvergleichen in sechs Rezeptorklassen unterteilt, die untereinander aber keine equenzähnlichkeiten aufweisen. Unter dieser großen Vielzahl von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist das Rhodopsin bis heute der einzige Vertreter, für den die ristallstruktur und somit die räumliche truktur bekannt ist (Palczewski et al. 2000). s ist auch lediglich der inaktive Zustand aufgeklärt, nicht aber der aktivierte Zustand. Die amilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wurde ursprünglich aufgrund von trukturvorhersagen 7-Transmembranrezeptoren genannt (Dohlman et al. 1991; Baldwin 1993). Die Auflösung der truktur des Rhodopsins bestätigte diese Vorhersagen und ergab, dass sieben 3

9 inleitung transmembranäre α-helices im entgegengesetzten Uhrzeigersinn in einem Bündel in der Plasmamembran angeordnet sind, die durch intra- und extrazelluläre chleifen miteinander verbunden sind. ie besitzen außerdem einen extrazellulären Aminoterminus (-Terminus) und einen intrazellulären arboxyterminus (-Terminus) (siehe Abb. 1). H 2 extrazellulär TM 1 TM 2 TM 3 TM 4 TM 5 TM 6 TM 7 α β γ β γ intrazellulär HOO GDP Rezeptorkinasen PI3 A P α s α i α q α 12/13 GTP A GTP A GTP P GTP Rho Abb. 1: chematische Darstellung eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Der aktivierte G-Protein-gekoppelte Rezeptor interagiert über den -Terminus mit einem G-Protein. ach Aktivierung des G-Proteins erfolgt die Trennung der α-untereinheit vom βγ-omplex und verschiedene ignalwege können aktiviert bzw. reprimiert werden, was Veränderungen in den intrazellulären onzentrationen verschiedener Metabolite nach sich zieht. A, Adenylatzyklase; P, Phospholipase ; Rho, Rho-inase; PI3, PI3-inase. Während die transmembranären Regionen hoch konserviert sind, zeigt sich eine deutliche Varianz in den intra- und extrazellulären chleifen sowie in 4

10 inleitung den - und -Termini. Die extrazellulären chleifen sind meist kurz, wohingegen der -Terminus sehr stark in seiner Größe variieren und sehr lang sein kann. Diese Varianz kann die unterschiedlichen igandspezifitäten der Rezeptoren erklären. Auf intrazellulärer eite weisen die 3. intrazelluläre chleife und der -Terminus sehr starke Variationen hinsichtlich ihrer änge auf, welche die unterschiedlichsten Wirkungsweisen verschiedener Rezeptoren innerhalb dieser amilie wiederspiegeln können. Der heute hauptsächlich gebräuchlichere ame der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beschreibt die Tatsache, dass die meisten Mitglieder dieser Rezeptorfamilie heterotrimere G-Proteine aktivieren. Diese G-Proteine sind dann direkt an der ignaltransduktion beteiligt, indem sie ffektorproteine, wie zum Beispiel die Adenylatzyklase oder die Phospholipase, beeinflussen (Gilman 1987; onklin and Bourne 1993; chwindinger and Robishaw 2001). Die heterotrimeren G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten (α, β, γ). Im inaktiven Zustand hat die α-untereinheit ein Guanosindiphosphat (GDP) gebunden woher die Bezeichnung G-Protein (Guanylnukleotid-bindendes Protein) herrührt und ist durch die Assoziation an die βγ-untereinheiten in seiner unktionalität gehemmt (eer 1995; Hamm and Gilchrist 1996) (siehe Abb. 1). 1.2 Rezeptoraktivierung und ignalweiterleitung Die ähigkeit einer Zelle, auf einen äußeren Reiz zu reagieren und diesen in ein intrazelluläres ignal zu übersetzen, beruht auf einen präzisen und doch sehr einfachen Mechanismus der ignaltransduktion. Im alle der ignaltransduktion, die durch G-Protein-gekopptelte Rezeptoren vermittelt wird, bindet ein igand spezifisch an seinen Rezeptor, der die chnittstelle zwischen außen und innen darstellt. Dieser Rezeptor interagiert mit mehreren G-Proteinen, die ihrerseits eine Vielzahl von ffektormolekülen beeinflussen und als olge dessen ein Pool an ignalmolekülen gebildet 5

11 inleitung wird, die sogenannten second messenger. Das ursprüngliche extrazelluläre ignal wird durch die verschiedenen Proteinwechselwirkungen in ein intrazelluläres ignal umgewandelt und während dieses Prozesses amplifiziert. Die Bindung eines iganden (Agonisten) an seinen Rezeptor bewirkt eine onformationsänderung des Rezeptors, wodurch Bindestellen für die Interaktion mit einem G-Protein freigelegt werden (arrens et al. 1996; Bourne 1997; Gether and obilka 1998; Palczewski et al. 2000). An der α- Untereinheit des G-Proteins erfolgt ein schneller Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) durch ein Molekül Guanosintriphosphat (GTP). Dabei wird die Affinität der Untereinheiten zueinander reduziert und es kommt zur Dissoziation des heterotrimeren omplexes in eine Gα- Untereinheit und einen Gβγ-omplex (eer 1995). owohl die GTPgebundene Gα Untereinheit als auch der Gβγ-omplex beeinflussen im olgenden eine Vielzahl von spezifischen ffektormolekülen (wie z. B. die Adenylatzyklase, die Phospholipase oder Rezeptorkinasen). Diese ffektormoleküle sind ihrerseits direkt oder indirekt an der Generierung von ignalmolekülen, die second messenger, beteiligt (Berridge 1993; Divecha and Irvine 1995). Die Inaktivierung der G-Proteine erfolgt durch die Hydrolyse des GTP zu GDP durch die intrinsische GTPase-Aktivität der Gα- Untereinheit. Diese dissoziiert von dem ffektor und es wird die Re- Assoziation der drei Untereinheiten (Gα und Gβγ) eingeleitet. Die ignalkaskade ist somit beendet. Der Vorgang der ignalweiterleitung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren über die G-Proteine kann daher als ein sich selbstregulierender, zyklischer Prozess betrachtet werden (siehe Abb. 2). Die Weiterleitung des ignals über den G-Protein-gekoppelten Rezeptor, weiter zum G-Protein und anschließend zur Generierung der ignalmoleküle entspricht einer Amplifikation des ursprünglichen ignals. Über spezifische Regulation auf jeder einzelnen tufe dieser Amplifikationskaskade kann die Zelle die einregulation der gebildeten second messenger vornehmen, und so gezielt auf ignale/reize reagieren. 6

12 inleitung GTP GDP GDP γ α β 2 α γ β GTP igand 1 3 P i 4 GDP α γ β α γ β GDP Abb. 2: chematische Darstellung der Wirkungsweise der G-Proteine. Die durch die igandbindung (1) induzierte onformationsänderung des Rezeptors ermöglicht die Bindung eines G-Proteins. s erfolgt ein Austausch eines GDP gegen ein GTP (2), welches zur Dissoziation der α-untereinheit und des βγ-omplexes und damit zur Aktivierung des G- Proteins führt. ach der Hydrolyse des GTP zu GDP (3) ist die Re- Assoziation (4) der Untereinheiten möglich und das G-Protein kann den Zyklus erneut durchlaufen. 1.3 Desensitivierung von G-Protein-gekopppelten Rezeptoren Der Prozess der Anpassung eines Rezeptors an einen langandauernden, äußeren timulus wird auch Desensitivierung genannt. Dabei kommt es bei kontinuierlicher Agonistbindung an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor zu einer Abschwächung der durch den Rezeptor vermittelten ignaltransduktion (Hausdorff et al. 1990; arman and Benovic 1998; ohout and efkowitz 2003). Die Agonistbindung und die damit induzierte onformationsänderung des Rezeptors ermöglichen die Rekrutierung von spezifischen G-Proteingekoppelten Rezeptorkinasen zum aktivierten Rezeptor, was zur Phosphorylierung von erin- und/oder Threoninresten in der dritten 7

13 inleitung intrazellulären chleife und/oder dem -Terminus führt (efkowitz 1993; erguson et al. 1996; rupnick and Benovic 1998). Dieser aktivierte und phosphorylierte Rezeptor weist eine hohe Affinität zum Arrestin auf (ohse et al. 1990; ohse et al. 1992). Die Bindung von Arrestin an den aktivierten, phosphorylierten Rezeptor verhindert die Bindung des G-Proteins und unterbricht damit die G-Protein-vermittelte ignalkaskade (Benovic et al. 1987; ohse et al. 1990). Dies resultiert in einer reduzierten Antwort auf den Agonisten. Des Weiteren vermittelt Arrestin auch die opplung von aktivierten Rezeptoren an lathrin-umhüllte Bereiche in der Plasmamembran (Goodman et al. 1996; Oakley et al. 1999; uttrell and efkowitz 2002) und leitet somit die ersten chritte der Rezeptor-vermittelten ndozytose ein. 1.4 Rezeptor-vermittelte ndozytose Der Prozess der Internalisierung ist zum einen wichtig für die Desensitivierung, um aktivierte Rezeptoren vom Ort der G-Protein vermittelten ignalkaskade der Plasmamembran in intrazelluläre Membrankompartimente zu transportieren (Oakley et al. 1999; Trejo and oughlin 1999). Zum anderen ist die Internalisierung aber auch essentiell für die Re-ensitivierung der phosphorylierten, mit dem iganden besetzten Rezeptoren, um diese wieder zu dephosphorylieren und für eine neue igandenbindung verfügbar und durch diese aktivierbar zu machen (Zhang et al. 1997; Anborgh et al. 2000; erguson 2001). Des Weiteren spielt die ndozytose eine wichtige Rolle beim lysosomalen Abbau von aktivierten G- Protein-gekoppelten Rezeptoren, was zum Absinken bzw. zur Herunterregulation der Rezeptorzahl (down-regulation) führt (Bonifacino and Traub 2003; Paing et al. 2004; Ward et al. 2004). ine vereinfachte schematische Übersicht über die Rezeptor-vermittelte ndozytose ist in Abb. 3 dargestellt. 8

14 inleitung Arrestinbindung Phosphorylierung ndozytose Recycling Abbau ysosom nthüllen Abb. 3: chematische Darstellung der Rezeptor-vermittelten ndozytose (Pierce et al. 2002). Die Mechanismen der Internalisierung benötigen eine sehr präzise und differenzierte olge von ortierungsereignissen, die die rkennung und den Transport von Proteinen aus der Plasmamembran zu den ndosomen und den weiteren intrazellulären Transport vermitteln. Die korrekte ortierung basiert auf kleinen Aminosäureabschnitten in den cytosolischen Domänen der transmembranären Proteinen, sogenannte rkennungsmotive. Die zwei wichtigsten lassen von rkennungsmotiven während der ndocytose bilden die Tyrosin- und Di-eucin-basierten ortierungssignale, welche als rkennungsmotive für Adapterproteine, wie dem Plasmamembranassoziierten Adapterprotein-omplex 2 (AP-2), dienen (Marks et al. 1995; Ohno et al. 1995; Bonifacino et al. 1996; Hirst et al. 1999). AP-2 ist zudem eine der Hauptkomponenten der lathrin-vesikel (Jackson et al. 2003). ine spezielle orm des Tyrosin-basierten ortierungssignals bildet das YXXΦ Motiv. Proteine, wie zum Beispiel der Transferrin-Rezeptor und die lysosomalen Membranproteine AMP-1 und AMP-2, benötigen dieses Motiv 9

15 inleitung zur schnellen Internalisierung aus der Plasmamembran in die ndosomen. Im späteren Verlauf des Internalisierungsprozesses finden sich diese Proteine in den späten ndosomen/ysosomen wieder (Williams and ukuda 1990; Harter and Mellman 1992; Gough et al. 1999). 1.5 Die ndotheline und ndothelin-rezeptoren ndotheline (T1, T2 und T3) sind Peptide von 21 Aminosäuren. ndothelin-1 (T1) wurde 1988 entdeckt (Yanagisawa et al. 1988). s ist ein starker Vasokonstriktor und wird von ndothelzellen aber auch von vaskulären Muskelzellen, Makrophagen, ibroblasten und ardiomyozyten gebildet (Miyauchi and Goto 1999). Die Wirkung der ndotheline auf das vaskuläre ystem wird durch spezielle Rezeptoren vermittelt, dem ndothelin-a-rezeptor (T A -Rezeptor) und dem ndothelin-b-rezeptor (T B -Rezeptor) (Arai et al. 1990; akurai et al. 1990; Hosoda et al. 1991; Ogawa et al. 1991). Alle drei ndotheline weisen eine etwa gleich starke Bindungsaffinität zum T B -Rezeptor auf, wohingegen T3 im Vergleich zu T1 und T2 eine deutlich schwächere Affinität zum T A -Rezeptor aufweist (T1 T2 >> T3) (pokes et al. 1989). Beide Rezeptoren gehören zur amilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Während der T A -Rezeptor in glatten Muskelzellen der Blutgefäße exprimiert wird, ist der T B -Rezeptor hauptsächlich in ndothelzellen aber auch in glatten Muskelzellen nachweisbar. Obwohl die Ähnlichkeit beider Rezeptoren auf Proteinebene sehr hoch ist (akurai et al. 1992), sind die physiologischen Reaktionen und intrazellulären ignalwege nach Agoniststimulation sehr unterschiedlich. o führt die timulation mit T1 zunächst zu einer kurzen Vasodilatation (Minuten) gefolgt von einer lang andauernden Vasokonstriktion (tunden). In ndothelzellen resultiert die timulation des T B -Rezeptors in einer Aktivierung der Phospholipase über G q/11 und führt zu einer schnellen Bildung von Inositoltriphosphat (IP-3) und Diacylglycerol (DAG). IP-3 stimuliert die reisetzung von alziumionen (a 2+ ) aus intrazellulären 10

16 inleitung peichern (sarkoplasmatisches Retikulum), wodurch es durch die a 2+ - abhängige endotheliale O-ynthase zur reisetzung von tickstoffmonoxid (O) kommt. Dieses diffundiert in die glatten Muskelzellen und bewirkt eine kurze Vasodilatation (Ignarro et al. 1987; Palmer et al. 1987). DAG und a 2+ - Ionen aktivieren ihrerseits die Proteinkinase, welches die erin/threonin- Phosphorylierung einer Vielzahl von ubstraten nach sich zieht, was unter anderem die Zellproliferation anregt. Bei der timulation des T A -Rezeptors kommt es ebenfalls über G q/11 zur Aktivierung der Phospholipase und somit zum Anstieg der a 2+ - onzentration. s kommt außerdem zur Aktivierung der Rho-inase über G 12/13, was zusammen mit dem gestiegenen a 2+ -onzentration zu einer lang anhaltenden Vasokonstriktion führt (de ucci et al. 1988; eo et al. 1994). Des Weiteren resultiert die timulation des T A -Rezeptors zur Aktivierung der Adenylatzyklase über G s. s kommt zu einer rhöhung des intrazellulären camp-piegels und nach Aktivierung weiterer ignalwege (wie erin/threonin-phosphorylierung verschiedener ubstrate durch die A- inase) resultiert dies in einer Vasokonstriktion. Diesem Prozess wird durch die G i -vermittelte Hemmung der Adenylatzyklase nach timulation des T B - Rezeptors entgegengewirkt. Auch die Internalisierungskaskaden der beiden ndothelinrezeptoren (T A - und T B -Rezeptor) unterscheiden sich erheblich voneinander. Der T A - Rezeptor durchläuft den recycling-weg und wird nach der Internalisierung und dem Transport in die ndosomen wieder zurück an die Zelloberfläche transportiert (Bremnes et al. 2000), wo er einer erneuten timulation durch T1 zur Verfügung steht. Die Tatsache, dass nach kontinuierlicher timulation mit T1 eine lang-anhaltende Vasokonstriktion erfolgt (Goetz et al. 1989; Hinojosa-aborde et al. 1989) wird durch die Theorie des Recyclingprozesses des T A -Rezeptors gestützt. Im Gegensatz zum T A -Rezeptor wird der T B -Rezeptor nach T1- timulation und Internalisierung in die ysosomen transportiert, in denen der Abbau der Rezeptoren erfolgt (Oksche et al. 2000; Oksche et al. 2000). ach einmaliger Internalisierung des Rezeptors in die Zelle erfolgt kein erneuter 11

17 inleitung Rücktransport zur Zelloberfläche. Diese rkenntnisse stimmen mit den Befunden überein, dass eine kontinuierliche timulation des T B -Rezeptors mit T1 nur zu einer kurzen Vasodilatation führt. rst kürzlich wurde ein Motiv im -Terminus des T A -Rezeptors identifiziert, das für das typische Recycling-Verhalten des Rezeptors verantwortlich ist (Paasche et al. 2005). Bereits in einer vorangegangenen tudie derselben Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass der -Terminus des T A - Rezeptors die Information für die Internalisierungskaskade enthält. in chimärer T B -Rezeptor, der den -Terminus des T A -Rezeptors trägt, zeigt nach T1-timulation das Internalisierungsmuster des wildtypischen T A - Rezeptors. ür den T B -Rezeptor wurden bisher noch keine Motive für die Internalisierung gefunden. Durch equenzanalysen konnten verschiedene potentielle Motive im T B - Rezeptor identifiziert werden, die sehr wahrscheinlich an der ndozytose beteiligt sein können (siehe Abb. 4). Im Bereich des -Terminus befindet sich ein Tyrosin-haltiges Motiv (GYD), welches dem lysosomalen ortierungs- Motiv des PAR-1 (Protease-aktivierter Rezeptor) ähnlich ist (Paing et al. 2004). Zusätzlich sind drei weitere potentiell regulatorische Motive im - Terminus des T B -Rezeptors vorhanden. urz hinter der Palmitylierungs- equenz befindet sich ein potentielles coiled-coil-motiv, das teilweise mit einem Di-eucin-Motiv überlappt, gefolgt von einem erin-luster, das bis zum nde des -Terminus reicht. 12

18 inleitung A B M D V Y H D I T I T TM 1 TM 2 TM 3 TM 4 TM 5 TM 6 TM 7 I 1 I 2 I 3 I G I M A I P I A Y W 404 V R 410 D H G Y D A R Y 436 T Abb. 4: chematische Darstellung des ndothelins und des ndothelin- B-Rezeptors. A: ndothelin-1 (T1) ist im inbuchstabencode dargestellt. Zwischen den Aminosäuren 1/15 und 3/11 sind Disulfidbrücken ausgebildet. B: Der T B -Rezeptor ist schematisch dargestellt. Der -Terminus (T) sowie die drei extrazellulären chleifen ( 1, 2 und 3) befinden sich extrazellulär. Die drei intrazellulären chleifen (I 1, I 2 und I 3) und der -Terminus (T) sind intrazellulär lokalisiert, wobei der -Terminus über eine Palmitylierungsstelle in der Plasmamembran verankert ist. : Darstellung der 7. Transmembrandomäne und des -Terminus im inbuchstabencode. arblich hervorgehoben sind das potentielle coiledcoil-motiv (blau), das Tyrosin-Motiv (orange), das erin-luster (grün) und ein Tyrosin (rot). 13

19 inleitung 1.6 Zielsetzung s ist bekannt, dass das Internalisierungsverhalten der beiden ndothelinrezeptoren (T A - und T B -Rezeptor) nach T1-timulation sehr unterschiedlich ist. Während der T B -Rezeptor lysosomal abgebaut wird, folgt der T A -Rezeptor einem recycling-prozess und wird zurück in die Plasmamembran transportiert. Diese sehr unterschiedlichen Internalisierungswege müssen ihre Ursache in spezifischen Proteinmotiven intrazellulärer Rezeptorbereiche haben. Während für den T A -Rezeptor ein solches Motiv im -Terminus identifiziert wurde (Paasche et al. 2005), war für den T B -Rezeptor diesbezüglich wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, Motive bzw. equenzbereiche im -Terminus des T B -Rezeptors zu identifizieren und zu analysieren, die für die Internalisierung zuständig sind. Dabei stand zunächst der zeitliche Verlauf der Internalisierung im Vordergrund der Untersuchungen. Des Weiteren sollten Interaktionspartner analysiert werden, die bei anderen G- Protein-gekoppelten Rezeptoren für die Internalisierung relevant sind. Außerdem sollten neue Interaktionspartner identifiziert und analysiert werden. 14

20 Materialien und Methoden 2 Materialien und Methoden 2.1 Materialien Reagenzien und Verbrauchsmaterialien Tab. 1: hemikalien und Verbrauchsmaterialien Reagenz 2-Mercaptoethanol 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin (TMB) Agar-Agar Agarose AP (Ammoniumperoxysulfat) Ampicillin atriumsalz Aprotinin Bacitracin Benzamidin Bromphenolblau acodylsäure atriumsalz-3-hydrat oomassie Brilliant Blau R-250 y3.5 monoreaktiver uccinimidylester Di-aliumhydrogenphosphat-Trihydrat Di-atriumhydrogenphosphat DMM (Dulbecco s modified agle s Medium) DMO (Dimethylsulfoxid) DTA (thylendiamintetraessigsäure) GTA (thylendiamin-glykol-bis-(β- Aminoethylether)-Tetraessigsäure ) ssigsäure Hersteller arl Roth, arlsruhe, Deutschland igma-aldrich, t. ouis, UA Applihem, Darmstadt, Deutschland Applihem, Darmstadt, Deutschland Merck, Darmstadt, Deutschland igma-aldrich, t. ouis, UA Merck, Darmstadt, Deutschland igma-aldrich, t. ouis, UA igma-aldrich, t. ouis, UA arl Roth, arlsruhe, Deutschland arl Roth, arlsruhe, Deutschland arl Roth, arlsruhe, Deutschland Amersham Biosciences, Buckinghamshire, ngland Merck, Darmstadt, Deutschland arl Roth, arlsruhe, Deutschland Biochrom, Berlin, Deutschland igma-aldrich, t. ouis, UA arl Roth, arlsruhe, Deutschland arl Roth, arlsruhe, Deutschland Applihem, Darmstadt, Deutschland 15

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