Diagnostik und Therapie EBV-assoziierter Erkrankungen. Uta Behrends. Kinderklinik Schwabing. Technische Universität München

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1 Diagnostik und herapie EBV-assoziierter Erkrankungen Uta Behrends Kinderklinik Schwabing Klinische Kooperationsgruppe Pädiatrische umorimmunologie Helmholtz Zentrum München

2 Indikation der EBV-Diagnostik > 2 der 4 Symptome Fieber Müdigkeit Pharyngitis Lymphadenopathie Quelle: ADAM

3 Indikation bei kombinierter und/oder isolierter Symptomatik Systemisch Nervensystem Augen onsillen Pharynx Lymphknoten Atemwege Exanthem Leber Quelle: bioweb.uwlax.edu/ Milz Magen/Darm Bei unklarer Symptomatik an EBV denken und ggf. abklären!

4 Serologische Diagnose Quelle: Medsci.indiana.edu Historisch Paul Bunell est (Monospot-est,) Heterophile Antikörper agglutinieren ier-erythrozyten Bei Kindern < 5 Jahre negativ Goldstandard Immunfluoreszenztest (IF)

5 Indirekter Immunfluoreszenztest (IF) - Goldstandard EBV-VCA (IgG) EBV-VCA (IgG) + Harnstoff EBV-VCA (IgM) EBV-EA (IgG) EBV-EBNA (IgG) + Niedrig avide Frisch ++ Hoch avide Abgelaufen VCA = Viruskapsid-Antigen EA = Early Antigen EBNA = EBV Nukleäres Antigen Quelle: Euroimmun, modifiziert

6 Immunoblot - Bestätigungstest Quelle: Mikrogen, EUROIMMUN, modifiziert

7 Serologisches Profil im Krankheitsverlauf Frische Primärinfektion Kurz zurückliegende Primärinfektion Länger zurückliegende Infektion Reaktivierung V V V EBV IgA: Marker des Nasopharynxkarzinoms!

8 Antikörpermuster bei Reaktivierung (CAEBV) (LPD) Quelle: DPI-Handbuch 2013, modifiziert

9 Atypische Lymphozyten im Blutausstrich - Pfeiffer-Zellen Quelle. Kinderklinik der UM

10 Klassische rias bei Primärinfektion Positive EBV-Serologie im Sinne frischer Infektion > 10% atypische Lymphozyten im peripheren Blut Lymphozytose

11 Lymphozytose im Verlauf der EBV-Infektion Inkubation IM Rekonvaleszenz Gesunder Virusträger CD8+ -Zellen gegen lytische Antigene CD8+ -Zellen gegen Latenzantigene CD4+ -Zellen gegen lytische und Latenzantigene Quelle: Field s Virology 2013, modifiziert

12 CD8+ und CD4+ -Zellen erkennen EBV-Antigene Extrazelluläres EBV Antigen Endosom Intrazelluläres EBV Antigen Endoplasmatisches Retikulum Abb. mit freundlicher Genehmigung von HJ Delecluse, modifiziert

13 -Zellkontrolle der EBV-Infektion Primärinfektion Persistenz mit Reaktivierung Primäre Infektion -Zellantwort Persistente Gedächtnis--Zellantwort Infektion mit Reaktivierung Quelle: Field s Virology 2007, modifiziert

14 Viruslast im Verlauf der EBV-Infektion Inkubation IM Rekonvaleszenz Gesunder Virusträger Immunsuppression EBV-Vermehrung im Nasopharynx EBV-positive Zellen im Blut Quelle: Field s Virology 2013, modifiziert

15 Quantifizierung der Viruslast Polymerase chain reaction (PCR) ml Vollblut, Plasma, Rachenspülwasser, Liquor 10^5 PBMC [ µg DNA ] EBV-Zielgene > 25 Assays BALF-5 Gen, BamHI-W, EBNA1 Gen,LMP1, LMP2, BZLF1, EBER Kalibrierung gegen WHO-Standard empfohlen Cut off Gibt es nicht Hohe EBV-Last ohne PLD möglich PLD ohne hohe EBV-Last möglich Cave: EBV-Last > Geg pro ml o. 10^5 PBMC o. µg/dna Quelle: Ruf S & Wagner HJ, Expert Rev Clin Immunol 2013

16 Wahl des Probenmaterials für die EBV-PCR Erkrankung Bedeutung Ref. Vollblut Plasma PPMC Liquor Quelle: Ruf S, Wagner HJ: Expert Rev Clin Immunol 2013

17 Routinelabor zur Erfassung von Risiken & Komplikationen Diff. BB Absolute Neutrophilenzahl < 1.000/µl Superinfektion Lymphozyten > /µl, Lymphoproliferative Erkrankung (LPD) Lymphozyten < 2000/µl (Normwerte!) Primäre Immundefekte (PID) hrombozyten Schwer (< /µl) Mild bei 25-50% der Patienten Immunthrombozytopenie (IP) Hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH) Hb, Reti s Autoimmunhämolytische Anämie (AIHA), Aplastische Anämie (AA), HLH LDH (95 %) ransaminasen (80-100%), γg, Bili Ferritin riglyceride Fibrinogen AIHA, Hepatitis Hepatitis HLH HLH HLH

18 EBV-assoziierte Hämophagozytische Lymphohistiozytose (EBV-HLH) > 5/8 Kriterien 1. Fieber 2. Splenomegalie 3. Zytopenie > 2/3 Zelllinien (Hb < 9 g/dl, hrombo < 100 G/l, ANC < 1000/µl) 4. Hypertriglyceridämie und/oder Hypofibrinogenämie 5. Ferritin > 500 ng/ml 6. Erniedrigte NK-Zell Zytotoxizität 7. CD25 > 2400 U/ml 8. Nachweis einer Hämophagozytose in KM, Milz, LK oder Liquor Quelle: Histiocyte Society

19 Hämophagozytose im Knochenmark Quelle: Kinderklinik der UM Quelle:immundefekt.de Quelle:immundefekt.de Lymphozyt hrombozyt Quelle: hemato-images.eu Granulozyt Erythrozyten

20 Störung der immunologischen Synapse bei EBV-HLH Quelle: Immundefektzentrum der Charite, Berlin

21 Procedere bei Verdacht auf EBV-HLH Videofallkonferenz der HLH-Studiengruppe der GPOH Ggf. Molekulargenetik GGf. herapie nach HLH-Protokoll der Histiocyte Society

22 Erweiterte Diagnostik bei fulminanter EBV-Infektion / LPD Lymphozytensubpopulationen (einschl. ink-zellen) Molekulare Defekte (z.b. SAP, XIAP, IK, CD27, MAG1) Labors des CCI Freiburg und der IK Ulm Anmerkung Patienten mit XLA (Bruton s Disease) sind resistent gegenüber EBV, weil reife B-Zellen fehlen

23 Virustatische Prophylaxe und herapie bei hoher Viruslast Primärinfektion Persistenz und Reaktivierung Evtl. (Val)Ganciclovir (Foscarnet) Evtl. (Val)Ganciclovir (Foscarnet) Primäre Infektion -Zellantwort Persistente Gedächtnis--Zellantwort Infektion mit Reaktivierung Field` s Virology, 2007, modifiziert

24 herapieoptionen bei EBV-assoziierter Immundysregulation Primärinfektion Persistenz und Reaktivierung IM: Paracetamol, Prednison, onsillotomie IP, AIHA: Prednison, anti B-Zell-Antikörper HLH: Dexamethason, Cyclosporin A, VP16 CAEBV, PID (primäre HLH): allogene HSZ MS: beta-interferon, autologe HSZ

25 Konventionelle herapie EBV-assoziierter Malignome Primärinfektion Persistenz und Reaktivierung Lymphome: Chemotherapie Radiotherapie Karzinome: OP Chemotherapie Radiotherapie Primäre Infektion -Zellantwort Persistente Gedächtnis--Zellantwort Infektion mit Reaktivierung Field` s Virology, 2007

26 herapie der EBV-assoziierten PLD Primärinfektion Persistenz und Reaktivierung PLD Immunsuppression reduzieren Anti-B-Zell-Antikörper (Rituximab) Adoptive -Zelltherapie Autolog Allogen

27 Donorlymphozytentransfusion (DLI) Gesunder Spender Patient nach allogener Stammzelltransplantation (SZ) mit PLD Unselektionierte, Spenderlymphozyten Hohes Risiko einer Spender-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD)

28 LCL-basierte -Zellexpansion PBMC EBV Prof. Cliona Rooney Houston, exas PBMC Lymphoblastoide Zelllinie (LCL) Zellkultumodell der PLD EBV-spezifische--Zelllinien Zellkulturmodell des Immunsystems

29 LCL-basierte -Zelltherapie Gesunder Spender Patient mit PLD nach allogener SZ Patient mit PLD nach Organtransplantation oder mit EBV-assoz. NPC, HL allogen autolog Rooney CM et al., Lancet 1995 (PLD-HSC, herapie) Rooney CM et al., Blood, 1998 (PLD-HSC, Prophylaxe Savoldo B et al., Blood 2006 (PLD-SO, herapie) Comoli P et al., Blood 2002 (PLD-SO, Prophylaxe) Bollard CM et al., JEM 2004 (Hodkin-Lymphom) Comoli P et al., Ann Oncol 2004 (Nasopharynxkarzinom)

30 -Zelltherapie von partiell HLA-identischem hird Party Donor Gesunder Organ-oder Stammzellspender Patient Gesunder, partiell-hla-identischer -Zellspender allogen allogen Haque et al., ransplantation 1995 (PLD-SO, herapie) Haque et al., Lancet 2002 (PLD-SO, herapie - Donor-Bank) Haque et al., Blood 2007 (PLD-SO, herapie - Phase 2-Studie)

31 EBV-spezifische -Zelltherapie aus einer -Zellbank PD Dr. Britta Maecker- Kohlhoff, MHH Hannover

32 Heilungsraten mit EBV-spezifischem -Zelltransfer PLD-SO PLD-HSC CR 46,4% CR 66,7% Nasopharynxkarzinom Hodgkin-Lymphom CR 9% CR 20,5% Merlo A, Int J Hematol 2011

33 Langwieriger Herstellungsprozess 4-6 Wochen 4-6 Wochen PBMC EBV PBMC Lymphoblastoide Zelllinie (LCL) EBV-spezifische--Zelllinien

34 Isolation und Kurzzeitstimulation EBV-spezifischer -Zellen Stunden PBMC + IFN-γ EBV Peptide Dr. Andreas Moosmann München Moosmann A et al., Blood 2010; Icheva V et al., JCO 2013 PD Dr. obias Feuchtinger übingen

35 Detaillierte Analyse der Immunantwort Multiparametrische FACS-Analysen Identifikation von EBV Epitopen Neue Zielstrukturen für Diagnostik, Prophylaxe und herapie Milosevic S et al., Eur J Immunol 2004 und J Immunol Methods 2005

36 iermodelle Verbessertes pathogenetisches Verständnis Ablauf der Primärinfektion Rolle einzelner -Zellpopulationen Rolle von NK-Zellen Vergleich verschiedener EBV-Stämme

37 Hochdurchsatzverfahren für die EBV-Diagnostik Multiplex Serology ELISPO Assay Quelle: Mikrogen Quelle: U-Cyech Quelle: BDBiosciences Risikomarker Verlaufsmarker Zielstrukturen für herapie/prophylaxe

38 Münchner Studie in Vorbereitung Biomarker der protrahierten und/oder komplizierten Infektiösen Mononukleose Münchner Praxen Münchner Kliniken Münchner Medizinstudenten (UM) Ludwig Maximilians Universität München (LMU) Helmholtz Zentrum München (HMGU) Deutsches Zentrum für Infektionsforschung (DZIF) Deutsches Zentrum für Krebsforschung (DKFZ) Medizinische Hochschule Hannover (MHH) Eberhard Karls Universität übingen (EKU)

39 EBV-assoziierte LPD bei nicht immunsupprimierten Kindern 1) Inzidenz? 2) Art der Erkrankung/Histologie? 3) Hinweise auf genetische Grundlage? 4) Auffällige immunologische Befunde? 5) Bei Jungen: SH2D1A- oder XIAP-Mutation? 6) Hämophagozytose im Knochenmark?

40 EBV Sprechstunde, Konsil- und Beratungsdienste Kinderklinik Schwabing Immunologie & Infektiologie Hämatologie & Onkologie Helmholtz Zentrum München Klinische Kooperationsgruppe Pädiatrische umorimmunologie & Arbeitsgruppe Genvektoren Deutsches Krebsforschungszentrum Krebsinformationsdienst Kinderpoliklinik el. 089 / o. 3415

41 Hinweise auf eine Rolle des EBV bei Autoimmunerkrankungen Multiple Sklerose (MS) Rheumatoide Arthritis (RA) Systemischer Lupus erythematodes (SLE) SLE RA MS Erhöhte EBV Seroprävalenz Erhöhte anti-ebv IgG-Serumtiter Anstieg der EBV-IgG-iter vor Symptomatik Assoziation mit IM Aberrante systemische -Zellantwort Vermehrte lokale -Zellantwort n.a. + + Erhöhte Viruslast im Blut + + +/- EBV-Nachweis im kranken Organ n.a. +/- +/- Quelle: Lossius A et al., Viruses 2012

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