Biotype Template Files für GeneMapper ID Software

Transkript

1 Biotype Template Files für GeneMapper ID Software Einleitung Biotype Auswertevorlagen (Template Files) sind Software - Komponenten für die Auswertung von Analysedaten mit der GeneMapper ID Software. Biotype Template Files gelten für ABI PRISM Ein- und Mehrkapillargeräte der Firma Applied Biosystems. Die GeneMapper ID Software mit den Biotype Template Files ordnet den DNA- Fragmenten anhand der Fragmentlänge die Allelbezeichnungen der jeweiligen STR-Loci zu. Optional werden zusätzlich die entsprechenden Fragmentlängen der Peaks in Basenpaaren oder die Peakhöhen in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) angezeigt. Diese Daten (Genotypen) können in Tabellenform gedruckt und exportiert werden. Biotype Template Files gibt es für alle Mentype, Humantype und Animaltype Testkits ab GeneMapper ID Software Version 3.1. Die nachfolgende Beschreibung wurde am Beispiel einer Analyse mit dem Mentype Nonaplex I (6-FAM/HEX/NED) Testkit am ABI PRISM 310 Genetic Analyzer erstellt. Es wurde einheitlich der DNA Längenstandard 550 (ROX) verwendet. Die Analysen wurden mit der GeneMapper ID Software Version und dem Mentype Nonaplex I Template File durchgeführt. Allgemeine Anweisungen zur Einführung in die Software können der GeneMapper ID Software User Guide von Applied Biosystems entnommen werden. Weitere Informationen über Produkte zur humanen Identification (HID): - Products - Human Identification and Forensic DNA - Software Gültigkeit für HID Für die Biotype STR-Testkits ist eine Kalibrierung der DNA Proben gegen eine Allelleiter notwendig. Deshalb muss für forensische Anwendungen eine HID Software Version verwendet werden. Diese Biotype Template Files gelten für die GeneMapper ID Software. Bestellinformation Biotype Template Files CD-ROM Artikelnummer für Windows

2 - 2 - Inhaltsverzeichnis 1 Einrichtung am Auswertungsrechner Login Panel Manager GeneMapper Manager Kalibrierung mit Allelleitern Auswertung der Analysedaten Auswertevorlagen für Biotype Testkits A. Size Standards B. Panels und BinSets C. Analysis Methods D. Plot Settings E. Table Settings Kontrolle der Analysedaten Druckoptionen und Page Setup Fehlersuche... 32

3 - 3-1 Einrichtung am Auswertungsrechner Biotype Auswertevorlagen (Template Files) für GeneMapper ID Software finden Sie auf unserer Homepage zum Download. Auf Anfrage senden wir Ihnen kostenfrei eine CD-ROM zu. Die Biotype Template Files sollten vor der erstmaligen Nutzung zunächst auf dem lokalen Windows PCs gespeichert und dann in die GeneMapper ID Software importiert werden. Alternativ können die Daten auch direkt aus dem Intranet oder von CD-ROM importiert werden. Die Panels und BinSets werden über den Panel Manager importiert. Die weiteren Auswertevorlagen wie Analysis Methods, Table Settings, Plot Settings, etc. werden über den GeneMapper ID Manager eingeladen. 1.1 Login - GeneMapper ID Software öffnen und anmelden - Erste Anmeldung (first Login) User Name gmid old Password (nichts eintragen) - Passwort ändern Tools Options Users New User - Neue Benutzernamen mit Passwörtern analog vergeben

4 Panel Manager Im Panel Manager werden Panels und BinSets für Biotype Produkte in die GeneMapper ID Software importiert. Empfehlung: Für die Biotype Testkits einen Biotype Ordner für Panels und BinSets einrichten (AppliedBiosystems GeneMapper Panels Biotype). Inhalt: Biotype_Panels_v3 (oder aktuelle Version) Biotype_Bins_v3 (oder aktuelle Version) - Tools Panel Manager - File Import Panels - Den Ordner Panel Manager anklicken, aktuelle Panel Version auswählen und importieren - File Import BinSet Aktuelle Panel Version im Panel Manager markieren, zugehörige BinSet Version auswählen und importieren (siehe Abbildung 1) Abb. 1 Import von Panels und BinSets - Mit Apply bestätigen und mit OK beenden - Neue Panels und BinSets können im Panel Manager erstellt werden

5 GeneMapper Manager Im GeneMapper Manager werden Analysis Methods, Table Settings, Plot Settings oder Size Standards für Biotype Produkte in die GeneMapper ID Software importiert. Empfehlung: Die weiteren Biotype Template Files wie Analysis Methods, Table Settings, Plot Settings, etc. sollten lokal auf dem Windows PC in eigenen Ordnern gespeichert werden (AppliedBiosystems GeneMapper neuer Ordner). - Tools GeneMapper Manager Das gewünschte Tabellenblatt auswählen und Import anklicken. - Analysis Method Import - Table Setting Import - Plot Setting Import - Size Standard Import Importierte Analysis Methods, Table Settings, Plot Settings und Size Standards können vom Benutzer verändert und gespeichert werden. Neue Analysis Methods, Table Settings, Plot Settings oder Size Standards können im GeneMapper Manager erstellt werden. Diese Vorlagen sind alle in der Advanced Version zu erstellen. GeneMapper ID Template Files Februar 2010

6 - 6-2 Kalibrierung mit Allelleitern Das Arbeiten mit der GeneMapper ID Software erfolgt mit zusammengehörigen Analysedaten, d. h. den gemessenen DNA-Proben und Allelleitern eines Dateiordners in Projekten. Zur Auswertung der DNA Proben muss eine Kalibrierung mit einem aktuellen Lauf der Allelleiter (Allelic Ladder) erfolgen. Idealerweise sollte jeweils am Anfang und am Ende des DNA Probenlaufs die Allelleiter des verwendeten Testkits analysiert werden. Zur Kalibrierung werden die gemessenen Ist-Fragmentlängen der Allelleiter automatisch als Soll-Werte innerhalb des Projektes verarbeitet. Für die Kalibrierung wird mindestens ein geeigneter Lauf der Allelleiter benötigt. Wird mit mehreren Allelleitern kalibriert, so werden die Mittelwerte aller verwendeten Allelleitern für die Kalibrierung verwendet. Zunächst muss die korrekte Allelzuordnung der Allelleiter und der Kontroll-DNA geprüft werden. Falls hier Fehler auftauchen, müssen die DNA Proben mit einem weiteren Lauf der Allelleiter nochmals analysiert werden. Kalibrierung an Mehrkapillargeräten Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten sollten mehrere Allelleitern auf verschiedenen Kapillaren mitlaufen. Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Systemparameter Unterschiedliche Analysegeräte, DNA Längenstandards oder Polymere können zu unterschiedlichen Fragmentlängen führen. Deshalb müssen alle zusammen gemessenen Proben und Allelleitern mit den gleichen Systemparametern analysiert werden.

7 - 7-3 Auswertung der Analysedaten - GeneMapper ID Software öffnen und anmelden - Daten importieren File Add Samples to Project - Analysis Data Files (.fsa) auswählen Add Samples Add to List Add - Table Setting über Pull-down Menu (oben Mitte) auswählen, für Proben einer DNA =Table for 2 Alleles verwenden (für Proben einer DNA-Mischung= Table for 10 Alleles) - Data Files erscheinen als neues Projekt im Tabellenblatt Samples. Im Tabellenblatt Samples werden folgende Spalten angezeigt: Status, Sample Name, Sample Type, Analysis Method, Panel, Size Standard, Matrix sowie die Qualitätswerte SQO*, SFNF*, OS*, SQ*, UD1* (PQV Erläuterungen siehe Tabelle 1). Tabelle 1. Prozessbezogene Qualitätswerte (PQV) PQV* Definition SQO SFNF OS SQ Sizing Quality Overridden: Längenzuordnung der Probe überschrieben Sample File Not Found: Probendatei nicht gefunden Off-scale: außerhalb der Skalierung, Überstrahlung von Peaks in andere Farbpanel sind wahrscheinlich Sizing Quality: Längenzuordnung der Probe oder Allelleiter UD1 User Defined Column 1: Benutzerdefinierte Spalte Nr. 1 Weitere Informationen können dem Kapitel Process Quality Values der GeneMapper ID Software User Guide entnommen werden. - Sample Typ über Pull-down Menu auswählen (z. B. Sample, Allelic Ladder, Positive Control, Negative Control, etc., siehe Abbildung 3). Ein Projektordner muss mindestens eine Allelleiter enthalten. Optional: Die Positivkontrolle (Positive Control) kann eine Datei der Kontroll-DNA sein, die Negativkontrolle (Negative Control) z. B. eine Kontrolle ohne DNA.

8 Analysis Method über Pull-down Menu auswählen (z. B. Biotype Auswertevorlage: Analysis_HID_310) Diese Auswertemethode ist für Analysen mit Windows PC (= Advanced Peak Detection) für ABI PRISM 310 Analysegeräte vorbereitet. Es gibt weitere Methoden für ABI PRISM Mehrkapillargeräte wie den 3130, etc. Wichtige Anmerkung Neue Analysemethoden verweisen auf die letzten in der GeneMapper ID Software verwendeten BinSets. Für Biotype Produkte bitte die aktuellen Biotype BinSets, z. B. Biotype_Bins_v3 im Tabellenblatt Allele auswählen (siehe Abb. 2). Abb. 2 Analysemethode, Tabellenblatt Allele, hier Einstellung des BinSets kontrollieren - Panel über Pull-down Menu auswählen (z. B. Nonaplex_I_Panels_v2) - Size Standard über Pull-down Menu auswählen, z. B. SST-ROX_50-400bp für den DNA Längenstandard 550 (ROX) - die zugehörige Matrix wird nur bei Proben vom ABI PRISM 310 angezeigt (nicht bei Proben von ABI PRISM Mehrkapillargeräte wie den 3130) - Analyse starten durch Anklicken des grünen -Icons. Projekt Namen vergeben und speichern. Nach erfolgreicher Analyse der Proben verschwindet das Icon in der Spalte Status (siehe Abbildung 3) Abb. 3 Analyse starten Anmerkung Um eine Spalte des Tabellenblatts mit den gleichen Parametern zu analysieren, ist die Funktion Fill Down hilfreich. Hierzu nach der Auswahl des Parameters (z. B. Nonaplex_I_Panels_v2) über das Pull-down Menu die oberste Zelle markieren und Strg + D drücken bzw. Edit Fill Down ausführen.

9 - 9 - Auswertung des Projektes - Daten auswählen Edit Select All Analysis Display Plot - Plot Setting über Pull-down Menu auswählen z. B. Plot_4dyes (für blaue/grüne/gelbe/rote Panel) Skalierung des Analysebereichs Um den Fragmentlängenbereich des Testkits auszuwählen (z. B. Nonaplex I / ca bp), Lupen-Icon über der horizontalen Skalierung vor dem ersten möglichen Allel anklicken und hinter das letzte mögliche Allel ziehen. Doppelklick auf die Skalierung führt zur Grundeinstellung des Fragmentlängenbereichs zurück. Abb. 4 Skalierung des Analysebereichs im Sample Plot

10 Auswertevorlagen für Biotype Testkits A. B. C. D. E. Size Standards Panels BinSets Analysis Method Plot Settings Table Settings SST-ROX_50-500bp SST-BTO_60-500bp Biotype_Panels Biotype_Bins Analysis_HID_310 Analysis_HID_3130 Analysis_HID_310_50rfu Analysis_HID_3130_50rfu Plots_2dyes Plots_3dyes Plots_4dyes PlotsBT5_4dyes Plots_5dyes Table for 2 Alleles Table for 10 Alleles Die Panels und BinSets müssen immer verwendet werden, die weiteren Auswertevorlagen sind optional.

11 A. Size Standards SST-ROX Um die korrekte Längenzuordnung der auszuwertenden Proben zu prüfen, klicken Sie im Samples Plot auf die Farbe des DNA Längenstandards (rotes Icon) in der oberen Symbolleiste der GeneMapper ID Software. Nun lassen sich die roten Panels des DNA Längenstandards aller Proben im Sample Plot anzeigen. Vergleichen Sie die Fragmentlängen der Proben mit denen des DNA Längenstandards 550 (ROX): Es sollten 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525 und 550 bp angezeigt werden. Bei abweichenden Fragmentlängen ist eine weitere Analyse mit der GeneMapper ID Software durchzuführen. Falls notwendig, ist eine neue Definition des DNA Längenstandards in der GeneMapper ID Software zu erstellen. Anpassung der Grundvorlage In der Grundvorlage SST-ROX_50-500bp wurden alle Fragmentlängen von 50 bp bis 500 bp definiert (siehe Abbildung 5). Sind für die Analyse eines Testkits z. B. nur 400bp notwendig, so brauchen nur die Fragmentlängen bis 400 bp definiert zu werden. Diese neue Vorlage kann z. B. mit dem Namen SST-ROX_50-400bp gespeichert und für weitere Analysen verwendet werden. Abb. 5 Elektropherogramm des DNA Längenstandards 550 (ROX), Fragmentlängen in bp Definition eines neuen Längenstandards Um einen neuen Längenstandard zu definieren, führen Sie folgende Schritte aus: - Tools GeneMapper Manager Tabellenblatt Size Standards auswählen - New Basic or Advanced Name vergeben (z. B. SST-ROX_50-500bp) und Größenbereich analog zum Analysebereich des verwendeten Testkits definieren (siehe horizontale Skalierung in der Gebrauchsanleitung der Testkits) - Size Standard Dye Für SST-ROX=Red auswählen (für SST-BTO = Orange) SST-BTO Für Biotype Testkits im 5 Farbassay mit den Fluoreszenzfarben 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO (Biotype Matrix BT5) wird ein Längenstandard im orangen Panel benötigt. Hierfür muss der DNA Längenstandard 550 (BTO) verwendet werden, die Vorlage SST-BTO_60-500bp ist kitspezifisch anzupassen.

12 B. Panels und BinSets Panels Folgende Kennwerte für die Marker (STR-Loci) sind angegeben: - Marker Name (STR Locus) - Dye Color (Farbe) - Min. Size und Max. Size (oberer und unterer Allelbereich in bp) - Control Alleles (Allele der Kontroll-DNA) - Marker Repeat (Repeateinheit in bp) - Marker Specific Stutter Ratio ( Stutterfilter 0.13 entspricht 13% Filter der Peakhöhen im Marker) - Comments (Kommentar) - Ladder Alleles (Allele in der Allelleiter, nicht abgebildet) Abb. 6 Aufbau eines Panels

13 BinSets Folgende Kennwerte für die Allelbezeichnung sind angegeben: - Allelname (Allelnummer) - Fragmentlänge (in bp) - oberer und unterer Toleranzbereich (in bp) Abb. 7 Aufbau eines BinSets

14 C. Analysis Methods Es gibt verschiedene Auswertemethoden für ABI PRISM Ein- und Mehrkapillargeräte. ABI PRISM Einkapillargerät = ABI 310, Mehrkapillargerät = ABI 3130, etc. Analysis_HID_310 Analysis_HID_3130 Analysis_HID_310_50rfu Analysis_HID_3130_50rfu HID Analysemethode mit 20% Filter für Proben einer DNA HID Analysemethode mit 20% Filter für Proben einer DNA sensitive HID Analysemethode für Spuren- und DNA Mischproben sensitive HID Analysemethode für Spuren- und DNA Mischproben Anmerkung Diese Anleitung beschreibt Beispiele mit HID_310 und HID_310_50rfu Analysis_HID_310 - Zur Auswertung von Proben einer DNA, nicht geeignet für DNA Mischproben - Peakbezeichnung (Label) nach den eingestellten Filterwerten. Die Peaks werden mit dem zugehörigen Allel bezeichnet - Voreinstellung des Filterwertes: Label unter 20% der Höhe des höchsten Peaks des jeweiligen Markers (STR-Locus) werden nicht angezeigt - Im Plot-Fenster (Sample Plot) werden die markierten Farbpanels angezeigt Abb. 8 Sample Plot nach Ausführung der Analysemethode HID_310 Bei Importproblemen Bitte neue Analysemethode in der eigenen GeneMapper ID Software von Applied Biosystems erstellen und Biotype Einstellungen aus Abb übernehmen.

15 Analysis_HID_310 Abb. 9 Tabellenblatt General beschreibt die Analysemethode

16 Analysis_HID_310 Abb. 10 Tabellenblatt Allele Cut-off Value 0.2 Cut-off Value entsprechen einem Filterwert von 20% im Vergleich zum höchsten Peak des Markers. Damit werden alle Signale mit geringeren Peakhöhen als 20% in Plots und Tabellen nicht angezeigt. Einschränkung der Analysemethode Die Methoden Analysis_HID_310 und Analysis_HID_3130 enthalten als Voreinstellung einen 20% Filter und sind nicht geeignet zur Analyse von DNA Mischproben.

17 Analysis_HID_310 Abb. 11 Tabellenblatt Peak Detector - Zur besseren Peakerkennung: Speziell für Punktallele, d. h. Allele mit einem Abstand von mindestens 1 bp zum nächsten ganzzahligen Allel kann der Wert für die Peak Window Size auf 11 pts verringert werden. Falls notwendig kann die Peak Window Size noch weiter verringert werden. Nur die Peak Window Size ist abweichend zu den Voreinstellungen von Applied Biosystems für HID Analysen.

18 Analysis_HID_310 Abb. 12 Tabellenblatt Peak Quality, zur Einstellung der Parameter für die Peakqualität Alle Einstellungen hier sind Voreinstellungen von Applied Biosystems für HID Analysen.

19 Analysis_HID_310 Abb. 13 Tabellenblatt Quality Flags zur Gewichtung der PQVs Alle Einstellungen hier sind Voreinstellungen von Applied Biosystems für HID Analysen.

20 Sensitive HID Analysemethode für Spuren- und DNA Mischproben Analysis_HID_310_50rfu Abb. 14 Tabellenblatt Allele zur Einstellung der Filterwerte, Voreinstellung: No Cut-Off Filter Ändern der Filterwerte im Tabellenblatt Allele Um die unteren Grenzwerte für die forensische Fallarbeit zu ändern, führen Sie bitte folgende Schritte aus: - Tools GeneMapper Manager - Tabellenblatt Analysis Methods auswählen, zum Bearbeiten doppelklicken. - Im Tabellenblatt Allele lassen sich folgende Filterwerte einstellen: Cut-off Value, MinusA, Minus Stutter, Plus Stutter (siehe Abbildung 14) - Markieren Sie den Wert, bei dem Sie die Grenze ändern möchten und speichern die Änderung der Analysemethode unter einem neuen Namen

21 Analysis_HID_310_50rfu Abb. 15 Tabellenblatt Peak Detector zur Peakerkennung, Voreinstellung: 50rfu Filter Ändern der Filterwerte im Tabellenblatt Peak Detector - Der Grenzwert der Peakamplituden Peak Amplitude Threshold ist die minimale Peakhöhe, welche die GeneMapper ID Software als einen Peak erkennt. Übliche Werte sind RFU und sollten individuell vom Analyselabor festgelegt werden. Empfehlung: Die minimale Peakhöhe sollte mindestens 3x so hoch sein wie das Grundrauschen der Basislinie.

22 D. Plot Settings Plots_2dyes zur Darstellung von zwei Farbpaneln (B, R) Plots_3dyes zur Darstellung von drei Farbpaneln (B, G, R) Plots_4dyes zur Darstellung von vier Farbpaneln (B, G, Y, R) PlotsBT5_4dyes zur Darstellung von vier Farbpaneln (B, G, Y, O) Plots_5dyes zur Darstellung von fünf Farbpaneln (B, G, Y, R, O) Beschreibung - Dient dem Vergleich von DNA Proben mit der dazugehörigen Allelleiter - Zeigt die Peakbezeichnungen (z.b. Allelbezeichnungen) nach der gewählten Analysemethode an - Allelbezeichnungen können hier verändert werden - Im oberen Teil des Fensters werden die Allelleitern (und definierte Kontrollen) fixiert. Die DNA Proben werden im unteren Teil des Fensters dargestellt - Zur vereinfachten Zuordnung kann der entsprechende Skalierungsbereich vergrößert werden (siehe Abbildung 4 auf S. 9) - Alle Plot Settings sind ohne Tabellen voreingestellt Abb. 16 Plot Window mit Allelleiter (oben) und DNA Probe (unten)

23 Erstellung neuer Peakbezeichnungen Um die Peakbezeichnungen zu ändern, führen Sie bitte folgende Schritte aus: - Tools GeneMapper Manager - Tabellenblatt Plot Settings auswählen, zum Bearbeiten doppelklicken. - Tabellenblatt Labels anklicken, folgende Peakbezeichnungen lassen sich einstellen: Allele Call, Height, Size, etc. (siehe Abbildung 17) - Markieren Sie den Wert, den Sie zufügen oder verändern möchten und speichern die Änderung mit OK Abb. 17 Plot Setting, Tabellenblatt Labels zur Bezeichnung der Peaks - Die Peakbezeichnungen, die in der Tabelle erscheinen sollen, werden im Tabellenblatt Sizing Table verändert (siehe Abbildung 18) - Markieren Sie den Wert, den Sie zufügen oder verändern möchten und speichern die Änderung mit OK Abb. 18 Plot Setting, Tabellenblatt Sizing Table zur Darstellung in der Tabelle

24 E. Table Settings Table for 2 Alleles Table for 10 Alleles für Proben einer DNA für Proben mit DNA Mischungen Table for 2 Alleles - Zur Auswertung von DNA Proben, z. B. für eine DNA Datenbank - Zeigt die Allelbezeichnung von zwei Peaks an und erzeugt hieraus eine Tabelle, bei der die Auswertung jedes Markers (STR-Locus) in einer Zeile vorgenommen wird (z. B. Nonaplex I: alle Marker x 2 Allele) - Im Tabellenblatt Genotypes werden folgende Spalten angezeigt: Sample Name, Marker, Allele 1, Allele 2 sowie die Qualitätswerte AE*, OS*, BIN*, PHR*, SPU*, AN*, BD*, CC*, GQ* (PQV Erläuterungen siehe Tabelle 2) Abb. 19 Tabellenausgabe nach Ausführung Table for 2 Alleles - Die Qualitätskriterien für HID Produkte sind in der GeneMapper ID Software von Applied Biosystems voreingestellt. Wenn farbige Warnsignale erscheinen (Prüfen, geringe Qualität) wurde ein PQV nicht eingehalten. - In dem Fall ist der Ursache zu prüfen und vom Analyselabor zu bewerten, siehe auch PQV-Erläuterungen in Tabelle 2 Bewertung der Peakqualität über Signale: Signal Ausreichend (Pass) Prüfen (Check) geringe Qualität (Low Quality) Tabelle grünes Icon (Viereck) gelbes Icon (Dreieck) rotes Icon (Stopp)

25 Tabelle 2. Prozessbezogene Qualitätswerte (PQV) PQV* Definition AE OS BIN PHR SPU AN BD Allele Edit: Allele wurden editiert Off-scale: außerhalb des Detektionsbereichs, Überstrahlung von Peaks in andere Farbpanel sind wahrscheinlich Out of bin allele: das gefundene Allel liegt außerhalb der Bin Definition Peak Height Ratio: Peakhöhenverhältnis Spectral Pull-Up: spektrale Überstrahlung der Peaks in andere Farbpanel Allele Number: Anzahl der Allele abweichend zur Voreinstellung Broad Peaks: Peak ist breiter als erwartet (Voreinstellung 1.5 bp) CC Control Concordance: Vergleich mit interner Kontrolle (z. B. Kontroll-DNA GQ Genotype Quality: Qualität des DNA Profils oder der Allelleiter Weitere Informationen können dem Kapitel Process Quality Values der GeneMapper ID Software User Guide entnommen werden.

26 Table for 10 Alleles - Zur Auswertung von Spuren bzw. Mischproben verschiedener DNAs - Die Tabelle zeigt die Allelbezeichnung von bis zu zehn Peaks an und erzeugt hieraus eine Tabelle, bei der die Auswertung jedes Markers (STR-Locus) in einer Zeile vorgenommen wird (z. B. Nonaplex I: alle Marker x 10 Allele) - Im Tabellenblatt Genotypes werden folgende Spalten angezeigt: Sample Name, Marker, Allele 1 Allele 10 sowie die Qualitätswerte AE*, OS*, BIN*, PHR*, SPU*, BD*, CC*, GQ* (PQV Erläuterungen siehe Tabelle 2) Abb. 20 Tabellenausgabe nach Ausführung Table for 10 Alleles Tabellen-Export - Sample Plot mit Tabelle anzeigen lassen - File Export Table - Beim Speichern die Erweiterung.txt für tab-delimited text oder.csv für commadelimited text anhängen Allgemeine Informationen zum Tabellenexport können dem Kapitel Exporting Table Data der GeneMapper ID Software User Guide entnommen werden.

27 Kontrolle der Analysedaten Allgemeine Vorgehensweise bei der Auswertung 1. Prüfen des Längenstandards (Size Standard) 2. Prüfen der Allelleiter (Allelic Ladder) 3. Prüfen der Positivkontrolle 4. Prüfen der Negativkontrolle 5. Probendaten auswerten Prüfen des Längenstandards - Der erste Schritt in jedem neuen Projekt mit geringer Qualität des Längenstandards (PQV=SQ) ist die Kontrolle der Fragmente jeder Probe, siehe Kapitel Längenstandard Abb. 21 Prüfen des Längenstandards

28 Prüfen der Allelleiter - Der zweite Schritt ist die Kontrolle der Allelleiter auf korrekte Allelzuordnung (allele calling) Abb. 22 Prüfen der Allelleiter Kontrollen Zur Prüfung der richtigen Allelzuordnung vergleichen Sie bitte die Allele der Allelleiter sowie der Kontroll-DNA des Testkits mit der aktuellen Gebrauchsanleitung. Zur Prüfung der Allelleiter wird der Qualitätswert AN = Allele Number, zur Prüfung der Positivkontrolle der Qualitätswert CC = Control Concordance empfohlen, wobei ein Abgleich mit den hinterlegten Allelen der Kontroll-DNA des Herstellers erfolgt.

29 Prüfen der Positivkontrolle Abb. 23 Prüfen der Kontroll-DNA Positivkontrolle Zur Prüfung der Positivkontrolle wird der Qualitätswert CC = Control Concordance empfohlen, hierbei erfolgt ein Abgleich mit den hinterlegten Allelen der Kontroll-DNA. Negativkontrolle Die Negativkontrolle enthält keine DNA und liefert hilfreiche Informationen über die Hintergrundsignale bei den aktuellen Analysebedingungen.

30 Probendaten auswerten Abb. 24 Änderung der Allelzuordnung Off-Ladder Allele Nicht erkannte Peaks im Allelbereich erhalten die Bezeichnung OL (= Off-Ladder). Diese Label sind zu prüfen und können durch Anklicken entfernt oder umbenannt werden. Delete Allele - Zur Änderung der Allelbezeichnung eines nicht erkannten Peaks auf das Kästchen OL unter dem unbekannten Peak klicken (das Kästchen wird fett umrahmt). Ein Klicken auf die rechte Maustaste öffnet ein Pull-down Menü, in dem Delete Allele auszuwählen ist. - Danach öffnet sich das Fenster Add Allele Comment, in dem ein Kommentar zur Änderung des Allels eingetragen werden kann. Rename Allele Im Pull-down Menü können die bekannten Allele des Markers aus den Bins ausgewählt werden. Mit der Auswahl von Custom kann ein neues Allel auf Basis der Fragmentlänge festgelegt werden (nicht gezeigt).

31 Ändern der Panels und BinSets Diese Daten sind lokal auf dem Windows PC im Ordner (Applied Biosystems GeneMapper Panels Biotype) gespeichert. Zum Ändern der Textdateien im Windows Explorer mit Doppelklick öffnen (siehe Kapitel 4B). - Datum und Version der Panels und BinSets ändern, Wichtig: Die Versionen der Panels und BinSets müssen identisch sein, z.b. v3 - Zu veränderndes Allel auswählen und Allelmerkmale ändern (Toleranzbereich, Fragmentlänge) - Datei Speichern unter - neue Version der Panels und BinSets im Panel Manager einladen, alte Version löschen Anmerkung Neue Kategorien z. B. durch neu gefundene Punktallele (SE etc.) können auf diese Weise zugefügt werden. Der Toleranzbereich für alle Allele sollte ±0.50 bp betragen, bei Punktallelen ±0.40 bp. Für eigenständige Änderungen der Panels und BinSets übernimmt die Biotype als Hersteller der Testkits keine Haftung. Die aktuellen Versionen stehen auf der Homepage zum Download bereit. 6 Druckoptionen und Page Setup Im Samples Plot unter File Page Setup gibt es folgende Druckoptionen: - Unter Table lassen sich u. a. Schriftart und Größe einstellen - Unter Plot gibt es folgende Einstellungen: Honor plots per pane (Daten und/oder Plots auf einer Seite drucken) Small, Medium, Large (Größe der Plots verändern)

32 Fehlersuche Hilfefunktion Im Menü der GeneMapper ID software Help GeneMapper ID Help anklicken und in der User Guide nach einem speziellen Thema suchen. Beobachtung Mögliche Ursache Lösung Fehlermeldung beim Import (Panels und BinSets) unable to save panel data: java.sqlexception: ORA : unique constraint (IFA.CKP_UK) violated. Fehlermeldung beim Import (Panels) "Invalid marker repeat value in line # for marker D10S2325. Valid marker repeat values are 2, 3, 4 & 9. Fehlermeldung beim Import (Analysis Method, Plot Setting, Table Setting, Size Standard) Fehlermeldung bei der Analyse There are Samples that do not meet analysis requirements. Please see Error Message in the Info view of each sample Einige Proben entsprechen nicht den Vorgaben zur Auswertung. Siehe Fehlermeldung in der Info Ansicht der Proben. Datei/Injektion der Allelleiter nicht geeignet Siehe Panel-Import-Log, Pfad auf Ihrem Computer: AppliedBiosystems\GeneMapper Panels und BinSets werden nicht richtig erkannt. GeneMapper ID v3.1 erkennt Penta-Repeatmotive (5 Basen), wie den Marker D10S2325 im Humantype Chimera, nicht an. GeneMapper Software ist nicht GeneMapper ID Software. In der Analysemethode ist ein ungültiges BinSet eingestellt. Daten von verschiedenen Geräten z. B. ABI 310 und ABI 3130 wurden in einem Run Ordner abgelegt. Durch Störungen in der Elektrophorese wird ein zusätzliches Signal als Peak der Allelleiter erkannt. Werden Peaks der Allelleiter falsch benannt, kann diese Allelleiter nicht für die Auswertung verwendet werden. Ein Peak der Allelleiter liegt unter dem Peakerkennungswert ( RFU) der verwendeten Analysemethode und wird nicht als Peak erkannt. Im Panel Manager alle Panels löschen und zuerst die Panels/BinSets der Biotype importieren. Zueinander passende Versionen von Panels und BinSets in einem Ordner speichern. Im Windows Explorer Panel txt.-datei öffnen und Penta-Repeatmotiv des Markers D10S2325 von 5 auf 4 ändern. Anschließend die geänderte Panel Datei erneut importieren. Oder GeneMapper ID Software ab Version 3.2 aufwärts installieren. GeneMapper ID Software installieren Aktuelles BinSet einstellen. Biotype Vorlagen (Panels und BinSets) immer mit der gleichen Version verwenden z.b. v3 Daten von verschiedenen Geräten immer in verschiedene Run Ordner ablegen. Verwenden Sie eine andere Datei/Injektion der Allelleiter. Die analysierten Längen des Size Standards (in bp) der Allelleiter-Datei sollten zuerst überprüft werden. Für Biotype Testkits immer den DNA Längenstandard 550 verwenden. Die Allelleiter muss erneut in erhöhter Konzentration auf das Analysegerät geladen werden. Alternativ kann die Allelleiter Datei mit einem geringeren Peakerkennungswert (Peak Detection) in der GeneMapper ID Software neu analysiert werden. Ein Peak der Allelleiter wird nicht erkannt, da er nicht in dem von der Software erwarteten Größenbereich (in bp) liegt. Zuerst sollte die Fragmentlänge (in bp) des ersten Allels einer Farbe der Allelleiter mit dem entsprechenden Wert in den Kategorien verglichen werden, dann die weiteren Allele.

33 Beobachtung Mögliche Ursache Lösung Einzelne Marker werden nicht erkannt. In den Proben werden viele Peaks als OL (off-ladder alleles) benannt. Verschiedene Ursachen Der DNA Längenstandard 550 wurde nicht richtig definiert oder erkannt. Zu hohe Intensitäten am Analysegerät. Liegen die Peakhöhen der DNA Proben außerhalb des linearen Detektionsbereichs (>4000 RFU /ABI310; >5000 RFU /ABI3130) kann es zu erhöhten Stutterpeaks, geteilten Peaks (split peaks) und Artefakten kommen. Luftblasen in der Kapillare führen zu Überstrahlungen in allen Farbkanälen ( Spikes ). Dadurch kommt es zu Fehlbezeichnungen der Allele. Laufunterschiede der verschiedenen Kapillaren an ein und demselben Mehrkapillargerät können zu Verschiebungen bei der Allelzuordnung führen. Projektordner öffnen, betroffene Probe markieren und im Tabellenblatt Info die Fehlermeldung (Error Message) sowie die PQVs prüfen. Klicken auf das rote Icon Size Match Editor in der oberen Symbolleiste der GeneMapper ID Software. Dann den Längenstandard aller Proben anzeigen lassen und Fragmentlängen prüfen. Für Biotype Testkits immer den DNA Längenstandard 550 verwenden. Die Injektionszeit auf bis zu 1 Sekunde verringern oder weniger PCR-Produkt zur Analyse einsetzen oder weniger DNA in der PCR einsetzen. Zur Bestätigung der Ergebnisse Elektrophorese wiederholen. Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollte unabhängig von der Probenanzahl auf jeder Kapillare eine Allelleiter mitlaufen weitere Informationen hierzu stehen im Kapitel zum ABI 3130 in der Gebrauchsanleitung der Testkits. Punktallele, d. h. Allele mit mindestens 1 bp Abstand zum nächsten ganzzahligen Allel (z. B. TH01 9.3/10), wurden nicht erkannt. Homozygote Allele werden in der Tabelle nur einfach dargestellt. Fehlermeldung beim Speichern von Dateien Die Punktallele wurden in der GeneMapper ID Software nicht getrennt. Einstellung der GeneMapper ID Software Ländereinstellung Prüfen der Analyse Parameter. Evtl. Wert für die Peak Window Size auf 11 pts verringern und speichern! Anschließend die DNA Proben mit den veränderten Analyseparametern neu analysieren. Unter Tools Options im Tabellenblatt Analysis die Einstellung Duplicate homozygous alleles anklicken um z. B. das homozygote Allel 18 als 18/18 anzuzeigen. Ländereinstellung am PC auf English (United States) ändern. Warenzeichen 6-FAM, HEX, NED, ROX, ABI PRISM, GeneScan, Genotyper, GeneMapper und Applied Biosystems sind Warenzeichen von Life Technologies. Windows ist ein Warenzeichen der Microsoft Corporation.