Aus der Klinik und Poliklinik für Neurologie der Universität Rostock. Direktor: Prof. Dr. med. R. Benecke

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1 Aus der Klinik und Poliklinik für Neurologie der Universität Rostock Direktor: Prof. Dr. med. R. Benecke Langfristige Therapie mit Interferon-β a subkutan: Klinischer Verlauf und Genexpressionsveränderungen im Blut von Patienten mit schubförmig verlaufender Multipler Sklerose Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin der medizinischen Fakultät der Universität Rostock vorgelegt von Christiane Hartmann aus Rostock geboren am in Hamburg Rostock, 22

2 . Gutachter: Prof. Dr. med. Uwe Zettl, Klinik und Poliklinik für Neurologie der Universitätsklinik Rostock 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Friedemann Paul, Charité Universitätsmedizin Berlin Exzellenzcluster NeuroCure, NeuroCure Clinical Research Center 3. Gutachter: Prof. Dr. med. Jörn Peter Sieb, Chefarzt der Neurologie, Helios Klinik Stralsund Datum der Einreichung: Datum der Verteidigung:.4.23

3 Inhaltsverzeichnis Einleitung. Multiple Sklerose.. Epidemiologie..2 Ätiologie und Pathogenese 2..3 Verlauf, Diagnostik und Symptomatik 4..4 Therapie..4. Kausalorientierte Therapie..4.2 Disease modifying drugs Interferon-β Glatirameracetat Medikamente der Eskalationstherapie Symptomatische Therapie Coping 8.2 Molekularbiologische Biomarker 8.3 Technologie und Anwendung von DNA-Mikroarrays 2 2 Fragestellung 22 3 Patienten und Methoden Studiendesign und ablauf Patientenkollektiv Klinische Untersuchungen EDSS und Schubaktivität Paraklinik Nebenwirkungen der Interferon-β-Therapie Molekulare Untersuchungen 29 III

4 Inhaltsverzeichnis 3.4. Blutprozessierung und Mikroarrayanalyse Datenvorverarbeitung Expressionsveränderungen und Clustering Funktionelle Gruppen Analyse der beteiligten Transkriptionsfaktoren 32 4 Ergebnisse Patientencharakteristika Klinische Beobachtungen unter der Interferon-β-Therapie EDSS Schubaktivität unter der Therapie Krankheitsaktivitätsscore Nebenwirkungen im Studienverlauf Paraklinische Ergebnisse Magnet-Resonanz-Tomographie Evozierte Potentiale Genexpressionsveränderungen unter IFN-β-Therapie und Clustering Überrepräsentierte Genfunktionen Genregulation durch Transkriptionsfaktoren Genregulatorische Interaktionen 5 5 Diskussion Klinische Parameter und Verlauf Therapieansprechen Nebenwirkungen unter Interferon-β Genexpressionsveränderungen nach Therapiebeginn Clustering und Analyse der Genfunktionen 62 IV

5 Inhaltsverzeichnis 5.6 Genregulatorische Interaktionen Biomarker in der MS-Diagnostik 65 6 Zusammenfassung 67 7 Literaturverzeichnis 7 8 Internetdokumente 9 9 Abkürzungsverzeichnis 92 Abbildungsverzeichnis 95 Tabellenverzeichnis 96 2 Anhang 97 3 Danksagung 4 Eidesstattliche Erklärung 2 V

6 Einleitung Einleitung. Multiple Sklerose Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des Zentralen Nervensystems (ZNS). Es kommt dabei durch Demyelinisierung und axonale Schädigung zu multiplen entzündlichen und sklerotischen Läsionen im Gehirn und Rückenmark. Die Erkrankung wird daher auch Encephalomyelitis disseminata genannt (Lassmann et al. 2). Schon früh im Krankheitsverlauf treten irreversible Schäden auf, welche zu bleibenden Funktionseinschränkungen führen können. MS ist die häufigste, bereits in jungen Jahren zu bleibender Invalidität führende neurologische Erkrankung (Compston und Coles 28)... Epidemiologie Das Prädilektionsalter der MS liegt zwischen dem 2. und dem 4. Lebensjahr. Dieses spiegelt allerdings das Alter bei Erstmanifestation neurologischer Symptome wider und nicht das Alter beim ersten Auftreten von klinisch stummen Entmarkungsherden im ZNS, welche schon unbemerkt Jahre zuvor auftreten können. Bei Frauen tritt die Erkrankung in Abhängigkeit von der Verlaufsform häufiger auf. Die schubförmige Verlaufsform betrifft Frauen dreimal häufiger als Männer. An der primär progredienten Verlaufsform leiden beide Geschlechter etwa gleich häufig (Greer und McCombe 2). In Deutschland sind nach Schätzungen zwischen 2. und 4. Menschen von der Krankheit betroffen (Hein und Hopfenmüller 2, Flachenecker et al. 28) Das entspricht etwa,5-,7% der Bevölkerung. Die Prävalenz ist geografisch ungleichmäßig verteilt. Es besteht ein höheres Erkrankungsrisiko für Menschen in den gemäßigten Breitengraden wie in Europa, Nordamerika und Australien als für Menschen in äquatornahen Regionen (Rosati 2). Außerdem sind Menschen kaukasischen Ursprungs häufiger betroffen (Aguirre-Cruz et al. 2). Darüber hinaus sind epidemieartige Häufungen in bestimmten Regionen beschrieben worden wie auf den Färöer-Inseln (Joensen 2). Migrationsstudien haben gezeigt, dass Kinder bei Migration vor dem 5. Lebensjahr das MS-Erkrankungsrisiko des neuen Landes annehmen, wohingegen erwachsene Migranten das Erkrankungsrisiko des Herkunftslandes beibehalten (Gale und Martyn 995, Ascherio und Munger 27a).

7 Einleitung..2 Ätiologie und Pathogenese Die Ätiologie der Multiplen Sklerose ist nach wie vor ungeklärt. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine multifaktoriell bedingte Immunreaktion angenommen, bei der sich Entzündungszellen gegen körpereigenes Myeloprotein richten. Dabei scheinen sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren, insbesondere die Exposition gegenüber Viren, eine Rolle zu spielen (Ascherio und Munger 27a, b). Das Risiko von Verwandten MS-kranker Patienten ebenfalls an MS zu erkranken, steigt, je enger das Verwandtschaftsverhältnis ist (Robertson et al. 996a, b), und ist mit ca. 25% am höchsten bei monozygoten Zwillingen (Mumford et al. 994). Es konnte jedoch kein einheitlicher Vererbungsmodus festgestellt werden. Vielmehr wird vermutet, dass eine Kombination aus verschiedenen Genmerkmalen für die Entwicklung einer MS prädisponierend wirkt. Eine Assoziation mit bestimmten Genen konnte nachgewiesen werden, insbesondere wurden Gen-Polymorphismen der HLA-Gene (Humanes Leukozyten-Antigen) wie HLADRB*5 beschrieben, die bei MS-Kranken häufiger als in der Gesamtbevölkerung auftreten (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium 2). Die genetische Komponente kann eine familiäre Krankheitshäufung erklären, nicht jedoch, warum sich das Erkrankungsrisiko bei Migration verändert. Dies spricht eher für einen starken Einfluss von Umweltfaktoren auf die Krankheitsentstehung. Hier wird ein Zusammenhang mit einer in der Kindheit aufgetretenen Infektion durch einen Erreger vermutet, welcher eine Kreuzreaktivität mit Bestandteilen der Myelinscheide aufweist (Ascherio und Munger 27a). Ein spezifischer Erregernachweis konnte bisher nicht erbracht werden, jedoch wurde der Nachweis einer Immunreaktion gegen Epstein-Barr-Virus bei Patienten mit im Kindesalter auftretender MS häufiger als bei Gesunden beschrieben (Haahr und Höllsberg 26, Banwell et al. 27). Als weiterer Einflussfaktor konnte Nikotin identifiziert werden. Rauchen erhöht das Risiko, an einer MS zu erkranken, um den Faktor,2 bis,5 (Hawkes 27) und ist ein Risikofaktor für die Ausbildung einer definitiven MS nach klinisch isoliertem Syndrom (Di Pauli et al. 28). Es wird des Weiteren angenommen, dass Vitamin D einen Einfluss auf die Erkrankung hat. Ein hoher Vitamin D-Spiegel im Blut konnte mit einer geringeren Rate an MS-Erkrankungen korreliert werden, wobei der genaue Zusammenhang noch nicht geklärt ist (Ascherio et al. 2, Pierrot-Deseilligny und Souberbielle 2). Insgesamt geht man heute von einer multifaktoriellen Genese aus, bei der es in genetisch 2

8 Einleitung suszeptiblen Individuen unter dem Einfluss verschiedener Umwelteinflüsse zu einer Immunreaktion gegen körpereigene ZNS-Strukturen kommt (Sospedra und Martin 25, Compston und Cole 28, International Multiple Sclerosis Genetics Consortium 2). Pathophysiologisch kommt es zu einer Aktivierung autoreaktiver T-Lymphozyten im peripheren lymphatischen Gewebe. Dabei handelt es sich um CD4+-T-Lymphozyten und CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten. Die Mechanismen, die zur Aktivierung führen, sind bisher noch nicht im Detail geklärt. Möglicherweise erfolgt diese Aktivierung durch einen exogenen Trigger, z.b. ein Virus-Antigen, welches durch molekulares Mimikry einem körpereigenen Antigen ähnlich ist (Von Herrath et al. 23). Als Folge der Aktivierung exprimieren die autoreaktiven T-Lymphozyten Adhäsionsmoleküle und Chemokinrezeptoren auf ihrer Oberfläche, mit deren Unterstützung sie die Blut-HirnSchranke (Blood Brain Barrier, BBB) passieren können (Hickey 99). Innerhalb des ZNS erkennen die Enzündungszellen körpereigene Strukturen als spezifische Antigene. Als mögliche Antigene werden Proteinstrukturen und/oder Lipidstrukturen der Myelinscheiden postuliert. Ein durch autoreaktive T-Lymphozyten erkennbares Antigen ist das basische Myelinprotein (myelin basic protein, MBP), jedoch wurden im Tiermodell der MS auch andere Encephalitis auslösende Antigene gefunden, die bei der Demyelinisierung eine Rolle spielen können wie u.a. das Proteolipidprotein, Myelin-OligodentrozytenGlykoprotein und Myelin-Oligodentrozyten-basisches Glykoprotein (Mix et al. 2). Durch erneute Antigenpräsentation, z.b. durch Mikroglia, kommt es im ZNS zur Reaktivierung und zum Auslösen einer pathologischen Immunreaktion. Die Sezernierung von proinflammatorischen Zytokinen wie Tumor Necrosis Factor α und Interferon (IFN) γ führt zu einer chemokinvermittelten Rekrutierung von verschiedenen an der Immunreaktion beteiligten Zellen wie Makrophagen, T- und B-Lymphozyten, die gemeinsam eine Demyelinisierung bewirken oder verstärken (Beck et al. 988, Zamvil und Steinman 23, Sospedra und Martin 25). Verschiedene Mechanismen greifen dabei ineinander (Haines et al. 2). CD8-positive T-Lymphozyten, welche in den Läsionen klonal expandieren, schädigen die Oligodentrozyten oder Axone direkt zytotoxisch. AntiMyelin-Antikörper, Komplementfaktoren und myelintoxische Zytokine führen zu einer Schädigung von Myelinproteinen, welche dann durch Phagozytose von Makrophagen abgebaut werden. Durch Zerstörung der Markscheiden und Schädigung der Oligodendrozyten wird die saltatorische Erregungsfortleitung beeinträchtigt (Nave und 3

9 Einleitung Trapp 28). Außerdem fehlt die trophische Versorgung der Axone sowie der mechanische und chemische Schutz. Die Axone werden dadurch vulnerabel gegenüber zytotoxischen TLymphozyten und können ihr Membranpotential nicht stabilisieren, was zu Kalziumeinstrom, zum Anschwellen und letztendlich zur Diskonnektion des Axons führt (Smith 27). Der Axonschaden korreliert eng mit der Entzündung, findet aber auch in anderen nicht entzündlich veränderten Hirnarealen statt. Axonale Schäden treten schon früh im Krankheitsverlauf auf und können mit reversiblen oder irreversiblen klinischen Funktionsausfällen einhergehen (Owens 23). Mit fortschreitender Erkrankung nimmt die neuronale Plastizität ab und die Wahrscheinlichkeit steigt, dass Läsionen mit bleibender Funktionseinschränkung korrelieren (Wujek et al. 22). Lange Zeit wurde angenommen, dass sich die Entzündungsreaktion auf die weiße Substanz des ZNS beschränkt. Neuere Studien lassen jedoch den Schluss zu, dass es ebenfalls zu in der Magnet-ResonanzTomographie (MRT) nicht visualisierbaren kortikalen Läsionen sowie zu einer Schädigung tiefer Kerngebiete grauer Substanz kommt (Kutzelnigg et al. 25). Das morphologische Korrelat der Immunreaktion sind Demyelinisierung und Axondegeneration sowie gliöse Narben. Nach dem Abklingen der akuten Entzündung sind die Schäden an den Myelinscheiden durch Remyelinisierung potentiell reversibel. Die Remyelinisierung konnte sowohl bei der schubförmigen als auch bei der chronisch progredienten Verlaufsform nachgewiesen werden. Das Ausmaß der Remyelinisierung ist jedoch interindividuell sehr unterschiedlich ausgeprägt (Patrikios et al. 26). Insgesamt besteht eine ausgeprägte Heterogenität der pathologischen Veränderungen, welche sich auch in der Heterogenität der klinischen Symptommanifestation widerspiegelt (Lassmann et al. 27). Bildmorphologisch manifestieren sich die Plaques als multifokale, scharf begrenzte Entmarkungsherde mit bevorzugtem Auftreten in der Umgebung kleiner Venolen. Diese Herde stellen aktive oder inaktive Läsionen dar, wobei in den inaktiven kein aktiver Myelinabbau stattfindet. Prädilektionsstellen sind die periventrikuläre weiße Substanz, der Nervus opticus, der Balken, der Hirnstamm, das Kleinhirn und das Rückenmark (Rovira und León 28). Atypische Verteilungsmuster sind jedoch möglich (Filippi et al. 22)...3 Verlauf, Diagnostik und Symptomatik Klinisch manifestieren sich akute Entzündung und axonale Degeneration als akuter Krankheitsschub und schleichende Akkumulation irreversibler neurologischer Defizite, im 4

10 Einleitung Sinne einer chronischen Progression. Als Schub wird dabei ein neu aufgetretenes oder wieder aufgetretenes neurologisches Defizit definiert, das mehr als 24 Stunden andauert und mindestens 3 Tage nach dem letzten Schub auftritt (McDonald et al. 2). Es darf nicht durch eine Erhöhung der Körpertemperatur, beispielsweise durch einen Infekt, erklärt werden können. Bei erhöhter Körperkerntemperatur liegen schlechtere Reizleitungsbedingungen vor. Symptome können sich bei Anstieg der Körpertemperatur, wie zum Beispiel bei Fieber, einem heißen Bad oder körperlicher Anstrengung, verstärken oder neu auftreten. Man spricht in diesem Fall von einem Pseudo-Schub oder einem Uhthoff-Phänomen (Guthrie und Nelson 995). Das Ausmaß der Funktionseinschränkung kann mittels EDSS (Expanded Disability Status Scale) operationalisiert werden (Kurtzke 983, Tabelle ). Der EDSS ist ein international verwendeter Score, der den Grad der Behinderung und die damit verbundene Einschränkung durch die MS erfasst und das neurologische Defizit auf einer Skala von bis quantifiziert. Die Abstufung von bis umfasst den Zustand ohne jegliche Behinderung () bis hin zum Tod durch MS (). Es werden dabei die acht Funktionssysteme, Pyramidenbahn, Sensorium, Kleinhirn, Blasen- und Mastdarm, Hirnstamm, Visus, Kognition und andere nach dem Grad ihrer Einschränkung bewertet (Kurtzke 983). Als besonderer Schwerpunkt fließt die motorische Einschränkung, besonders die Gehfähigkeit, in den Wert ein. 5

11 Einleitung Tabelle : Expanded Disability Status Scale (EDSS) (modifiziert nach Kurtzke 983) Der EDSS gibt den Behinderungsgrad durch die Multiple Sklerose unter Berücksichtigung der Anzahl und des Schweregrades der betroffenen Funktionssysteme auf einer Skala von, bis, an. Grad Beschreibung, Normale neurologische Untersuchung., Keine Behinderung, minimale Abnormität in einem funktionellen System (FS).,5 Keine Behinderung, minimale Abnormität in mehr als einem FS. 2, Minimale Behinderung in einem FS. 2,5 Minimale Behinderung in zwei FS. 3, Mäßiggradige Behinderung in einem FS oder leichte Behinderung in drei bis vier FS, jedoch voll gehfähig. 3,5 Voll gehfähig, aber mit mäßiger Behinderung in einem FS (Grad 3) und leichte Behinderung in ein bis zwei FS (Grad 2), oder mäßiggradige Behinderung in zwei FS, oder leichte Behinderung in fünf FS. 4, Gehfähig ohne Hilfe und Rast für mindestens 5 m. Aktiv während ca. 2 Stunden pro Tag trotz relativ schwerer Behinderung. 4,5 Gehfähig ohne Hilfe und Rast für mindestens 3 m. Ganztägig arbeitsfähig. Gewisse Einschränkung der Aktivität, benötigt minimale Hilfe, relativ schwere Behinderung. 5, Gehfähig ohne Hilfe und Rast für etwa 2 m. Behinderung schwer genug, um tägliche Aktivität zu beeinträchtigen (z. B. ganztägig zu arbeiten ohne besondere Vorkehrungen). 5,5 Gehfähig ohne Hilfe und Rast für etwa m. Behinderung schwer genug, um normale tägliche Aktivität zu verunmöglichen. 6, Bedarf, intermittierend oder auf einer Seite konstant, der Unterstützung (Krücke, Stock, Schiene), um etwa m ohne Rast zu gehen. 6,5 Benötigt konstant beidseits Hilfsmittel (Krücke, Stock, Schiene), um etwa 2 m ohne Rast zu gehen. 7, Unfähig, selbst mit Hilfe, mehr als 5 m zu gehen. Weitgehend an den Rollstuhl gebunden. Bewegt den Rollstuhl selbst und transferiert ohne Hilfe. 7,5 Unfähig, mehr als ein paar Schritte zu tun. An den Rollstuhl gebunden. Benötigt Hilfe für den Transfer. Bewegt den Rollstuhl selbst, aber vermag nicht den ganzen Tag im Rollstuhl zu verbringen. Benötigt eventuell motorisierten Rollstuhl. 8, Weitgehend an Bett oder Rollstuhl gebunden. Pflegt sich weitgehend selbstständig. Meist guter Gebrauch der Arme. 8,5 Weitgehend ans Bett gebunden, auch während des Tages. Einiger nützlicher Gebrauch der Arme, einige Selbstpflege möglich. 9, Hilfloser Patient im Bett. Kann essen und kommunizieren. 9,5 Gänzlich hilfloser Patient. Unfähig zu essen, zu schlucken oder zu kommunizieren., Tod infolge von MS 6

12 Einleitung Kognitive und vegetative Symptome werden durch den EDSS nur limitiert abgebildet. Ab einem EDSS von 4, ist die Motorik der unteren Extremität das dominante Kriterium für eine weitere Progression. Aufgrund der genannten Limitierungen wurden alternative Scores entwickelt wie der MSFC (Multiple Sclerosis Functional Composite), durch welchen insbesondere die kognitiven Fähigkeiten stärker repräsentiert werden sollen. Dabei fließen die drei funktionellen Systeme (FS) Armmotorik, Beinmotorik und Kognition in gleichem Ausmaß in den berechneten Wert ein. Dieser Score stellt eine Alternative zur Erfassung klinischer Einschränkungen dar (Rudick et al. 22). Die Dokumentation des Krankheitsverlaufs via EDSS bleibt jedoch in der Klinik das am häufigsten verwendete Instrument zur Dokumentation von Funktionseinschränkungen durch die MS. Der Verlauf der Erkrankung ist nicht vorhersagbar und von Patient zu Patient unterschiedlich. Klinisch können fünf verschiedene Stadien und Verlaufsformen mittels Krankheitsprogredienz sowie dem Auftreten von Schüben charakterisiert werden: Radiologisch-isoliertes Syndrom (Radiologically Isolated Syndrome, RIS) Klinisch-isoliertes Syndrom (Clinically Isolated Syndrome, CIS) Schubförmige MS (Relapsing Remitting MS, RRMS) Sekundär chronisch progrediente MS (Secondary Progressive MS, SPMS) Primär chronisch progrediente MS (Primary Progressive MS, PPMS) Bei 8% der MS-Patienten beginnt die Erkrankung schubförmig. Dabei entwickeln sich die Schübe akut oder subakut. Nach einigen Tagen bis Wochen tritt eine Remission ein, die vollständig oder unvollständig sein kann. Bei ca. 3%-4% der Patienten mit zunächst schubförmigem Verlauf kommt es nach etwa zehn Jahren zum Übergang in eine chronischprogrediente Verlaufsform (Weinshenker et al. 989). Schübe können in dieser Phase noch aufgesetzt vorkommen. In %-5% der Fälle treten die Symptome von Anfang an langsam progredient und ohne Remission auf. Man spricht in diesem Fall von einer primär chronisch progredienten MS (Thompson et al. 997). Als CIS bezeichnet man das erstmalige Auftreten einer klinischen Symptomatik mit korrespondierendem Nachweis eines Demyelinisierungsherdes, welcher jedoch noch nicht die Kriterien der räumlichen und zeitlichen Dissemination für die Diagnose einer definitiven MS erfüllt. Finden sich bei 7

13 Einleitung asymptomatischen Patienten MS-typische Befunde in der MRT, spricht man von einem RIS (Sellner et al. 2). Die Übergänge zwischen den verschiedenen Verlaufsformen sind fließend und nicht immer ist eine eindeutige Zuordnung möglich (Flachenecker et al. 28). Zur Sicherung der Diagnose MS werden in der Gegenwart die McDonald-Kriterien angewandt, welche auf Anamnese, Bildgebung, paraklinischen Befunden und Liquordiagnostik basieren. Erstmals wurden diese Kriterien 2 veröffentlicht (McDonald et al. 2, Tabelle 2). Seitdem kam es zu breiter Anwendung und Weiterentwicklung angesichts neuer Forschungserkenntnisse. So erfolgten 25 und 2 Revisionen durch die Arbeitsgruppe um C.H. Polman mit dem Ziel, die Diagnosekriterien zu vereinfachen, um eine frühe Diagnosestellung zu erleichtern (Polman et al. 25, Polman et al. 2). Weiterhin bestehen aber Limitierungen bei den Diagnosekriterien (Tumani et al. 2). 8

14 Einleitung Tabelle 2: Diagnosekriterien der Multiplen Sklerose (modifiziert nach McDonald et al. 2) Dabei werden die klinisch erhobenen Befunde durch paraklinische Befunde, insbesondere die Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) gestützt. Schübe Objektivierbare klinische Manifestation Weitere erforderliche Kriterien 2 oder mehr 2 oder mehr Keine; klinische Evidenz ausreichend 2 oder mehr Nachweis räumlicher Dissemination durch: MRT oder 2 oder mehr MS-typische Läsionen im MRT und positiver Liquorbefund2 oder weiterer klinischer Schub 2 oder mehr Nachweis zeitlicher Dissemination durch: MRT3 oder zweiter klinischer Schub (monosymptomatisch) Nachweis räumlicher Dissemination durch: MRT oder 2 oder mehr MS-typische Läsionen im MRT mit positivem Liquorbefund und Nachweis zeitlicher Dissemination durch: MRT3 oder zweiter klinischer Schub (schleichende Progression seit Beginn) - Positiver Liquorbefund und Nachweis räumlicher Dissemination durch: > 8 T2-gewichtete Läsionen im cerebralen MRT oder > Rückenmarksläsion oder 4-8 cerebrale Läsionen und eine Rückenmarksläsion oder positives VEP und 4-8 cerebralen Läsionen oder < 4 cerebrale Läsionen und eine Rückenmarksläsion und Nachweis zeitlicher Dissemination durch: MRT oder kontinuierliche Progression über Jahr 2 3 Nachweis räumlicher Dissemination durch drei der folgenden 4 Kriterien:. Eine Gadolinium (Gd)-anreichernde Läsion oder 9 T2-hyperintense Läsionen, falls keine Gd-anreichernde Läsion vorhanden ist. 2. Eine oder mehr infratentorielle Läsionen. 3. Eine oder mehr juxtakortikale Läsionen. 4. Drei oder mehr periventrikuläre Läsionen. Dabei kann eine spinale Läsion eine cerebrale Läsion ersetzen. Positiver Liquorbefund: Nachweis oligoklonaler Banden im Liquor cerebrospinalis oder eines erhöhten IgG-Index. Nachweis zeitlicher Dissemination im MRT: Nachweis einer Gd-anreichernder Läsion mit neuer Lokalisation in einem MRT, das mindestens drei Monate nach dem Beginn eines klinischen Schubes aufgenommen wurde oder, wenn keine Gd-anreichernde Läsion nachzuweisen ist, Nachweis einer Gd-anreichernden Läsion oder einer neuen T2-Läsion in einem Verlaufs-MRT drei Monate später. 9

15 Einleitung Ausschlaggebend für die Sicherung der Diagnose ist nach den McDonald-Kriterien der Nachweis einer örtlichen und zeitlichen Dissimination der Entmarkungsherde. Dabei kommen neben der ausführlichen Anamneseerhebung apparative diagnostische Verfahren wie die MRT und die Messung evozierter Potentiale (EP) zum Einsatz. Zum Nachweis des entzündlichen Charakters der MRT-Läsionen sowie zum Ausschluss anderer Entzündungen wie Lues und Borreliose ist die Liquorpunktion mit Bestimmung der oligoklonalen Banden (OKB) im Liquor cerebrospinalis unerlässlich. Diese durch isoelektrische Fokussierung nachweisbaren IgG-Banden (Immunglobulin G) sind bei 95% der MS-Patienten positiv (Link und Huang 26). Es handelt sich dabei um Antikörper, die im Rahmen einer Entzündung im Gehirn gebildet worden sind und die im Liquor, nicht aber im Serum nachweisbar sind. Eine besondere Bedeutung erlangt dabei die MRT-Untersuchung mit Kontrastmittel. Aktive Läsionen nehmen Gadolinium (Gd) auf und lassen sich so von inaktiven Läsionen unterscheiden. Dadurch ist inzwischen der Nachweis einer zeitlichen Dissimination möglich, auch wenn ein Patient erst einen sicher nachgewiesenen Schub hatte. Dies ist besonders bedeutsam, da es sich als vorteilhaft erwiesen hat, so früh wie möglich mit der Therapie zu beginnen (Jacobs et al. 2, Comi et al. 2, Kappos et al. 29, Tintoré 29). Generell gilt, dass die gebotenen Symptome nicht durch eine andere Erkrankung besser zu erklären sein dürfen. Daher wird der Differentialdiagnostik eine wichtige Bedeutung beigemessen (Zettl und Tumani 25, Tumani et al. 2). Je nach Lokalisation der Entzündungs- und Glioseherde können neurologische Ausfälle in jedem neurologischen Funktionssystem auftreten. Die Symptome bzw. Symptomkombinationen sind dadurch sehr vielgestaltig. Man nennt die MS deshalb auch die Krankheit mit den tausend Gesichtern. Zu den frühen Symptomen der MS zählen Sensibilitätsstörungen (43,%), Paresen (37%) und Visuseinschränkungen durch die Retrobulbärneuritis (3,%) (Stuke et al. 29). Im späteren Krankheitsverlauf entsteht häufig ein spastisch-ataktisches Gangbild. Bei ca. 8% der Patienten treten im Krankheitsverlauf Blasen- und Darmstörungen auf, wie die Dranginkontinenz und Darmentleerungsstörungen (Tubaro et al. 22). Außerdem kommt es zu Hirnstamm- und cerebellären Symptomen. Ein häufiges Symptom ist außerdem die Fatigue, eine

16 Einleitung generalisierte abnorme Müdigkeit. Kognitive und psychische Veränderungen nehmen im Verlauf der Erkrankung zu (Jongen et al. 22, Stuke et al. 29)...4 Therapie Trotz intensiver Forschung gibt es derzeit noch keine kausal wirkende Therapie der MS. Ziel der Behandlung ist es daher, den natürlichen Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen und die entzündliche Krankheitsaktivität zu reduzieren. Die hierfür verwendeten Medikamente werden disease modifying drugs (DMD) genannt. Ihre Hauptziele sind die Reduktion der Entzündungsreaktion im akuten Schub mit Rückbildung der schubassoziierten Symptome, die Verminderung der Schubfrequenz sowie die Verhinderung oder Verzögerung der Krankheitsprogression und Stabilisierung der eingetretenen Defizite auf möglichst niedrigem Niveau. Sie wirken kausalorientiert über eine Modulation des Immunsystems (MSTCG 28, DGN 22). Des Weiteren kommt der Behandlung von MS-bedingten Symptomen und Funktionseinschränkungen durch die symptomatische Therapie eine wichtige Bedeutung zu (Henze 24, DGN 22). Entsprechend den Erfordernissen, die sich aus der Symptommanifestation ergeben, dient hierbei ein multimodales Therapiekonzept aus Pharmakotherapie, Physio- und Ergotherapie, Neuropsychiologie, Psychotherapie und Hilfsmittelversorgung dazu, vorhandene Symptome zu lindern und sekundäre Schäden zu vermeiden. Die dritte Säule der MS-Therapie stellt das bisher wenig erforschte Gebiet der Krankheitsbewältigung dar (Apel et al. 26)...4. Kausalorientierte Therapie Die kausalorientierte immunmodulierende Therapie wird eingeteilt in die Therapie im akuten Schub, die verlaufsmodifizierende Basistherapie und die Eskalationstherapie bei Versagen der Basistherapie (Abbildung ).

17 Einleitung CIS RRMS Schubtherapie Basistherapie Eskalationstherapie Indikation Glatirameracetat Interferon-β a i.m. Interferon-β a s.c. Interferon-β b s.c. Wahl 2. Wahl Fingolimod Mitoxantron Natalizumab (Cyclophosphamid) Glatirameracetat Interferon-β a i.m. Interferon-β a s.c. Interferon-β b s.c (Azathioprin) IVIg 2. Wahl Plasmapherese. Wahl Methylprednisolon SPMS mit aufgesetzten Schüben ohne aufgesetze Schübe Interferon-β a s.c. Mitoxantron Interferon-β b s.c (Cyclophosphamid) Mitoxantron (Cyclophosphymid) Abbildung : Immunmodulatorische Stufentherapie der Multiplen Sklerose (modifiziert nach den Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Neurologie (DGN 22: Leitlinien der DGN Diagnostik und Therapie der Multiplen Sklerose [6.8.22]). i.m.: intramuskulär s.c.: subkutan CIS: clinically isolated syndrome RRMS: relapsing remitting multiple sclerosis SPMS: secondary progressive multiple sclerosis Die Schubtherapie erfolgt nach einer strukturierten, neurologischen Untersuchung, dem Ausschluss von Differentialdiagnosen sowie von Kontraindikationen gegen die Anwendung von Glukokortikosteroiden. Unter Magenschutz und Thromboseprophylaxe werden g Methylprednisolon einmal täglich über fünf Tage intravenös (i.v.) appliziert. Bei ausbleibendem Therapieerfolg kann die Therapie nach 4 Tagen in der Dosierung 2 g Methylprednisolon pro Tag wiederholt werden. Tritt auch hierunter keine Besserung der Symptome ein, steht als Reservetherapie die Plasmapherese zur Verfügung (Weinshenker et al. 999). Die Basistherapie mit DMD unterscheidet sich in Abhängigkeit von der jeweiligen Verlaufsform. Zur Therapie des klinisch isolierten Syndroms und der schubförmigen MS stehen IFN-β a und IFN-β b sowie Glatirameracetat (GA) als Mittel der ersten Wahl zur Verfügung (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group 993, Johnson et al. 995, Jacobs et al. 996, PRISM Study Group 998, Jacobs et al. 2, Comi et al. 2, Comi et al. 29, Kappos et al. 29). Intravenöse Immunglobuline und Azathioprin werden derzeit als Therapeutikum der zweiten Wahl zur Therapie dieser Verlaufsformen angewandt. Im 2

18 Einleitung Rahmen der Eskalationstherapie der schubförmigen MS bei Versagen der Basistherapie bzw. bei Patienten mit hochaktivem Verlauf kommen das orale Immuntherapeutikum Fingolimod (Kappos et al. 2) und der monoklonale Antikörper Natalizumab (Polman et al. 26) zum Einsatz. Als Mittel der zweiten Wahl steht das Zytostatikum Mitoxantron zur Verfügung. Bei der Therapie der sekundär chronisch progredienten MS unterscheidet sich die Therapie je nach dem, ob noch aufgesetzte Schübe vorkommen oder ob es sich um eine kontinuierliche Progression ohne aufgesetzte Schübe handelt. Im Fall von aufgesetzten Schüben sind IFN-β a subcutan (s.c.) und b s.c. sowie Mitoxantron zur Therapie zugelassen (European Study Group on interferon beta b in secondary progressive MS 998, Kappos et al. 24). Fehlen diese, kommt nur noch Mitoxantron zum Einsatz. Als individueller Heilversuch kann die zyklische Glukokortikosteroidtherapie durchgeführt werden (DGN 22). Für die Therapie der primär chronisch progredienten MS haben klinische Studien keinen eindeutigen Nutzen durch die Therapie mit Immunmodulatoren (IFN-β, GA) zeigen können. Die in dreimonatigen Abständen durchgeführte Pulstherapie mit Glukokortikosteroide kann als individueller Heilversuch durchgeführt werden (MSTCG 28, DGN 22) Disease modifying drugs Im Folgenden werden die einzelnen Immunmodulatoren beschrieben, wobei der Schwerpunkt hier auf die für diese Arbeit relevanten Beta-Interferone gelegt wird Interferon-β Interferon-β (IFN-β) ist ein natürlicherseits von Fibroblasten gebildetes Glykoprotein, bestehend aus 66 Aminosäuren. (Derynck et al. 98). Es wirkt im Rahmen der körpereigenen Immunantwort antiviral, antiproliferativ und immunmodulierend (Jacobs und Johnson 994). In der Therapie der MS wurde es anfangs in der Annahme, dass es sich bei der MS um eine Viruserkrankung handelt, aufgrund seiner antiviralen Eigenschaften eingesetzt. Dabei konnte ein positiver Effekt auf den natürlichen Krankheitsverlauf gezeigt werden. Der genaue Wirkmechanismus ist jedoch noch nicht zur Gänze verstanden. 3

19 Einleitung Folgende Annahmen werden postuliert: Der Effekt des IFN-β auf das Immunsystem resultiert aus dem Einfluss auf TLymphozyten, B-Lymphozyten und auf die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke sowie aus der Modulation der Zytokinproduktion (Mendes und Sá 2). IFN-β inhibiert die Antigenprozessierung und -präsentation durch verminderte Expression von major histocompatibility complex (MHC) Klasse II-Molekülen und verringert damit die Aktivierung von T-Lymphozyten. Außerdem wirkt es über die Apoptose autoreaktiver TLymphozyten und Induktion von regulatorischen T-Lymphozyten einer T-Zell-Proliferation und -Differenzierung entgegen. Über verschiedene Mechanismen erschwert IFN-β die Transmigration von Leukozyten durch die Blut-Hirn-Schranke und damit das Einwandern von aktivierten Leukozyten in Entzündungsherde. Unter anderem vermindert es dabei die Expression von Adhäsionsmolekülen wie vascular cell adhesion molecule- und very late activation antigen-4 (Calabresi et al. 997, Graber et al. 25). In vitro Analysen haben außerdem eine Verringerung der Aktivität von Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) und die damit verbundene Verminderung der Leukozytenmigration ins Hirnparenchym gezeigt (Trojano et al. 999). Darüber hinaus wird IFN-β eine neuroprotektive Wirkung zugeschrieben, welche die Remyelinisierung unterstützt (Dhib-Jalbut und Marks 2). Bei therapeutischem IFN-β werden zwei molekulare Formen unterschieden: IFN-β-a und b. IFN-β a wird rekombinant aus Ovarzellen des chinesischen Hamsters hergestellt. Es wird intramuskulär (i.m.) in der Dosierung 3μg x pro Woche (Avonex; Biogen Idec) oder s.c. in der Dosierung 3 x pro Woche 22 bzw. 44 μg (Rebif; Merck Serono) injiziert. IFN β-b (Betaferon; Bayer Schering) wird aus prokaryoten Bakterienzellen gewonnen. Es ist im Gegensatz zu IFN β-a und humanem IFN-β nicht glykosiliert, außerdem unterscheidet es sich von diesen in einer Aminosäure an Position 7 sowie durch das Fehlen der ersten Aminosäure Methionin. IFN β-b wird alle zwei Tage s.c. in der Dosierung 25µg injiziert. Zur Therapie der schubförmigen MS stehen damit drei Interferone zur Verfügung, deren Wirksamkeit in mehreren großen randomisierten, multizentrischen Doppelblind-Studien mit dem Evidenzgrad bewiesen wurde (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group 993, Jacobs et al. 996, PRISM Study Group 998). Es konnte gezeigt werden, dass die Schubfrequenz unter der Therapie mit IFN-β um mehr als 3% reduziert und die 4

20 Einleitung Ausbildung einer sicheren MS nach dem ersten Schub hinausgezögert werden kann (Jacobs et al. 2, Comi et al. 2, Kappos et al. 29). Außerdem wird die Krankheitsprogression, gemessen am EDSS, vermindert und damit der Grad der Behinderung durch MS reduziert. Die Anzahl der aktiven Gd-aufnehmenden Herde im MRT ist unter dieser Therapie ca. 3% geringer als in der Placebogruppe. Im direkten Vergleich der Interferon-Präparate zeigten mehrere Studien hinsichtlich der Endpunkte Schubfrequenz und Dauer bis zum erneuten Schub sowie Krankheitsprogression und Anzahl neuer Demyelinisierungsherde im MRT keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Medikamenten (Koch-Henriksen et al. 26, Patti et al. 26, Masdeh et al. 2). Eine leichte Überlegenheit der mehrmals pro Woche verabreichten Präparate gegenüber dem einmal pro Woche applizierten IFN-β a i.m., die von einigen Autoren postuliert wird (Durelli et al. 22, Panitch et al. 22), wird möglicherweise im Verlauf durch das häufigere Auftreten von neutralisierenden Antikörpern (neutralizing Antibodies, NAb) bei diesen Präparaten aufgehoben. Bei den Nebenwirkungen der IFN-β-Therapie handelt es sich vor allem um Hautreaktionen an der Injektionsstelle, die bei bis zu 8% der Patienten auftreten (Panitch et al. 22). Des Weiteren beklagen mehr als die Hälfte der Patienten grippeähnliche Symptome wie Fieber, Myalgien, Kopfschmerzen und Abgeschlagenheit. Durch die abendliche Injektion mit richtiger Injektionstechnik und die prophylaktische Gabe von nichtsteroidalen Antirheumatika prä-injektionem kann das Auftreten und das Ausmaß der Nebenwirkungen vermindert werden. Langzeitstudien bestätigten die insgesamt gute Verträglichkeit der Beta-Interferone. Auch nach einer längeren Therapiedauer konnten keine neuen schwerwiegenden Nebenwirkungen nachgewiesen werden (Río et al. 25 b). Während der IFN-β-Therapie kann es außerdem zu Bildung von NAb gegen das Medikament kommen. Die NAb-Bildung ist bei IFN-β b mit 23-38% vergleichsweise hoch (IFNB MS Study Group 996, European Study Group 998, Rudick et al. 998). Bei IFN-β a i.m. ist sie mit 3-6% am niedrigsten (Rudick et al. 998, Durelli et al. 22). Unter der Therapie mit IFN-β a s.c. variiert die Häufigkeit der Antikörperbildung je nachdem, ob die niedrigere Dosis von 22 µg oder die höhere Dosis von 44 µg verabreicht wurde zwischen 9,8 und 24% (PRISMS Study Group 2, Freedman et al. 25). Da es zur Wirkabschwächung kommen kann, sollte bei klinischem Verdacht auf ein 5

21 Einleitung Therapieversagen eine Bestimmung der NAb und gegebenenfalls ein Therapiewechsel erfolgen (Tomassini et al. 26, Polman et al. 2, Killestein und Polman 2). Das individuelle Ansprechen auf die Therapie ist zwischen den einzelnen Patienten sehr unterschiedlich. Bei ca. einem Drittel der mit IFN-β therapierten Patienten besteht trotz Therapie eine gleichbleibend hohe oder sogar verstärkte Schubaktivität (Waubant et al. 23). Die Rate dieser sogenannten Nonresponder ist mit ca. 3% sehr hoch. Das Ansprechen auf die Therapie kann aber nur retrospektiv und frühestens nach sechs (Progression) bzw. zwölf (Schubrate) Monaten beurteilt werden. Außerdem gibt es derzeit keine international einheitlichen Richtlinien zur Klassifizierung von Respondern und Nonrespondern Glatirameracetat Glatirameracetat ist ein Polypeptid-Gemisch, bestehend aus den vier Aminosäuren LGlutaminsäure, L-Lysin, L-Alanin und L-Tyrosin. Die Zusammensetzung ähnelt der des MBP, einem Bestandteil der Myelinscheide. Der Wirkmechanismus ist noch nicht vollständig verstanden. Es wird angenommen, dass der Wirkstoff Immunzellen bindet, welche gegen Bestandteile der Myelinscheide gerichtet sind. Außerdem scheint es zu einer Verschiebung des Verhältnisses von TH Lymphozyten (T-Helfer Lymphozyten ) zu TH2 Lymphozyten zu kommen. Durch die TH2 Lymphozyten werden vermehrt antiinflammatorische Zytokine freigesetzt. Darüber hinaus wird ein neuroprotektiver Effekt beschrieben (Aharoni et al. 2). So wird postuliert, dass neurotrophe Faktoren wie der Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) vermehrt gebildet werden und dazu beitragen, die zerstörte Myelinschicht wieder aufzubauen (Ruggieri et al. 27). GA wird täglich s.c. injiziert. In mehreren großen placebo-kontrollierten Studien konnte eine signifikante Reduktion der Schubrate und der Entzündungsaktivität im MRT nachgewiesen werden (Johnson et al. 995, Comi et al. 29). Vergleichende Studien mit IFN-β und GA ergaben keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Effizienz beider Medikamente (Mikol et al. 28, O Connor et al. 29) Medikamente der Eskalationstherapie Seit 26 ist mit Natalizumab ein monoklonaler Antikörper auf dem Markt. Er richtet sich gegen α4-integrin und verhindert bzw. erschwert die Leukozytenmigration ins ZNS. 6

22 Einleitung Dadurch bewirkt er eine verminderte Krankheitsaktivität und geringere Schubfrequenz. Natalizumab ist zur Therapie hochaktiver Verläufe der schubförmigen MS oder trotz Basistherapie rasch progredienter RRMS zugelassen. Gegen Placebo getestet zeigte sich sowohl in der Monotherapie als auch in der Kombinationstherapie mit IFN-β a i.m. eine deutliche Reduktion der Schubaktivität (68%) und der EDSS-Progression (> 5%) (Polman et al. 26, Pucci et al. 2). Schwerwiegende Nebenwirkungen wie die gehäufte Manifestation der progressiven multifokalen Leukencephalopathie (PML) führten jedoch zu einer Limitierung der Zulassung auf oben genannte Indikationen (Bloomgren et al. 22). Ebenfalls zugelassen für hochaktive Verläufe schubförmiger MS sowie für trotz Basistherapie rasch progediente Verläufe von RRMS ist seit 2 das Immunsuppressivum Fingolimod. Dabei handelt es sich um ein Sphingosin -Phosphat-Analogon, welches die Migration von Lymphozyten aus sekundärem lymphatischen Gewebe ins Blut vermindert (Garcia-Merino und Sanchez 22). Dadurch wird auch die Rezirkulation von Lymphozyten ins Gehirn reduziert. Unter der Therapie konnte eine Reduktion der Schubrate und eine Verzögerung der Krankheitsprogression festgestellt werden (Kappos et al. 2). Bei Versagen der Basistherapie mit IFN-β oder GA sowie bei therapienaiven besonders rasch progredienten ungünstigen Verläufen kommt als Mittel der zweiten Wahl das Chemotherapeutikum Mitoxantron im Rahmen einer Eskalationstherapie zum Einsatz (Hartung et al. 22). Es besteht ein dosisunabhängiges Leukämierisiko und ein dosisabhängiges Risiko für das Auftreten einer Kardiomyopathie, daher ist die Zulassung auf therapierefraktäre und ungünstige Verläufe der RRMS limitiert (DGN 22). Es wird außerdem in der Therapie der sekundär chronisch progredienten MS verwendet. Die Deeskalation der Therapie wird von einigen Patienten gewünscht und ist teilweise aufgrund von limitierenden Nebenwirkungen (NW) der Eskalationstherapeutika notwendig. Es gibt hierfür bisher jedoch keine klaren evidenzbasierten Strategien. Einige Szenarien wurden in kleinen Studien getestet (Havla et al. 2, Rieckmann et al. 22) Symptomatische Therapie Im Rahmen der symptomatischen Therapie werden Beschwerden behandelt, welche die 7

23 Einleitung funktionellen Fähigkeiten und die Lebensqualität beeinträchtigen. Der Erhalt der Mobilität und die Teilhabe am beruflichen und gesellschaftlichen Leben sowie die Vermeidung von sekundären Krankheitskomplikationen haben dabei eine entscheidende Bedeutung. Die Behandlung erfolgt symptomorientiert und multimodal. Dabei kommen neben der Pharmakotherapie Physiotherapie, Ergotherapie, Psychotherapie und Rehabilitationsmaßnahmen zum Einsatz. Detaillierte Angaben zur symptomatischen Therapie finden sich in den Leitlinien für die symptomatische Therapie bei MS (Henze 24, De Sa et al. 2, DGN 22) Coping Wegen des unklaren Verlaufs der MS sowie psychischer und physischer Einschränkungen der häufig sehr jungen Patienten ist die Krankheitsbewältigung oft schwierig. Depressionen und Suizid treten häufiger im Vergleich zur Normalbevölkerung auf (Sadovnik et al. 996). Gründe hierfür sind neben Einsamkeit und fehlender sozialer Unterstützung auch das Fehlen von Mechanismen zur Krankheitsbewältigung. Hier sollten psychosoziale Hilfsangebote gemacht und aktive Copingstrategien gelehrt werden (Apel et al. 26, Goretti et al. 2)..2 Molekularbiologische Biomarker Als Biomarker bezeichnet man einen objektivierbaren Messwert, der als Indikator für einen biologischen oder krankhaften Prozess im Körper dienen kann. Dabei kann es sich um Gene, Moleküle oder Zellen handeln oder auch um medizinische Phänomene wie das Auftreten von Krankheitssymptomen (Bielekova und Martin 24). Damit der Biomarker im klinischen Alltag Anwendung finden kann, sollte er idealerweise folgende Eigenschaften haben (Goertsches und Zettl 27): hohe Sensitivität und Spezifität bzgl. der Ausprägung einer Krankheit oder des Effektes einer therapeutischen Intervention reproduzierbar, minimal-invasiv messbar und kostengünstig Man kann verschiedene Biomarker unterteilen: Diagnostische Biomarker geben Aufschluss darüber, ob eine bestimmte Krankheit besteht 8

24 Einleitung oder nicht. In der Diagnostik der MS werden etwa als molekulare Biomarker die OKB im Liquor bestimmt. Sie unterstützen den Kliniker bei der Diagnosefindung und beim Ausschluss von Differentialdiagnosen. Krankheitsaktivitätsmarker der MS stellen im klinischen Alltag der EDSS-Wert und die Schubfrequenz dar. Das Zytokin Osteopontin ist im Liquor von MS-Patienten erhöht und ein möglicher molekularer Indikator für die Krankheitsaktivität (Börnsen et al. 2, Wen et al. 22). Es ist bisher jedoch noch Gegenstand der Forschung und wird nicht routinemäßig bestimmt. Das gilt ebenso für das Chemokin CXCL3, welches mit erhöhter Krankheitsaktivität gemessen am EDSS, der Schubaktivität und der MRT-Aktivität assoziiert ist (Khademi et al. 2). Biomarker, die die Wirkung einer Therapie wiedergeben können, werden unterschieden in Marker der biologischen und Marker der klinischen Wirkung einer Therapie. Ein Beispiel für einen Biomarker der biologischen Wirkung von IFN-β ist MX (Myxovirus resistance protein ), ein Protein mit antiviralen Eigenschaften, welches unter der Therapie mit IFN-β hochreguliert ist (Pachner et al. 23, Hesse et al. 29). Als Biomarker der klinischen Wirkung der IFN-β-Therapie gilt der Nachweis von NAb, welche im Verlauf gebildet werden können und dann mit einer verminderten Wirksamkeit der Therapie assoziiert sind (Killestein und Polman 2). Als prognostischer Biomarker gilt die Läsionslast im MRT in der frühen Phase der Therapie, welche mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert ist (Killestein und Polman 2). Ein prognostischer Biomarker, welcher die klinische Wirkung von IFN-β im Sinne eines Therapieansprechens oder -nichtansprechens vor Therapiebeginn vorhersagen kann, existiert im klinischen Alltag derzeit nicht und ist Gegenstand intensiver Forschung. In der Arbeit von Hecker et al. wurden 8 Studien analysiert, die vor Therapiebeginn im Blut gemessene Biomarker als prognostische Biomarker für den weiteren klinischen Verlauf der MS vorgeschlagen hatten. Die meisten der vorgeschlagenen molekularen Biomarker-Kandidaten konnten nicht in unabhängigen Studien bestätigt werden (Hecker et al. 2). Biomarker sind prinzipiell bestimmbar durch klinische Betrachtung und Auswertung von krankheitsspezifischen Symptomen und Ereignissen (EDSS, Schub) oder messbar durch Analysen von Gewebe oder Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin oder Liquor (Bielekova 9

25 Einleitung und Martin 24). Blut kann relativ minimal-invasiv und komplikationsarm durch periphere Venenpunktion gewonnen werden. Eine große Anzahl der bisherigen Studien zu molekularen Biomarkern wurde mit peripheren mononukleären Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) durchgeführt (Goertsches et al. 2). Zu den PBMC gehören vor allem Monozyten und Lymphozyten, welche eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen. Das verwendete Material kann wiederum auf verschiedenen Betrachtungsebenen untersucht werden. Die Blutzellen können beispielsweise auf Ebene der DNA (desoxy-ribonucleic acid), der RNA (ribonucleic acid), der Proteine oder der Metaboliten analysiert werden. Bei der hier vorliegenden Arbeit wurden die mrna aus PBMC untersucht. Auf Ebene des Trankriptoms besteht in der Gegenwart die Möglichkeit, die dynamischen Expressionsveränderungen aller Gene zu analysieren. Als Transkriptom bezeichnet man die Gesamtheit der zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimierten Gentranskripte, die in Form von RNA in einer Zelle oder Zellpopulation vorliegen (Zettl und Goertsches 29). Verschiedene Methoden finden zur Erforschung des Transkriptoms Anwendung. Eine davon ist das RNA-Profiling. Darunter versteht man die Quantifizierung der TranskriptMengen in einer Zellpopulation unter Verwendung der Mikrochip-Technologie..3 Technologie und Anwendung von DNA-Mikroarrays DNA-Mikroarrays erlauben die Untersuchung differentieller Genexpression unter Therapie. Die Mikrochips der Firma Affymetrix sind circa,6 cm² groß. Auf ihrer Oberfläche sind an definierten Positionen sogenannte Probes angebracht. Dabei handelt es sich um Gensonden aus synthetisch hergestellten Oligonukleotiden, welche in Form von DNA vorliegen. Jedes Probe enthält in großer Anzahl 25-Basen-lange Oligonukleotide, welche spezifisch für ein ganz bestimmtes Gentranskript sind (Dalma-Weiszhausz et al. 26). Trifft ein RNA-Fragment des untersuchten Probenmaterials auf ein komplementäres Oligonukleotid auf der Chip-Oberfläche, binden beide einander (Hybridisierung). Je mehr Transkripte eines Gens vorhanden sind, desto mehr RNA-Moleküle können an die entsprechende Sonde binden. Durch quantitative Messung der gebundenen RNA lässt sich erkennen, welche Gene zu einem bestimmten Zeitpunkt wie stark exprimiert sind. Mit Hilfe eines Mikrochips können aus wenig Untersuchungsmaterial parallel alle Gene, für die eine Sonde auf dem Mikrochip existiert, in Hinblick auf ihr Expressionsniveau 2

26 Einleitung bestimmt werden (DKFZ: Genomics and proteomics core facility Affymetrix Technology [6.8.22]). Durch serielle Untersuchungen von Patienten unter einer spezifischen Therapie können die Genexpressionsmuster vor und unter Therapie in Hinblick auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten verglichen werden. Gene, deren Expression unter der Therapie verändert ist, werden durch das Medikament direkt oder indirekt reguliert. Dies erfolgt in der Regel indirekt über Beeinflussung von Signalwegen und Modulation der Aktivität von regulatorisch wirksamen Genen. Ein Nutzen eines solchen RNA-Profilings ist in dem Zugewinn an Informationen über diejenigen Gene zu sehen, die durch ein Medikament hoch- oder herunterreguliert werden (Zettl und Goertsches 29). Mit zunehmendem Wissen über die hoch- und herunterregulierten Gene lassen sich Rückschlüsse auf die molekularen Wirkmechanismen ziehen, die dem klinischen Effekt des Medikaments, aber auch möglichen Nebenwirkungen zugrunde liegend. Aktuell wird auf dem Gebiet der differentiellen Genexpression im Blut MS-kranker Patienten unter der IFN-β-Therapie intensiv geforscht (Goertsches et al. 2). Von besonderem Interesse ist es, die mittels RNA-Profiling gewonnenen Expressionsdaten mit klinischen Daten, beispielsweise mit Informationen über den langfristigen Therapieerfolg zu vergleichen. Ein Ziel dabei ist, einen prognostischen Biomarker zu finden, beispielsweise ein Gen, welches schon in der Initialphase einer Therapie signifikant verändert ist und dessen initiale Expression Vorhersagen auf den zu erwartenden Erfolg der Therapie zulässt. Möglicherweise lässt auch erst die Kombination von Expressionsdaten verschiedener Gene eine solche Aussage zu. Auf Basis von Genexpressions-Studien wurden bereits eine Vielzahl von Genen identifiziert, die unter der Therapie mit IFN-β bei MS-Patienten differentiell exprimiert sind (Goertsches et al. 2, Paap et al. 22). In einigen Fällen wird eine Korrelation mit einem bestimmten Ansprechen auf die Therapie postuliert (Wandinger et al. 23, Stürzebecher et al. 23). Bisher konnte jedoch keiner dieser möglichen prognostischen Biomarker im klinischen Alltag etabliert werden. 2

27 2 Fragestellung 2 Fragestellung IFN-β gehört zur weltweit etablierten immunmodulierenden Basistherapie der schubförmigen MS. Die molekularen Mechanismen, die für den therapeutischen Effekt der Therapie verantwortlich sind, sind bisher jedoch nur unvollständig verstanden. Trotz der guten Wirksamkeit der IFN-β-Präparate in großen multizentrischen Studien kann das Ansprechen auf die jeweilige Therapie für den einzelnen Patienten nicht vorhergesagt werden. Ziel der vorliegenden Untersuchungen ist, das individuelle Ansprechen von zwölf MSPatienten unter der Therapie mit IFN-β a s.c. zu evaluieren sowie durch Analyse der molekularen Veränderungen der Genexpression im Blut der einzelnen Patienten ein verbessertes Verständnis der molekularen Wirkungsweise des Medikaments zu erlangen. Hierzu wurden die Patienten vor Etablierung der Therapie sowie zu definierten Zeitpunkten unter der Therapie einerseits klinisch untersucht, andererseits wurde ihr Blut auf Transkriptom-Ebene analysiert (Abbildung 2). Zur Auswertung des klinischen Verlaufs der Patienten sollten folgende Fragen untersucht werden: Wie ist die Adhärenzrate der Patienten über einen Beobachtungszeitraum von fünf Jahren und was sind die Gründe für den Therapieabbruch? Wie gestaltet sich der Krankheitsverlauf der einzelnen Patienten unter der Therapie im Hinblick auf die klinischen Parameter Schubaktivität und EDSSProgression? Bei welchen Patienten besteht trotz Therapie weiterhin eine deutliche Krankheitsaktivität und spiegelt sich diese in der cerebralen Bildgebung wider? Welche Nebenwirkungen treten auf? Um einen tieferen Einblick in die molekulare Wirkung von IFN-β zu erhalten, sollten folgende molekularbiologischen Fragen untersucht werden: Welche Gene werden kurz- und langfristig unter der IFN-β-Therapie differentiell exprimiert? 22

28 2 Fragestellung An welchen molekularen Funktionen und Prozessen sind diese Gene maßgeblich beteiligt? Für welche Transkriptionsfaktoren haben diese Gene Bindestellen in ihren Promotorregionen? Durch welche Faktoren wird die Transkription dieser Gene also maßgeblich reguliert? Spiegeln sich Unterschiede der Patienten in der Genexpression in klinischen Parametern wider? Lassen sich durch Analyse der Genfunktionen Rückschlüsse auf die durch IFN-β beeinflussten biologischen Mechanismen ziehen? 23

29 3 Patienten und Methoden 3 Patienten und Methoden 3. Studiendesign und -ablauf In der prospektiven Längsschnittstudie wurden Patienten mit nach den McDonaldKriterien von 2 gesicherter schubförmiger MS über einen Zeitraum von fünf Jahren in der Universitätsklinik für Neurologie in Rostock beobachtet. Sie wurden nach den Leitlinien der deutschen Gesellschaft für Neurologie (DGN) und der Multiple Sklerose Therapie Konsensus Gruppe (MSTKG) auf eine immunmodulatorische Behandlung mit IFN-β a s.c. dreimal wöchentlich eingestellt (Abbildung 2). Vor Initiierung der Therapie wurden klinische und paraklinische Parameter dokumentiert und als Zeitpunkt t (Baseline) festgehalten. Während des Beobachtungszeitraums wurden Folgeuntersuchungen durchgeführt und deren Ergebnisse mit denen der BaselineUntersuchung verglichen. Hinsichtlich Veränderungen von Krankheitsprogression und Schub wurden die Patienten je nachdem ob sie einen stabilen Befund oder eine Befundverschlechterung zeigten zwei Gruppen zugeordnet: Responder und Nonresponder. Bei klinischer Indikation wurden zusätzlich optional MRT- und EP-Untersuchungen durchgeführt und ausgewertet. Nach ausführlicher mündlicher und schriftlicher Aufklärung der Patienten über Hintergründe und Ablauf der Studie erfolgten Blutabnahmen vor (t, Baseline) und zwei Tage (t), ein Monat (t2), ein Jahr (t3) und zwei Jahre (t4) nach Beginn der IFN-β atherapie. Aus diesen Blutproben wurden PBMC isoliert und auf Transkriptomebene mittels DNA-Mikrochips am Institut für Immunologie der Universität Rostock untersucht, um die kurzfristige und langfristige differentielle Genexpression unter Therapie im Vergleich zur Baseline-Expression zu analysieren (Abbildung 2). Die Durchführung der Studie wurde von der Ethikkommission der Landesärztekammer Mecklenburg-Vorpommern genehmigt (Reg.-Nr. II HV 27/23). Von allen Patienten wurde vorher das schriftliche Einverständnis zur Studienteilnahme eingeholt. Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. 24

30 3 Patienten und Methoden = Therapiebeginn Abbildung 2: Studiendesign Von zwölf MS-Patienten wurde vor Therapieinitiierung, zwei Tage nach der ersten Injektion sowie einen Monat, ein Jahr und zwei Jahre nach Therapiebeginn Blut entnommen. Mittels eines Ficoll-Gradienten wurden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) separiert. Aus diesen Zellen wurde die Gesamt-RNA extrahiert und auf Mikroarrays hybridisiert. 3.2 Patientenkollektiv Es wurden zwölf kaukasische Patienten mit schubförmiger MS im Alter zwischen 8 und 52 Jahren im Zeitraum von Oktober 2 bis September 24 in die Studie eingeschlossen. Davon waren acht weiblichen und vier männlichen Geschlechts. Das Durchschnittsalter betrug 36,4 Jahre (Spannweite (SW): 8-52, Standardabweichung (Standard Deviation, SD):,7). In zwei Fällen lag eine familiäre MS vor (Tabelle 3). 25

31 3 Patienten und Methoden Tabelle 3: Patientencharakteristika Patient Mittelwert Geschlecht w w w w m w w w m m w m Alter 4,6 52,4 35,8 9,6 48,2 8, 43,8 43,3 26, 25,6 48,7 34,5 36,4 KD ,3 SyD ,6 familiäre MS Geschlecht: w: weiblich, m: männlich familiäre MS: : nein, : ja KD: Krankheitsdauer: Diagnosestellung bis Therapiebeginn in dieser Studie in Monaten SyD: Symptomdauer: Erstes MS-assoziiertes Symptom bis Diagnosestellung in Jahren Die Patienten waren bis auf zwei Ausnahmen therapienaiv, hatten also bisher keine immunmodulatorische Sekundärprophylaxe erhalten. Eine Patientin hatte eine Therapie mit IFN-β a s.c. zuvor wegen eines Kinderwunsches beendet und war bei Wiederaufnahme der Therapie nach 4 monatiger Pause in die Studie eingeschlossen worden. Eine weitere Patientin hatte zuvor während ihrer Schwangerschaft für sechs Monate Immunglobuline erhalten. Keiner der Patienten hatte in den 3 Tagen vor der ersten Blutabnahme Glukokortikosteroide oder ein anderes Immuntherapeutikum erhalten. Die mittlere Dauer zwischen Diagnosesicherung und Therapiebeginn (Krankheitsdauer) in der vorliegenden Studie betrug 7,3 Monate (SW: -33, SD:,6). Im Durchschnitt lagen zwischen dem ersten MS-assoziierten Symptom und der Diagnosestellung (Symptomdauer) 3,6 Jahre (SW: -9, SD: 2,7). Die Patienten hatten vor Therapiebeginn im Durchschnitt einen EDSS von 2,3 Punkten (SW:,-5,, SD:,4). 26

32 3 Patienten und Methoden 3.3 Klinische Untersuchungen 3.3. EDSS und Schubaktivität Die Krankheitsaktivität wurde klinisch durch die Parameter Schubaktivität und Krankheitsprogression, operationalisiert mittels EDSS, erfasst. Die Schübe wurden wie in Kapitel..3 beschrieben definiert und die Häufigkeit dokumentiert. Responder waren Patienten ohne neues Schubereignis ab dem siebten Therapiemonat. Nach der sechsmonatigen Initialphase nach Therapiebeginn galt das Auftreten eines Schubes als Nonresponse. Die Krankheitsprogression wurde durch Auswerten der Veränderungen des im schubfreien Intervall erhobenen EDSS ermittelt. Die Werte der Folgeuntersuchungen wurden mit dem Baseline-EDSS (zum Zeitpunkt t) verglichen. Eine über drei Monate persistierende Erhöhung um, Punkte wurde als ein unzureichendes Ansprechen auf die Therapie, ein gleichbleibender EDSS oder eine Verbesserung entsprechend als Therapieansprechen gewertet. Aus den beiden Parametern Schub und Progression wurde ein Krankheitsaktivitätsscore ermittelt, der diese Parameter miteinander kombiniert. Hierbei wurden ebenfalls zwei Gruppen gebildet und eine Einteilung in Responder und Nonresponder vorgenommen. Ein Responder war dabei nur, wer sowohl in der Kategorie Schub als auch in der Kategorie Progression als Responder gewertet wurde. Ein Nonresponder war somit ein Patient, der entweder nach Progression oder Schubrate ein Nonresponder war Paraklinik Die paraklinische Krankheitsaktivität konnte mittels der MRT-Untersuchung und der Messung der EP (VEP, SSEP, MEP) ausgewertet werden. Die Untersuchungen erfolgten bei klinischer Indikation. MRT Die Durchführung der cerebralen MRT erfolgte an Geräten der Stärke,5 Tesla im stationären und ambulanten Bereich. Die Schichtdicke betrug dabei 5 mm. Es wurden folgende Parameter bewertet: 27

33 3 Patienten und Methoden Anzahl der T2-Läsionen Anzahl der Kontrastmittel (KM) aufnehmenden Herde (T-gewichtet) Anzahl der Black holes (T-gewichtet) Atrophie anhand des Durchmessers des III. Ventrikels Zur Auswertung bildmorphologischer Veränderungen im Krankheitsverlauf unter der Therapie wurde das Baseline-MRT mit einem weiteren, späteren MRT verglichen. Die Zunahme eines der Unterpunkte (mindestens eine neue T2-Läsion, Auftreten von neuen KM-aufnehmenden Herden oder Black holes, Zunahme des Vetrikeldurchmessers um mindestens,5 mm gegenüber dem Ausgangswert) unter Therapie zeigte eine vorhandene Krankheitsaktivität an. Die beiden Gruppen, stabiler Befund und bildmorphologische Krankheitsaktivität, wurden unterschieden. EP Des Weiteren wurden die folgenden EP untersucht: Visuell evozierte Potentiale (VEP), somatosensibel evozierte Potentiale (SSEP) und motorisch evozierte Potentiale (MEP). Die Auswertung der VEP erfolgte anhand der Latenz der P-Welle. Typischerweise zeigt sich bei Affektion des Nervus Opticus durch die MS eine verlängerte Latenz bei erhaltener Konfiguration und Amplitude der Ableitung (McDonald 2). Die SSEP wurden unterteilt in Messungen der oberen Extremität (OE) (Potentiale des Nervus Medianus durch Messung der N2) und der unteren Extremität (UE) (Potentiale des Nervus Tibialis durch Messung der P4). Die MEP wurden am Musculus Interosseus dorsalis I und am Musculus Tibialis anterior gemessen. Als pathologisch galt eine Latenzverzögerung oder Amplitudenreduktion gegenüber den patientenspezifischen Normwerten des elektrophysiologischen Labors der neurologischen Universitätsklinik Rostock. Eine pathologische Zunahme der Latenz bzw. Abnahme der Amplitude um % des Ausgangswertes wurde als Verschlechterung der jeweiligen EP-Befunde und als paraklinische Krankheitsaktivität gewertet Nebenwirkungen der Interferon-β-Therapie Bei jedem Klinikaufenthalt und jeder ambulanten Vorstellung wurden die Nebenwirkungen (NW) dokumentiert und in 3 Gruppen (A-C) eingeteilt. 28

34 3 Patienten und Methoden In die Gruppe A wurden Hauterscheinungen an der Injektionsstelle eingeordnet. In der Gruppe B wurden grippeähnliche Symptome subsummiert. Gruppe C fasst andere NW, wie eine Erhöhung der Transaminasen oder die Ausbildung von NAb, zusammen. Die Untersuchung der NAb beruhte auf dem Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und auf dem MX-Assay (Vallittu et al. 28). Die Messung erfolgte bei klinischer Indikation an der medizinischen Hochschule Hannover. 3.4 Molekulare Untersuchungen 3.4. Blutprozessierung und Mikroarray-Analysen Die Blutabnahmen erfolgten unmittelbar vor der ersten Interferonapplikation und in den Folgeuntersuchungen vor Medikamentenapplikation durch periphere Venenpunktion. Es wurden 2 ml Blut in EDTA-Röhrchen (Ethylendiamintetra-essigsäure) entnommen. Das Blut wurde stets innerhalb von zwei Stunden prozessiert. Aus den Blutproben wurden die PBMC mit Hilfe eines Ficoll-Gradienten separiert. Mittels RNeasy (Qiagen) wurde die gesamte RNA gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Die Messung der RNA-Konzentration erfolgte mit einem Nanodrop Spectrophotometer. Die Qualitätskontrolle erfolgte mittels Ethidiumbromid-Agarosegel-Elektrophorese. Da komplementäre DNA (cdna) haltbarer als RNA ist, wurde die RNA zunächst mit Hilfe einer reversen Transkription zu cdna zur Lagerung umgeschrieben. Vor der Verwendung in weiteren Arbeitsschritten wurde die cdna wieder in crna (complementary RNA) umgeschrieben und mit Biotin markiert. Die crna wurde dann in viele kurze Fragmente, bestehend aus 3 bis 4 Basen, zerteilt. Diese markierten crna-fragmente wurden dem Protokoll des Herstellers entsprechend auf HG-U33 Plus 2. Oligonukleotid-Mikrochips der Firma Affymetrix aufgebracht. Auf ihrer Oberfläche befinden sich ca. Mio unterschiedliche Probes. Nach Aufbringen der RNA erfolgte die Hybridisierung der RNA-Fragmente an die komplementären Gensonden (Probes). Im nächsten Arbeitsschritt wurde die nicht-gebundene RNA abgewaschen und die zu- 29

35 3 Patienten und Methoden rückgebliebene, gebundene RNA mit einem fluoreszierenden Biotin-bindenden Molekül inkubiert. Daraufhin wurde jeder Mikrochip mit einem Laser mit einer Auflösung von,56 µm gescannt. Hierzu wurde der Hewlett Packard GeneArray-Scanner 25A der Firma Affymetrix verwendet. Anhand des Fluoreszenzmusters konnte nun das Ausmaß der Expression der einzelnen Gene quantifiziert werden. Je stärker das Fluoreszieren ist, desto mehr RNA-Moleküle wurden gebunden. Die 6 Mikrochips wurden im Zeitraum vom 2. bis zum gescannt Datenvorverarbeitung Um aus den Rohdaten (die Fluoreszenzsignale der einzelnen Sonden auf dem Chip) Genexpressionswerte zu berechnen, wurde der MAS5.-Algorithmus verwendet. Der Algorithmus benötigt die Information, welches Gen durch welches Probeset repräsentiert wird und wo sich die Probes zu diesem Probeset auf dem Chip befinden. Nach der originalen Chipdefinition von Affymetrix gibt es teilweise für ein Gentranskript mehrere Probesets. Ebenso binden einige Probes an mehrere Gentranskripte. Dadurch sind Spezifität und Sensitivität der Probesets in einigen Fällen nicht optimal. Daher wurde anstatt der originalen Chipdefinition von Affymetrix ein custom chip definition file (CDF) der Datenbank GeneAnnot in der Version 2.. verwendet (Ferrari et al. 27). Diese Chipdefinition definiert Probesets neu und zwar so, dass jeweils ein Probeset sämtliche Probes enthält, die nach heutiger Genannotation spezifisch für genau ein bestimmtes Gentranskript sind. Die Bestimmung der Transkriptionslevel ist dadurch genauer und man erhält für jeweils ein Gentranskript genau ein Expressionssignal. Es wurden pro Mikroarray insgesamt 8862 verschiedene Transkripte gemessen. Die Daten über die Signalintensität wurden für die zwölf Patienten zu jeweils fünf Zeitpunkten erfasst. Die Rohdaten wurden gemäß dem MIAME-Standard (Minimum Information About a Microarray Experiment) gespeichert (Brazma et al. 2) und sind abrufbar von der Datenbank Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE33464 (Gene Expression Omnibus-Datenbank (GEO) [6.8.22]). Die Datennormalisierung erfolgte mittels einer loess-normalisierung Expressionsveränderungen und Clustering Um diejenigen Gene zu identifizieren, die besonders stark unter der Therapie in ihrer 3

36 3 Patienten und Methoden Expression verändert sind, also um hoch- und herunterregulierte Gene herauszufiltern, wurden die Genexpressionslevel zum Zeitpunkt der Baselineuntersuchung mit jeweils einem weiteren Zeitpunkt unter der Therapie verglichen. Ein übliches Filterkriterium ist der fold change. Darunter versteht man den Quotienten aus der für jedes Gen jeweils gemessenen Signalintensität zu zwei verschiedenen Zeitpunkten. Er gibt Aufschluss über das Ausmaß der Signalveränderung unter der Therapie. Nachteil des fold change ist, dass die relativen Abweichungen mit abnehmender Signalintensität zunehmen, da Messungenauigkeiten einen größeren relativen Einfluss auf niedrig exprimierte Gene haben (Yang et al. 22). Als Filterkriterium wurde daher der MAID-Score, ein von der Signalintensität abhängiger fold change, verwendet (Hecker et al. 29). Pro Zeitpunktvergleich wurde für jedes Gen und jeden Patienten ein MAID-Score berechnet. Ein positiver MAID-Score entspricht einer Hochregulation, ein negativer MAID-Score entspricht einer Herunterregulation. Gene, die für mindestens sechs der zwölf Patienten einen MAID-Score > 2,5 oder < -2,5 hatten, wurden letztendlich gefiltert. Die Gene, die die Filterkriterien erfüllten, flossen in die weiteren Funktions- und Interaktionsanalysen ein. Hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs ihrer Expression wurden die gefilterten Gene mittels einer hierarchischen Clusteranalyse gruppiert. Die Cluster bestehen dabei aus Genen, deren Expression unter der Therapie eine im zeitlichen Verlauf ähnliche Veränderung aufweist. Für die Clusteranalyse wurden die Daten der Expressionslevel jedes Gens vorher standardisiert, so dass für jedes Gen eine Varianz von und ein Mittelwert von bestand. Die Clusteranalyse beruhte auf euklidischen Distanzen und dem complete linkage Verfahren. In den untersuchten PBMC befinden sich verschiedene Lymphozytenfraktionen und Monozyten. Um festzustellen, von welchen einzelnen Zelltypen die gefilterten Gene exprimiert werden, wurde der Datensatz Haematlas (Watkins et al. 29) verwendet, welcher in der Datenbank ArrayExpress verfügbar ist (ArrayExpress: Datenbank des European Bioinformatics Institute (Datensatz: E-TABM-633) [6.8.22]). Dabei handelt es sich um Genexpressionsdaten gesunder Probanden zu verschiedenen ZellSubpopulationen des Blutes. Es wurden die prozessierten Daten heruntergeladen und Mittelwerte der Signalintensitäten jedes einzelnen Gens über die Replikatemessungen für die verschiedenen Zelltypen berechnet. Lag dieser Mittelwert über einer Signalintensität 3

37 3 Patienten und Methoden von 4, wurde geschlussfolgert, dass das Gen von dem jeweiligen Zelltyp exprimiert wird. Diese Signalintensität wurde willkürlich gewählt Funktionelle Gruppen Des Weiteren wurden die Funktionen der gefilterten Gene untersucht. Unter Verwendung der Datenbanken SABiosciences und KEGG pathways (SABiosciences: a QIAGEN company. Complete list of SABiosciences Pathway-focused Arrays. [6.8.22], KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [6.8.22]) wurden die Gene funktionellen Kategorien zugeordnet. Diese Datenbanken definieren Gengruppen, indem sie Gene beispielsweise einer bestimmten Funktion, einer zellulären Lokalisation, einem molekularen Prozess oder einem Signalweg zuordnet. Die KEGG-Annotationen wurden dabei dem Bioconductor Paket org.hs.eg.db entnommen. Daraufhin wurden Genfunktionen ermittelt, die charakteristisch für die gefilterten Gene sind. Mit Hilfe des Softwareprogramms GOstats (Falcon und Gentleman 27) wurde die Häufigkeit jeder funktionellen Gruppe unter den gefilterten Genen (count) erfasst und mit der Häufigkeit unter allen exprimierten Genen (expected count) verglichen. Als solche wurden Gene angesehen, die in mindestens einer der 6 Patientenproben eine Signalintensität von über aufwiesen. Wenn der count größer als der expected count ist, bedeutet dies eine Überrepräsentation der Genfunktion unter den gefilterten Genen. Aus dem Verhältnis von count und expected count konnte ein p-wert berechnet werden. Es wurden nur funktionelle Kategorien mit einem p-wert <, erfasst, zu denen sich mindestens fünf der gefilterten Gene zuordnen ließen. Diese Analyse ergab, welche Genfunktionen überrepräsentiert und typisch für die unter der Therapie veränderten Gene sind Analyse der beteiligten Transkriptionsfaktoren Um die regulatorischen Einflüsse auf die gefilterten Gene näher zu beleuchten und die genregulatorischen Interaktionen als Netzwerk zu visualisieren, wurden nach Transkriptionsfaktor-Bindestellen (TFBS) in den Promotorregionen der Gene gesucht. Es wurden drei Datenbanken genutzt, die auf Basis von Positions-Gewichts-Matrizen (Position-Weight-Matrix, PWM) TFBS im Genom vorhersagen: UCSC tfbsconssites, cisred Human 9 und SwissRegulon (UCSC Genome Browser [6.8.22], cisred: cisregulatory element database [6.8.22], SwissRegulon [6.8.22], Robertson et al. 32

38 3 Patienten und Methoden 26, Pachkov et al. 27, Dreszer et al. 22). Es wurde mit dem gleichen statistischen Verfahren wie bei der Funktionsanalyse berechnet, welche TFBS in den Regulationsregionen der gefilterten Gene im Vergleich zu allen exprimierten Genen überrepräsentiert sind. Die Regulationsregionen wurden definiert als je Basenpaare ober- und unterhalb des Transkriptionsstarts der jeweiligen Gene. TFBS mit einem p-wert <, wurden als signifikant häufiger vorkommend bewertet. Diese Analyse ergab somit, welche TF maßgeblich an der Regulation der unter Therapie regulierten Gene beteiligt sind. In einer graphischen Darstellung wurden die Interaktionen zwischen den entsprechenden Trankriptionsfaktoren und den durch sie regulierten Genen veranschaulicht. Als solche wurden Gene gewertet, die eine oder mehrere dieser Bindestellen in ihrer Regulationsregion aufwiesen. Die Interaktionen wurden mit der Software Cytoscape 2.8. visualisiert (Cytoscape: An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [6.8.22], Smoot et al. 2). 33

39 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4. Patientencharakteristika Von den zwölf in die Studie eingeschlossenen Patienten konnten elf über einen Zeitraum von 6 Monaten begleitet und in regelmäßigen Abständen untersucht werden. Ein Patient verließ die Studie vorzeitig im fünften Jahr (Patient (Pat) 9). Sieben Patienten erhielten das Medikament über den gesamten Studienzeitraum. Die restlichen fünf Patienten beendeten die Therapie vorzeitig, zwei davon bereits im zweiten Jahr und damit vor der letzten Blutentnahme (Pat 7 und 9). Die Gründe hierfür waren je in einem Fall Kinderwunsch (Pat 4), der Übergang in eine sekundär chronisch progrediente Verlaufsform (Pat 5), der Nachweis von NAb (Pat 8), Nebenwirkungen (Erhöhung der Leberfermente) (7) und Noncompliance (Pat 9). Pat 7 und 4 erhielten im Anschluss an die IFN-β Therapie Immunglobuline. Pat 4 wurde auf Glatirameracetat umgestellt. Die Eskalationstherapie bei Pat 5 erfolgte mit Mitoxantron. Pat 9 entschied sich gegen eine weitere immunmodulatorische Therapie. Bei Therapiebeginn wurden neun Patienten auf die niedrigere Dosis 22 µg IFN-β a s.c. eingestellt (Pat, 2, 4, 5, 7, 8, 9,, 2) und drei auf 44 µg (Pat 3, 6, 7). Bei sechs der Patienten, die zu Beginn die niedrige Dosis erhalten hatten, wurde die Dosis im Verlauf bei guter Verträglichkeit erhöht (Pat, 2, 5, 8, 2). NAb wurden nur in zwei Fällen aufgrund des Verdachts auf Therapieversagen bestimmt und waren in einem Fall positiv (Pat 8) und im zweiten Fall negativ (Pat ). Das Verhältnis zwischen Männern und Frauen betrug :2, passend zu den Beobachtungen, dass Frauen von der schubförmigen Verlaufsform häufiger als Männer betroffen sind (Greer und McCombe 2). 34

40 4 Ergebnisse 4.2 Klinische Beobachtungen unter der Interferon-β-Therapie 4.2. EDSS Der EDSS bei Baseline betrug 2,3 ±,4 (Mittelwert ± SD, SW: 5). Im Verlauf von zwei Jahren erhöhte sich der Wert auf 3, ±,9. Für die elf Patienten, welche über den gesamten Zeitraum von 6 Monaten an der Studie teilnahmen, stieg der Mittelwert nach dieser Zeit auf 3,7 ±,9 (Tabelle 4). Nach der oben beschriebenen Definition (Kapitel 3.3.) für Response und Nonresponse waren nach 24 Monaten bezüglich des Kriteriums Progression von den zehn Patienten, welche das Medikament weiterhin erhielten, fünf Responder und fünf Nonresponder. Nach 6 Monaten verblieben sieben Patienten unter Therapie mit IFN-β a s.c., davon waren drei Patienten Responder und vier Nonresponder. Bei näherer Betrachtung verschärft sich das Ergebnis jedoch zugunsten der Nonresponder. Drei der fünf Patienten, die das Medikament vorzeitig abgesetzt hatten und die hier keiner Gruppe zugeordnet wurden, erfüllten bereits vor Absetzen der IFN-β-Therapie die Kriterien eines Nonresponders. 35

41 4 Ergebnisse Tabelle 4: EDSS-Werte der zwölf Patienten im langfristigen Verlauf der Therapie Die EDSS-Bestimmung erfolgte jeweils nach einem, zwei, drei, vier und fünf Jahren. Die Werte wurden jeweils mit dem Baseline-EDSS verglichen. Dargestellt ist außerdem, welche Patienten die Therapie mit Interferon-β a während des Studienzeitraums vorzeitig absetzten. Patient Mittelwert SD EDSS (in Monaten) Baseline , ,5 2, , ,5 2,5 4,5 5,5 2, ,5 5, ,5,5,5, ,5 4 2,3 2,4 3, 3,,4,6,9 2, ,5 6 5, ,4,9 6 3,5 4,5 4 5,52 5, ,5 4 3,7,9 IFN-β a abgesetzt aufgrund von Kinderwunsch IFN-βa abgesetzt aufgrund von Übergang in eine sekundär chronisch progrediente Verlaufsform 3 IFN-β a abgesetzt aufgrund von Nebenwirkungen (Leberfermenterhöhung) 4 IFN-β a abgesetzt nach Nachweis neutralisierender Antikörper 5 IFN-β a eigenständig abgesetzt (Noncompliance) 2 SD: Standardabweichung Baseline: Zeitpunkt t vor Therapiebeginn Blau: Patient nicht mehr unter Therapie mit IFN-β a s.c Schubaktivität unter der Therapie In den ersten sechs Monaten nach Therapiebeginn hatten drei von zwölf Patienten einen Schub, welcher gemäß der hier verwendeten Kriterien (Kapitel 3.3.) nicht in die Bewertung zur Response mit einbezogen wurde. Innerhalb des siebten bis 24. Monats kam es bei den zehn Patienten, die sich über den 36

42 4 Ergebnisse Zeitraum von zwei Jahren unter Therapie befanden zu durchschnittlich, Schüben (SD:,, SW: -3). Drei der zehn Patienten blieben über diesen Zeitraum schubfrei. Hinsichtlich des Kriteriums Schub waren von den zehn Patienten unter Therapie nach 24 Monaten demzufolge drei Responder und sieben Nonresponder. Über den gesamten Studienzeitraum von 6 Monaten berechnet, kam es bei den sieben unter Therapie verbliebenen Patienten mit Ausnahme von Pat 3 zu Schüben, im Durchschnitt zu 2,7 Schüben (SD: 2,, SW -6) (Tabelle 5). Tabelle 5: Aufgetretene Schübe im Studienverlauf von 6 Monaten Die Tabelle gibt die Anzahl der Schübe pro Zeiteinheit und pro Patient an. Die blauunterlegten Felder bezeichnen den Zeitraum, in dem die jeweiligen Patienten bereits nicht mehr unter Therapie mit IFN-β waren. Patient Mittelwert Schubmanifestation (in Monat) ,3,3,7,4,6,5 Blau: Patient nicht mehr unter Therapie mit IFN-β a s.c. 37

43 4 Ergebnisse Krankheitsaktivitätsscore Der Krankheitsaktivitätsscore setzt sich aus den Parametern Krankheitsprogression und Schub zusammen. Responder nach dem Krankheitsaktivitätsscore war nur, wer in diesen beiden Kategorien Responder war. Nach 24 Monaten hatten zwei Patienten die Therapie mit IFN-β a s.c. abgesetzt. Von den verbleibenden zehn Patienten waren nach oben genannter Definition zwei Patienten Responder. Acht Patienten waren als Nonresponder zu bewerten. Nach 6 Monaten wurde bei allen Patienten, bei denen die Therapie weitergeführt wurde, Krankheitsaktivität in Sinne eines Schubes oder einer EDSSProgression festgestellt. Alle Patienten, die das Medikament vorzeitig abgesetzt hatten waren ebenfalls Nonresponder. Nach 24 Monaten waren von den zehn Patienten nach dem Kriterium EDSS-Progression fünf Patienten als Responder einzustufen und nach dem Kriterium Schub drei Patienten. Dabei waren nur zwei Patienten nach beiden Kriterien Responder (Pat 3, 4, Tabelle 6). Tabelle 6: Krankheitsaktivitätsscore Aus den Parametern Schub und EDSS-Progression wurden ein Score gebildet. Nach diesem Score war ein Patient nur dann als Responder einzustufen, wenn er sowohl im Kriterium EDSS-Progression als auch im Kriterium Schub ein Responder war. Der Tabelle ist zu entnehmen, welche Patienten nach diesen Kriterien zur Gruppe der Responder (R) und welche zur Gruppe der Nonresponder (NR) gehörten. Blau unterlegt ist hier ebenfalls der Zeitraum, in dem die Patienten nicht mehr unter Therapie waren. Patient R NR R R NR R NR NR R NR R NR Krankheitsaktivitätsscore (nach Monaten) NR NR NR NR NR NR R R R R R R NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR R R NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR Blau: Patient nicht mehr unter Therapie mit IFN-β a s.c NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR

44 4 Ergebnisse Eine Schubaktivität ohne persistierendes Defizit konnte bei drei Patienten festgestellt werden. Bei einem Patienten wurde eine Progression dokumentiert, ohne dass ein Schub abzugrenzen war (Abbildung 3). NR: Nonresponder Pat: Patient Abbildung 3: Korrelation zwischen Schubaktivität und EDSS-Progression Die Abbildung zeigt, dass nach 24 Monaten nicht bei allen Patienten mit einer Schubaktivität auch eine EDSS-Progression einher ging und das ein Patient eine EDSS-Progression zu verzeichnen hatte, ohne dass es zu einem Schubereignis gekommen war. 39

45 4 Ergebnisse Nebenwirkungen im Studienverlauf Mit zwei Ausnahmen (Pat, Pat 2) traten bei allen Patienten NW auf. In zwei Fällen führten diese zum Abbruch der Therapie (Pat 7 und 8). Nebenwirkungen waren insbesondere früh nach Therapiebeginn zu erwarten, traten in den ersten sechs Monaten jedoch nur bei drei Patienten auf (Pat 3, 8, ) und waren bei diesen Patienten auch im Verlauf nicht komplett regredient. Neun von den zwölf Patienten gaben mindestens zu einem Zeitpunkt Hautrötungen an der Injektionsstelle an. Bei drei der zwölf Patienten kam es zu grippeähnlichen Symptomen. In einem Fall kam es zur Erhöhung der Leberfermente (Pat 7) und in einem Fall konnten NAb nachgewiesen werden (8). Drei der zwölf Patienten berichteten sowohl über grippeartige Symptome als auch über Hautveränderungen. Die Nebenwirkungen waren mehrheitlich leicht bis moderat und konnten mit regelmäßiger oder nur bei Bedarf verabreichter Begleitmedikation (z.b. Nichtsteroidale Antirheumatika) gut beherrscht werden. Insgesamt ergab die Auswertung der Daten, dass Nebenwirkungen häufig beklagt wurden und auch im langfristigen Therapieverlauf persistieren können (Tabelle 7). 4

46 4 Ergebnisse Tabelle 7: Nebenwirkungen Diese Tabelle beschreibt die Art der Nebenwirkungen (NW) sowie die jeweiligen Schweregrade der NW unter der Therapie mit IFN-β a s.c. pro Patient und pro Zeiteinheit. Patient Art Grad B 2 B 2 B 2 Nebenwirkungen (Monat) Art Grad Art Grad Art Grad A 2 A 2 B 2 B 2 B 2 B A B A A A,C,3 B 2 A A 2 A Art Grad A A 2 A A,C, C 3 A 49-6 Art Grad A 2 A A - : Keine Nebenwirkungen Blau: Patient nicht mehr unter Therapie mit IFN-β a s.c. Art der Nebenwirkungen: A: Hauterscheinungen B: grippeähnliche Symptome C: andere (Transaminasenerhöhung, neutralisierende Antikörper Grad der Nebenwirkungen : leichte NW 2: moderate NW 3: schwerer NW (Therapie beendet) 4.3 Paraklinische Ergebnisse 4.3. Magnet-Resonanz-Tomographie Das Ausgangs-MRT vor der Einstellung auf IFN-β a s.c. war bei allen Patienten pathologisch. Nach einer mehrjährigen Therapie mit IFN-β wurden bei acht Patienten bildmorphologische Verlaufskontrollen durchgeführt. Die Verlaufskontrollen wurden nach 4

47 4 Ergebnisse durchschnittlich 59 Monaten durchgeführt (Tabelle 8). Insgesamt zeigte sich bei vier der acht Patienten ein stabiler MRT-Befund, bei den anderen vier kam es jeweils in einem der vier Kriterien zu einer Befundverschlechterung. Drei der Patienten, die bildmorphologische Krankheitsprogression aufwiesen, hatten eine EDSSProgression im Verlauf (Pat 2, 3, ). Pat 2 hatte einen stabilen EDSS auf hohem Niveau. Keiner der Patienten zeigte einen neuen Gd-aufnehmenden Herd, passend zum klinischen Befund, der bei Durchführung der MRT im schubfreien Intervall jeweils stabil war. Tabelle 8: MRT-Verlaufskontrolle bei acht Patienten Nach durchschnittlich 59 Monaten wurde bei acht der zwölf Patienten ein weiteres MRT durchgeführt, welches mit dem Baseline-MRT verglichen werden konnte. Hierfür wurde ein möglichst spät im Studienverlauf und teilweise auch nach Beendigung des offiziellen Beaobachtungszeitraum durchgeführtes MRT gewählt. In der Gesamtbewertung wurde ein MRT, das in einem der vier Kriterien eine Befundverschlechterung aufwies, als verschlechtert angesehen (Gesamt). Dies zeigte sich bei der Hälfte der untersuchten Patienten. Patient MRT-Befunde KM BH = = = = = = = = = = Monat T2 = = = = 36 = = = = = = A = = = = Gesamt = = = = = = = = = : stabiler Befung : bildmorphologische Progression Blau: Patient zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht mehr unter Therapie T2: T2-Läsion im MRT KM: Kontrastmittel-aufnehmende Herde BH: Black holes A: Atrophie 42

48 4 Ergebnisse Evozierte Potentiale Die VEP zum Zeitpunkt t waren bei fünf von zwölf Patienten pathologisch. Bei acht Patienten wurden im Verlauf Kontrolluntersuchungen durchgeführt. Diese zeigten nach durchschnittlich 6,5 Monaten bei fünf Patienten einen stabilen Befund. Bei drei Patienten kam es zu einer Befundverschlechterung, wobei in einem dieser Fälle die Therapie bereits aufgrund von Progression und Übergang in eine chronische Verlaufsform abgebrochen worden war. Die Nachuntersuchungen der SSEP erfolgten nach durchschnittlich 69,3 Monaten bei sieben Patienten. Im SSEP der oberen Extremität wurden bereits zur Baseline bei drei Patienten pathologische Befunde gemessen, im SSEP der unteren Extremität bei allen sieben Patienten. Während in den Messungen der OE im Verlauf drei von sieben Patienten stabile Befunde hatten, ergaben die Messungen der UE bei allen sieben Patienten eine weitere Befundverschlechterung. Die MEP wurden bei sechs Patienten nach durchschnittlich 69,6 Monaten kontrolliert. Vier Patienten hatten dabei sowohl in der OE als auch in der UE stabile Befunde. Zwei Patienten zeigten eine Befundverschlechterung gegenüber der Baseline. Diese Patienten hatten die IFN-β-Therapie zum Zeitpunkt der zweiten Messung aufgrund von Progression der Krankheit abgesetzt. Insgesamt zeigte sich, mit Ausnahme von Pat 7, bei dem nur das VEP nach siebenmonatiger Therapie als Verlaufskontrolle zur Verfügung stand, bei allen Patienten zumindest in einer der Messungen eine Verschlechterung der paraklinisch erhobenen Befunde. Insbesondere zeigte sich eine Latenzverzögerung in den somatosensibel evozierten Potentialen. Bevorzugt waren die unteren Extremitäten betroffen (Tabelle 9). Dies korrespondiert mit dem letzten, in dieser Studie nach ca. 6 Monaten dokumentierten, EDSS, welcher bei den elektrophysiologisch untersuchten Patienten zwischen 3,5 und 5,5 lag. 43

49 4 Ergebnisse Tabelle 9: Veränderung der evozierten Potentiale (EP) im Vergleich zur BaselineUntersuchung Bei den Patienten, bei denen Ausgangswerte und Verlaufskontrollen vorlagen wurde eine möglichst spät durchgeführte Untersuchung mit der jeweiligen Baseline-Untersuchung verglichen. Die EP wurden bei klinischer Indikation bestimmt. Daher liegen nicht immer Ergebnisse für alle drei Untersuchungen vor. In der Spalte "Gesamt" wird angezeigt, ob es in einer der Messungen zu pathologischen Veränderungen und damit zu einer paraklinischen Befundprogredienz kam. Patient Evozierte Potentiale SSEP-OE SSEP-UE MEP-OE MEP-UE Gesamt = = = = = = = Monat VEP = = = = = = = = = = = VEP: Visuell evozierte Potentiale SSEP: Somatosensibel evozierte Potentiale MEP: Motorisch evozierte Potentiale OE: Obere Extremität UE: Untere Extremität = : stabiler Befund : Verschlechterung Blau: Patient nicht mehr unter Therapie mit IFN-β a s.c. 4.4 Genexpressionsveränderungen unter IFN-β-Therapie und Clustering Im Rahmen der Mikrochipanalyse wurden 8862 Gene in Hinblick auf ihr ExpressionsNiveau im zeitlichen Verlauf untersucht. Durch die in Kapitel beschriebene Filtermethode wurden die Gene ermittelt, deren Expression unter der Therapie mit IFN-β signifikant moduliert wurde. Nach zwei Tagen waren im Vergleich zur Baseline 62 Gene signifikant hoch- oder herunterreguliert. Nach vier Wochen, zwölf Monaten und 24 Monaten zeigten entsprechend 74, und acht Gene eine deutliche

50 4 Ergebnisse Expressionsveränderung. Dabei kam es zu großen Überschneidungen. Insgesamt wurden 96 verschiedene Gene als unter der Therapie signifikant moduliert gefiltert (Tabelle A im Anhang). Davon waren 74 Gene hoch- und 2 Gene herunterreguliert. Ein Gen zeigte eine Hochregulation nach zwei Tagen sowie eine Herunterregulation nach vier Wochen (MGAM). Die Expressionslevel der 96 Gene sind in Abbildung 4 als Heatmap dargestellt. Dabei handelt sich um die Visualisierung einer Datenmatrix, die die Expressionslevel der einzelnen Gene in den einzelnen Patienten enthält. Anhand ihrer Expressionsveränderungen wurden die 96 Gene mittels Clusteranalyse in sechs Gruppen eingeteilt. Cluster ist mit 54 Genen die größte Gruppe und umfasst Gene, die unter IFN-β über den gesamten Zeitraum hochreguliert waren. Darin enthalten sind bekannte durch Interferon stimulierte Gene, beispielsweise MX und damit co-exprimierte Gene wie OAS-3, IFI6, -27, -35, -44, -44L sowie die Transkriptionsfaktoren STAT und IRF7. Cluster 2 setzt sich aus vier Genen zusammen (EGR, EGR2, STAP und TCLA), die erst nach zwölf bzw. 24 monatiger Therapie hochreguliert waren. Cluster 3 (neun Gene, z.b. CQA, -B, -C, C3AR und LILRA3) und Cluster 4 (2 Gene, z.b. MMP9, -25, CD63, CYP4F3) beinhalten Gene, die nach zwei Tagen hochreguliert, nach einem Monat jedoch bereits wieder auf dem Baseline-Niveau exprimiert waren. Cluster 5 beinhaltet ebenfalls Gene, die zunächst hoch-, später jedoch herunterreguliert sind (u.a. ITGA2B, CLU). Die fünf Gene in Cluster 6 zeigten eine Herunterregulation im Vergleich zur Baseline (FCERA, IL8, GS2, RPS23, ENSG837). 45

51 4 Ergebnisse Abbildung 4: Heatmap der Expression unter Therapie modulierter Gene Die Expression der 96 Gene ist für alle Patienten zu allen fünf Zeitpunkten dargestellt, wobei rot hohe Expression und blau niedrige Expression anzeigt. Die Daten wurden standardisiert, so dass die Messwerte einen Mittelwert von und eine Varianz von hatten. Der so berechnete Z-Score wird angegeben in Standartabweichungen vom Mittelwert. Die Mehrheit der Gene war unter Therapie höher exprimiert (grüner Balken links), ca. ein Viertel der Gene war unter der Therapie niedriger exprimiert (grauer Balken links). Die Gene wurden anhand ihrer Expressionsdynamik in sechs Cluster eingeteilt, welche rechts als sechs farblich unterschiedliche Balken mit den jeweiligen Gensymbolen dargestellt sind. Grün stellt das Cluster dar, welches die typischen Interferon-regulierten Gene (IRG) enthält. Die Heatmap visualisiert deutliche interindividuelle Unterschiede in der Genexpression zwischen den Patienten. Beispielsweise wird deutlich, dass drei Patienten bereits vor Therapiebeginn eine relativ hohe Expression der IRG aufwiesen. Nach zwei Jahren war das Expressionsniveau der IRG bei sechs Patienten hoch und bei sechs Patienten niedrig. In der Heatmap zeigen sich deutliche interindividuelle Unterschiede im Expressionsmuster der Patienten sowohl vor Therapiebeginn als auch unter der Therapie. Prätherapeutisch hatten drei Patienten (Pat, und 2) bereits hohe Transkript-Level von MX und anderen IRG (Interferon-regulierte Gene). Hier kann man von einer hohen endogenen Aktivität des Interferon-Signalwegs ausgehen. Nach der ersten Injektion von IFN-β a s.c. wurde die MX-Expression bei allen anderen Patienten außer Pat auf ein vergleichbares Expressionsniveau hochreguliert. Pat war nicht therapienaiv, da sie bereits zuvor, außerhalb der Studie, mit IFN-β a s.c. behandelt wurde. Das MX-Expressionslevel zeigte bei dieser Patientin über den gesamten Studienzeitraum niedrige Werte. Nach einem 46

52 4 Ergebnisse Jahr war MX noch bei neun von zwölf Patienten stark exprimiert. Nach zwei Jahren hatten nur noch sechs Patienten ein erhöhtes MX-Transkript-Level. Von diesen sechs Patienten war eine Patientin wie beschrieben nicht therapienaiv (Pat ). In einem weiteren Fall kam es während des zweiten Jahres zu unregelmäßiger Medikamenteneinnahme (Pat 9). Bei einer anderen Patientin wurden im nachfolgenden Verlauf NAb festgestellt (Pat 8). Es ist davon auszugehen, dass diese Patientin bereits zum Zeitpunkt der letzten Blutentnahme NAb-positiv war. Eine weitere Patientin hatte das Medikament ein halbes Jahr zuvor aufgrund von NW abgesetzt (Pat 7). Bei Pat 6 war im zweiten Jahr eine deutliche Krankheitsaktivität mit drei Schüben zu verzeichnen, bei Pat kam es im zweiten Jahr im Vergleich zu t zu einer deutlichen EDSS-Verschlechterung um 2,5 Punkte. Abbildung 5: Clustering der 96 gefilterten Gene Die Einteilung der gefilterten Gene in sechs Cluster erfolgte anhand ihrer Expressionsdynamik mittels hierarchischem Clustering. Die mrna-expressionslevel wurden standardisiert (Varianz =, SD = ), damit die hoch und niedrig exprimierten Gene auf einem vergleichbaren Niveau beurteilt werden können. Die Cluster -6 sind von links oben nach rechts unten dargestellt. Dargestellt ist die Anzahl der zugeordneten Gene und der jeweilige p-wert sowie die Expressionskurven, welche die mittlere Expression der jeweiligen Gene im zeitlichen Verlauf darstellt. 47