Grundlagen der Durchflusszytometrie Arbeiten mit dem BD Fortessa und dem BD FACS ARIA III

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1 Grundlagen der Durchflusszytometrie Arbeiten mit dem BD Fortessa und dem BD FACS ARIA III Halle, BD Biosciences Dr. rer. nat. Uwe Speck Applikationsspezialist Sorter BD Biosciences Tullastr Heidelberg Tel. (06221) Fax (06221)

2 BD LSRFortessa Analyzer wichtige Spezifikation: > events/s ( Zellen/ml bei 60µl/min) max 12 Fluoreszenzen + Zeit + FSC/SSC 4 Laser : 405 nm, 488 nm, 561nm und 633 nm wird mit Diva gesteuert bietet mit dem CS&T Modul eine QC Software läuft unter Windows XP (Admin PW: BDIS)

3 BD FACSARIA III Analyzer und Sorter wichtige Spezifikation: identisch wie der BD Fortessa aber Sortiert > events/s ( Zellen/ml bei 60µl/min) 4 Wege Sorting Einzelzell-Ablage in 96 well Platten, Objektträger etc Automatisches Fluidiksystem für Startup und Shutdown Automatische Kontrolle eines stabilen Abrisspunktes

4 Wie funktioniert ein Durchflusszytometer? Laserstrahl Durch die Trägerflüssigkeit wird eine laminare Strömung erzeugt (Hüllstrom). Durch die Querschnittsverringerung in der Meßküvette wird sowohl der laminare Probenals auch der Hüllstrom beschleunigt und dadurch verjüngt (hydrodynamische Fokussierung). Beide Strömungen vermischen sich dabei nicht! Probe Trägerflüssigkeit Der Abstand zwischen direkt aufeinanderfolgenden Zellen wird vergrößert, so daß die Zellen jeweils einzeln den Laserstrahl passieren und damit als einzelne Zelle gemessen werden. Verklebte Zellen werden nicht vereinzelt!

5 Wie funktioniert ein Durchflusszytometer? Laserstrahl Durch die Trägerflüssigkeit wird eine laminare Strömung erzeugt (Hüllstrom). Durch die Querschnittsverringerung in der Meßküvette wird sowohl der laminare Probenals auch der Hüllstrom beschleunigt und dadurch verjüngt (hydrodynamische Fokussierung). Beide Strömungen vermischen sich dabei nicht! Probe Trägerflüssigkeit Der Abstand zwischen direkt aufeinanderfolgenden Zellen wird vergrößert, so daß die Zellen jeweils einzeln den Laserstrahl passieren und damit als einzelne Zelle gemessen werden. Verklebte Zellen werden nicht vereinzelt!

6 Wie funktioniert ein Durchflusszytometer? Laserstrahl Durch die Trägerflüssigkeit wird eine laminare Strömung erzeugt (Hüllstrom). Durch die Querschnittsverringerung in der Meßküvette wird sowohl der laminare Probenals auch der Hüllstrom beschleunigt und dadurch verjüngt (hydrodynamische Fokussierung). Beide Strömungen vermischen sich dabei nicht! Probe Trägerflüssigkeit Der Abstand zwischen direkt aufeinanderfolgenden Zellen wird vergrößert, so daß die Zellen jeweils einzeln den Laserstrahl passieren und damit als einzelne Zelle gemessen werden. Verklebte Zellen werden nicht vereinzelt!

7 Wie funktioniert ein Durchflusszytometer? Sorten Der Sorter produziert einen konstanten Strom von Tropfen, in denen die Zellen liegen. Die Tropfen werden generiert, wenn die Flüssigkeit unter hohem Druck durch eine kleine Öffnung gepresst wird (Nozzle). Tropfen die eine gesuchte Zelle enthalten werden elektrisch aufgeladen. Ein Spannungsfeld lenkt die Tropfen in die gewünschte Richtung

8 Was messen wir? FSC und SSC Seitwärtsstreulicht (488 nm): Zellkomplexität/-granularität Lichtquelle (488 nm) Vorwärtsstreulicht (488 nm): Zellgröße Vorwärtsstreulicht (FSC) - Lichtbeugung - proportional zur Zelloberfläche (Zellgröße) - gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes (1-10 ) Seitwärtsstreulicht (SSC) - Lichtbrechung und Reflexion - proportional zur Zellkomplexität oder -granularität - gemessen in einem 90 o Winkel zum einfallenden Licht

9 Beispiel für FSC/SSC: Lysiertes Vollblut Seitwärtsstreulicht (SSC) Neutrophile Granulozyt en Monozyte n Debris Vorwärtsstreulicht (FSC) Lymphozyt en

10 Was messen wir? Fluoreszenzintensität Das emittierte Fluoreszenzlicht ist proportional zur Zahl der gebundenen Fluorochrommoleküle Zahl der Ereignisse Relative Fluoreszenzintensität 10 4

11 Was messen wir? Fluoreszenzintensität Das emittierte Fluoreszenzlicht ist proportional zur Zahl der gebundenen Fluorochrommoleküle Zahl der Ereignisse Relative Fluoreszenzintensität 10 4

12 Wie werden die Fluoreszenzen gemessen? abhängig von der Probenvorbereitung die Wellenlänge ist vom jeweils eingesetzten Fluorochrom abhängig Fluoreszenzen werden auch im 90 Winkel gemessen abhängig vom Gerätetyp 3-4 Fluoreszenzen (1-2 Laser): BD FACSCalibur 6-8 Fluoreszenzen (2-3 Laser): BD Canto A bzw Canto II max. 18 Fluoreszenzen (2-5 Laser): BD LSR und ARIA

13 Multicolor-Analysen mit dem Durchflußzytometer Was ist neu? Mehr Laser und PMTs mehr Antigene gleichzeitig nachweisbar bessere interne Kontrollen und fast immer lebend/tot Färbung möglich Identifizierung neuer/seltener Populationen (<0.05%) spart ggf. Zeit, Proben, Reagenzien (1) 6-Farb Färbung = (15) 2-Farb Färbungen Digitale Signalverarbeitung Daten werden linear/unkompensiert gespeichert mathematische/reversible Kompensation Kompensation ohne Lichtverlust Threshold auf allen Lasern möglich höherer Auflösung

14 Multicolor-Analysen mit dem Durchflußzytometer Nachteile Sorgfältige Auswahl der Farbstoffkombination nötig Die Antikörper müssen besser austritiert werden neue Kontrollen (FMO!) Kompliziertes Gerätesetup (Kompensation!) Überprüfung des Gerätes wird wichtiger (z.b. Time Delay) Die Hilfen Automatisierte Algorithmen für Kompensation bei digitalen Systemen Automatische Geräteüberprüfung und Setup mit dem CS&T-Modul Biexponential Display

15 Welche Farben? Regel 1: schwach exprimiertes Antigen = starkes Fluorochrom stark exprimiertes Antigen = schwaches Fluorochrom

16 Welche Farben? Regel 2: man versucht auf einer Zelle keine Farben zu kombinieren, die starke Überlappungen haben, wenn eine hohe Sensitivität gefragt ist Starker Spillover von in den FL2 Schwach FL2-positive Signale sind nicht zu diskriminieren Kein Spillover von PerCP in FL2: Gute Trennung von schwach PE und stark PerCP doppeltpositiven Signalen Man muß seine Zellen kennen. Es funktioniert keine 8-fach Färbung mit 7 unbekannten Antigenen leichter gesagt als getan...

17 Absorptionsspektren (Anregungsspektrum) gebräuchlicher Fluorochrome 100 PerCP PI R-PE APC Blauer Laser 488 nm Roter Laser 635 nm 700 Wellenlänge (nm)

18 Emissionsspektren (=Fluoreszenzspektren) gebräuchlicher Fluorochrome 100% AmCyan PE PerCP PE-Cy7 Normierte Intensität PacificBlue PE-Cy7 APC APC-Cy7 PerCP- Cy5.5 APC-Cy7 0% Wellenlänge (nm) 800

19 Spektren auf /spectra

20 Ein Durchflußzytometer besteht aus drei kombinierten Komponenten 1. Flüssigkeitssystem Transport und Fokussierung der Zellen im Meßpunkt 2. Optik Anregung Detektion 3. Elektronik Umwandlung von optischen in elektronische Signale und Digitalisierung der elektronischen Signale für die Computeranalyse

21 Das Flüssigkeitssystem des BD LSR II Luftfilter Luftpumpe Druckregler Meßküvette Abfallbehälter Trägerflüssigkeitsbehälter Probendruckregler Probenröhrchen Trägerflüssigkeitsfilter

22 Überblick über das Fluidiksystem Die Fluidik Cart liefert fortlaufend Flüssigkeit für etwa 20 Stunden, bei Benutzung Medium Flussrate. Es sind drei unterschiedliche Flussraten wählbar 10 µl/min - Low 35 µl/min - Medium + Drehknopf (halbieren/verdoppeln) 60 µl/min - High

23 Probenfluß in der Messküvette des BD LSR Fortessa Niedriger Probendruck (Low) Hoher Probendruck (High) roter Laser blauer Laser Partikel hintereinander (ca. 10 µl/min) violetter Laser Partikel versetzt nebeneinander (ca. 120 µl/min) Mantelflüssigkeit (FACS-Sheath) Probe Mantelflüssigkeit Wann low und wann high? Probe Mantelflüssigkeit

24 Lichtweg im BD LSR II

25 Lichtweg im BD LSR II

26 Lichtweg im BD LSR II

27 Lichtweg im BD LSR II

28 Probenfluß in der Meßküvette (LSR Fortessa) Laser Alignment nm nm nm nm Detektion System Räumlich getrennte Glasfaserwege feste Weite 125 µm auseinander Laserhöhe 15 µm

29 Probenfluß in der Meßküvette (LSR Fortessa) Laser Alignment nm nm nm nm Detektion System Räumlich getrennte Glasfaserwege feste Weite 125 µm auseinander Laserhöhe 15 µm

30 Probenfluß in der Meßküvette (LSR Fortessa) Laser Alignment nm nm nm nm Detektion System Räumlich getrennte Glasfaserwege feste Weite 125 µm auseinander Laserhöhe 15 µm

31 Probenfluß in der Meßküvette (LSR Fortessa) Laser Alignment nm nm nm nm Detektion System Räumlich getrennte Glasfaserwege feste Weite 125 µm auseinander Laserhöhe 15 µm

32 Sammeloptik LSR II Octagon - z.b. blauer Laser langwelliges = schwaches Licht zuerst > 670 nm nm nm nm nm

33 Elektronik wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um. digitalisiert die elektronischen Signale analysiert die Höhe (H = Height), die Fläche (A = Area) und die Weite (W = Width) des Spannungspulses und übermittelt diese an den Computer zur Analyse

34 Umwandlung optischer Signale in elektronische Signale (digital) Photon Ein Signal Aus Analog / Digital Umwandlung (ADC) Digitale Datenspeicherung Spannung Ein PMT Power Supply Levels Volt Digitalisieren des Pulses in Kanäle Pulsdarstellung (10 MHz) = 10 Mio. Mess./sek.

35 Entstehung eines Spannungspulses Laser Spannung Zeit

36 Entstehung eines Spannungspulses Laser Spannung Zeit

37 Entstehung eines Spannungspulses Laser Spannung Zeit

38 Auswertung eines Spannungspulses 2 10 = 1024 Kanäle 2 14 = Kanäle Volt Pulshöhe (H) Pulsfläche (A) 0 Pulsweite (W) Zeit (µs)

39 Auswertung eines Spannungspulses LSR II 10 MHz ADC: ein 3 µsec Pulse hat ~ 30 Abtastungen 2 14 = Kanäle 0 volts Summe der 14 Bit Höhenmessungen Pulsfläche ist ein Maß der Gesamt-Fluoreszenz (18 Bit Auflösung) - entspricht Kanäle oder log

40 Auswertung eines Spannungspulses LSR II 10 MHz ADC: ein 3 µsec Pulse hat ~ 30 Abtastungen 2 14 = Kanäle 0 volts 3.0 µs Summe der 14 Bit Höhenmessungen Pulsfläche ist ein Maß der Gesamt-Fluoreszenz (18 Bit Auflösung) - entspricht Kanäle oder log

41 Auswertung eines Spannungspulses LSR II 10 MHz ADC: ein 3 µsec Pulse hat ~ 30 Abtastungen 2 14 = Kanäle Extended Window 0 volts 3.0 µs Summe der 14 Bit Höhenmessungen Pulsfläche ist ein Maß der Gesamt-Fluoreszenz (18 Bit Auflösung) - entspricht Kanäle oder log

42 Auswertung eines Spannungspulses LSR II 10 MHz ADC: ein 3 µsec Pulse hat ~ 30 Abtastungen 2 14 = Kanäle Extended Window 0 volts 3.0 µs Summe der 14 Bit Höhenmessungen Pulsfläche ist ein Maß der Gesamt-Fluoreszenz (18 Bit Auflösung) - entspricht Kanäle oder log

43 Zusammenfassung Zei t SSC FSC Orange Grün Zei t Zei t Daten Prozessor FSC SSC Zei t Zei t Grün Orange Rot

44 Geräteeinstellungsparameter (Instrument Settings) Spannungs- und Verstärkereinstellungen (Detectors/ Amplifier) Schwellenwert (Threshold) Kompensation (Compensation)

45 Die Spannungs- und Verstärkereinstellungen (Detectors/Amps) BD FACS Diva läuft auf BD Canto, BD Fortessa und BD ARIA Die genauen Werte für die Spannungs- und Verstärkereinstellungen sind sowohl von der Applikation (Art der Zellen, Probenvorbereitung etc.) als auch vom jeweiligen Durchflußzytometer abhängig (optische Eigenschaften). Ob ein Parameter linear oder logarithmisch verstärkt wird, ist in der Regel durch die Anwendung bedingt.

46 Ermitteln der optimalen Verstärkung Wichtige Kriterien: Optimale Lage der ungefärbten Zellen: Die negativen Zellen sollten in einem Bereich liegen, wo das elektronische Rauschen eine untergeordnete Rolle spielt. Keine gefärbte Population off scale Maximale Trennung von negativen und positiven Populationen Die Messung sollte eine optimale Auflösung und Sensitivität haben und lineare Ergebnisse liefern

47 Ermitteln der optimalen Verstärkung Aber wie? Die minimale Verstärkung Es gibt für jeden Parameter/PMT eine minimale Verstärkung. Unterhalb von diesem Wert verliert man an Auflösung - oberhalb wird sie aber nicht besser. Ermittelt wird dieser Wert in Diva 6 von dem CS&T Modul und automatisch als Standard Voltage in der Software gespeichert weitergeleitet. CV als Maß für die Auflösung Verstärkung in Volt

48 Warum Kompensation oder die Frage: Nature vs Arzt und Hund PE-A positiv = Nature

49 Warum Kompensation oder die Frage: Nature vs Arzt und Hund PE-A positiv = Nature

50 Die Emissionsspektren der Fluorochrome überlappen sich 100% R-PE PI APC PerCP Normierte Intensität 0% Wellenlänge (nm) 700

51 Die Emissionsspektren der Fluorochrome überlappen sich 100% R-PE PI APC PerCP Normierte Intensität 0% Wellenlänge (nm) 700

52 Die Kompensation Die Kompensation erlaubt die Korrektur der spektralen Überlappung. Kompensation ist (immer) erforderlich, sobald mehr als eine Fluoreszenz simultan gemessen werden soll. Die Kompensationswerte sind von den verwendeten Fluorochromen abhängig Nach erfolgter Kompensationseinstellung dürfen die PMT- Spannungen der Fluoreszenzparameter nicht mehr verändert werden (funktionelle Abhängigkeit). Beim digitalen Geräten werden die Daten unkompensiert an den Computer gegeben und die Kompensation erfolgt automatisch in Form einer mathematischen Berechnung.

53 Die Kompensation Die Kompensation erlaubt die Korrektur der spektralen Überlappung. Kompensation ist (immer) erforderlich, sobald mehr als eine Fluoreszenz simultan gemessen werden soll. Die Kompensationswerte sind von den verwendeten Fluorochromen abhängig Nach erfolgter Kompensationseinstellung dürfen die PMT- Spannungen der Fluoreszenzparameter nicht mehr verändert werden (funktionelle Abhängigkeit). Beim digitalen Geräten werden die Daten unkompensiert an den Computer gegeben und die Kompensation erfolgt automatisch in Form einer mathematischen Berechnung.

54 -Fluoreszenzüberstrahlung FL1 530/3 0 FL2 585/4 2 Relative Intensität 500n m 550n m Wellenlänge (nm) 600n m 670n m 700n m

55 -Fluoreszenzüberstrahlung FL1 530/3 0 FL2 585/4 2 FL2 Relative Intensität FL1 500n m 550n m Wellenlänge (nm) 600n m 670n m 700n m

56 -Kompensation Absenken der Population durch stete Erhöhung des vom FL2-Detektor subtrahierten Wertes... FL1-0.0 FL FL2-0.0 FL3-0.0 % FL2 % FL1 % FL3 % FL2 FL1 FL2 Relative Intensität 530/ / n 550n 600n m m m Wellenlänge (nm) 650n m weil 24.8 % des maximalen -Signals in FL2 gemessen wird 700n m

57 8 Farben Panel mit 3 Lasern am LSR II Single-stained controls: CD4 CD4 PE CD28 PerCP-Cy5.5 FL2 CD45RA PE-Cy7 CD27 APC Autocomp CD8 APC-Cy7 CD3 Pacific Blue CD4 AmCyan

58 8 Farben Panel mit 3 Lasern am LSR II Single-stained controls: CD4 CD4 PE CD28 PerCP-Cy5.5 FL2 CD45RA PE-Cy7 CD27 APC Autocomp CD8 APC-Cy7 CD3 Pacific Blue CD4 AmCyan

59 Kompensationsbeispiele Inkorrekte Kompensation Korrekte Kompensation unterkompensiert überkompensiert FL2

60 Kompensation ist unabhängig von Antigen und Fluoreszenzintensität FL2 Kleine Fehler in der Kompensation einer schwach gefärbten Kontrolle (A) können zu großen Fehlern bei Verwendung von stark gefärbten Reagenzien (B, C) in der Kompensation führen. -> Stark gefärbte Marker verwenden, um die Kompensation einzustellen.

61 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2

62 Kompensation führt zu Data-Spreading no compensation with compensation FL2

63 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2

64 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2

65 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2

66 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2 Mehr Farben -> mehr Spillover -> höherer Hintergrund -> schlechtere Auflösung

67 Kompensation führt zu Data-Spreading FL2

68 Data Spreading und Sortieren FL2

69 Data Spreading und Sortieren FL2

70 Data Spreading und Sortieren Signal FL2

71 Data Spreading und Sortieren Signal FL2 Noise

72 Die Praxis: Spillover Matrix Kompensation

73 Die Praxis: Spillover Matrix Kompensation

74 Die Praxis: Spillover Matrix Kompensation

75 Die Praxis: Spillover Matrix Kompensation Spillover calculation AutoCompensation method Matrix algebra (PE = 0.83%) Spillover coefficient = slope k k = ( ) ( ) = 1 k = k k k = = PE comp = PE k 1

76 BD CompBeads Polystyrolmikropartikel an deren Oberfläche einer der folgenden Antikörper gekoppelt ist: Anti-Mouse IgG, kappa Anti-Rat IgG, kappa Anti Hamster/Rat IgG, k + neg Kontrolle, d.h. Beads ohne Bindungskapazität FL2 Vorteile: einfach und schnell, wenig AK nötig, man kann die AK verwenden, die auch im Versuch zum Einsatz kommen Nachteile: geht nicht beim Einsatz von GFP u.ä., PI, CFSE und ist u.u. nur 98% korrekt.

77 SSC A 335 Off A 533 On PE A 632 On PerCP-Cy5-5 A 753 On PE-Cy7 A 780 On SSC A 335 Off A 533 On PE A 632 On PerCP-Cy5-5 A 753 On PE-Cy7 A 780 On Autokompensation mit Zellen versus Compbeads APC A 663 On APC-Cy7 A 676 On Threshold Operator: OR APC A 663 On APC-Cy7 A 676 On Threshold Operator: OR FL2 Threshold Parameters Threshold FSC Compensation State: Enabled Fluorochromes Value(%) PE - 13,79 PerCP-Cy ,72 PE-Cy7-0,47 APC - 0,00 APC-Cy7-0,40 - PE 1,10 PerCP-Cy5-5 - PE 15,83 PE-Cy7 - PE 2,32 APC - PE 0,00 APC-Cy7 - PE 0,00 - PerCP-Cy5-5 0,10 PE - PerCP-Cy5-5 0,14 PE-Cy7 - PerCP-Cy5-5 24,67 APC - PerCP-Cy5-5 15,94 APC-Cy7 - PerCP-Cy5-5 2,37 - PE-Cy7 1,30 PE - PE-Cy7 3,65 PerCP-Cy5-5 - PE-Cy7 0,58 APC - PE-Cy7 2,09 APC-Cy7 - PE-Cy7 4,51 - APC 0,03 PE - APC 0,01 PerCP-Cy5-5 - APC 0,26 PE-Cy7 - APC 0,10 APC-Cy7 - APC 3,21 - APC-Cy7 0,13 PE - APC-Cy7 0,06 PerCP-Cy5-5 - APC-Cy7 0,19 PE-Cy7 - APC-Cy7 3,09 APC - APC-Cy7 27,94 Ratio Parameters Zellen Scaling(%) Threshold Parameters Threshold FSC Compensation State: Enabled Fluorochromes Value(%) PE - 13,50 PerCP-Cy ,53 PE-Cy7-0,22 APC - 0,04 APC-Cy7-0,00 - PE 1,08 PerCP-Cy5-5 - PE 15,85 PE-Cy7 - PE 2,33 APC - PE 0,10 APC-Cy7 - PE 0,00 - PerCP-Cy5-5 0,00 PE - PerCP-Cy5-5 0,00 PE-Cy7 - PerCP-Cy5-5 23,57 APC - PerCP-Cy5-5 15,23 APC-Cy7 - PerCP-Cy5-5 1,88 - PE-Cy7 0,17 PE - PE-Cy7 1,65 PerCP-Cy5-5 - PE-Cy7 0,40 APC - PE-Cy7 0,18 APC-Cy7 - PE-Cy7 3,56 - APC 0,00 PE - APC 0,00 PerCP-Cy5-5 - APC 0,24 PE-Cy7 - APC 0,02 APC-Cy7 - APC 2,96 - APC-Cy7 0,09 PE - APC-Cy7 0,00 PerCP-Cy5-5 - APC-Cy7 0,00 PE-Cy7 - APC-Cy7 2,85 APC - APC-Cy7 27,18 Ratio Parameters BD CompBeads Scaling(%) Page 1 Page 1

78 Set up des FACS Kompensation Nur 4 Regeln für die Kompensation Das Spektrum der Kompensationskontrollen muss identisch zu den Reagenzien im eigentlichen Versuch sein kritisch für Tandenkonjugate vorsicht bei Fixierung auch ähnliche Fluorochrome wie und Alexa 488 brauchen unterschiedliche Kompensation Positive und negative Zellen/Beads müssen die gleiche Autofluoreszenz haben Positivkontrollen sollten so hell wie möglich sein Höhere Genauigkeit bei geringeren Kompensation z.b. -> PE-Cy7 Berechnung mit Dim Events -> Präzision bei hoher Fluoreszenz stimmt nicht Genügend Events aufnehmen Zwar reichen der Autokompensation 50 positive events, aber der statistische Fehler ist größer 2500 events geben 1% SD

79 Negative Werte nach digitaler Kompensation FL2

80 Negative Werte nach digitaler Kompensation FL2 Biexponential Display: Passt die Darstellung an - keine Änderung der Werte!

81 Negative Werte nach digitaler Kompensation FL2 Biexponential Display: Passt die Darstellung an - keine Änderung der Werte!

82 Negative Werte nach digitaler Kompensation FL2 Biexponential Display: Passt die Darstellung an - keine Änderung der Werte!

83 Darstellung der Daten echter Logarithmus 262,144 9 values 90 values 900 values 9,000 values 90,000 values

84 Darstellung der Daten echter Logarithmus 262,144 9 values 90 values 900 values 9,000 values 90,000 values

85 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Fluorescence minus one control (FMO) Isotype Control FL2 Ms IgG1 PE Ms IgG1 APC

86 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Fluorescence minus one control (FMO) Isotype Control FMO FL2 Ms IgG1 PE Ms IgG1 PE Ms IgG1 APC CD3 APC

87 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Fluorescence minus one control (FMO) Isotype Control FMO FL2 Ms IgG1 PE Ms IgG1 PE Ms IgG1 APC CD3 APC

88 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Fluorescence minus one control (FMO) Isotype Control FMO Sample 1 FL2 Ms IgG1 PE Ms IgG1 PE Ms IgG1 APC CD3 APC

89 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Fluorescence minus one control (FMO) Isotype Control FMO Sample 1 FL2 Ms IgG1 PE Ms IgG1 PE! Ms IgG1 APC CD3 APC

90 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Dubletten-Auschluß über das Width-Signal am Beispiel der Zellzyklusanalyse 600 G 0 /G 1 doublets FL2 PI-A R2 G 2 /M phase S phase G 0 /G 1 phase PI-W

91 Was brauche ich noch für ein erfolgreiches Experiment? Dubletten-Auschluß über das Width-Signal am Beispiel der Zellzyklusanalyse 600 G 0 /G 1 doublets FL2 PI-A R2 G 2 /M phase S phase G 0 /G 1 phase PI-W

92 Datenspeicherung Die Messungen werden in der Regel als sogenannte List Mode Datensätze (FCS Files) gespeichert. allgemeine Informationen, z.b. Probenidentifikation zellbezogen die Meßwerte für jeden Meßparameter - wichtig für die Darstellungs- und Auswertemöglichkeiten z.b. Histogrammstatistik Calibur bzw CellQuest: FCS 2.0 Canto bzw. Diva: FSC 3.0 (aber FCS 2.0 kompatibel)

93 Die Größe der Dateien kb events 1 Fl 2 Fl 4 Fl 8 Fl 12 Fl A, H or W A+H+W

94 Die Größe der Dateien kb events 1 Fl 2 Fl 4 Fl 8 Fl 12 Fl Configuration : FSC, SSC, 6 fluo, time, A, H und W events werden gespeichert: Dateigröße : A, H or W A+H+W

95 Die Größe der Dateien kb events 1 Fl 2 Fl 4 Fl 8 Fl 12 Fl Configuration : FSC, SSC, 6 fluo, time, A, H und W events werden gespeichert: Dateigröße : 233 MB A, H or W A+H+W

96 Die Größe der Dateien kb events 1 Fl 2 Fl 4 Fl 8 Fl 12 Fl Configuration : FSC, SSC, 6 fluo, time, A, H und W events werden gespeichert: Dateigröße : 233 MB Farben die man nicht nutzt abschalten! A, H or W A+H+W

97 Die Größe der Dateien Wo stellt man die Parameter aus?

98 Die Größe der Dateien Wo stellt man die Parameter aus?

99 PAUSE!

100 Perfekt Sortieren Voraussetzung: Mein Gerät läuft stabil und ist perfekt eingestellt. Der Tropenabriss ist stabil und es bilden sich wenige Satelliten Sweet Spot hält den Abrisspunkt über den Tag stabil - wenn sonst alles stimmt

101 Perfekt Sortieren Voraussetzung: Der richtige Tropfen muss sortiert werden Das DropDelay muss korrekt eigestellt werden Gut, dass es ein Auto DropDelay mit Beads gibt DropDelay

102 Perfekt Sortieren Was wir wollen: max. Reinheit alle Zellen aus der Probe hohe Sortiergeschwindigkeit

103 Perfekt Sortieren Die Realität: Die Zellen kommen nicht gleichmäßig verteilt, sondern zufällig (Poisson Statistik). Ich muss entscheiden was mir wichtig ist und kann aus vordefinierten Sortmodes wählen: Purity Yield Single Cell 4-way Purity Initial (for AccuDrop) FineTune (for AccuDrop)

104 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Sauber, aber ich verliere Zellen Height 3 us Time

105 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Sauber, aber ich verliere Zellen Height 3 us Droplet frequency: Time 87 khz means 87,000 droplets/sec 87,000 droplets/10 6 us 11.5 us/droplet

106 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Sauber, aber ich verliere Zellen Height 3 us Time

107 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Sauber, aber ich verliere Zellen Height 3 us Time

108 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Sauber, aber ich verliere Zellen Height 3 us Time

109 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Ein Reduzieren der events/sec erhöht meine Ausbeute Height Time

110 Purity Ein Tropfen wird nicht sortiert, wenn eine falsche Zelle in dem gleichen Tropfen oder im Nachbartropfen ist. Ein Reduzieren der events/sec erhöht meine Ausbeute Height Time

111 Purity Mask Purity mask 0 The target drop is always sorted, regardless how close other events may be Purity mask 16 If a cell is close to the edge of an adjacent drop, also the target drop is not sorted to prevent any possible contamination Purity mask 32 Strict condition, every event near the target drops results in a sort abort decision

112 Yield Mask Yield mask 0 Yield mask 16 Yield mask 32 Only one drop with the cell is sorted If the cell falls into the area of the mask, also the following or adjacent drop is elected for sorting. If the cell is in the central area of the drop, only one drop is sorted The drop is now completely covered. A cell will always be in the area of the mask and therefore always two drops are sorted.

113 High Speed Sorting Realistische Zahlen HIGHSPEED Sorting Tropfen pro Sekunde Zellen pro Sekunde (gleichmässige Verteilung) 1% positive Zellen von Interesse = 250 Zellen pro Sekunde positiv = 187 Zellen pro Sekunde werden sortiert (75%) Zellen = 4 Sekunden 1x10 6 Zellen = 40 Sekunden 10x10 6 Zellen = 400 Sekunden = 6,5 Minuten 100x10 6 Zellen = 4000 Sekunden = 1,1 Stunden 1000x10 6 zellen = Sekunden = 11 Stunden

114 Die verschiedenen Nozzle und ihre Limitierungen The BD FACSAria II TM has three nozzles with 70, 85, and 100 micrometers size. 70 micrometer nozzle 70 psi pressure, 87 khz frequency cells/second max for high yield Lmyphocytes (10-12 Micrometer cell size) 85 micrometer nozzle 45 psi pressure, 47 khz frequency cells/second max for high yield Macrophages, Jurkat cells(12-15 Micrometer cell size) 100 micrometer nozzle 20 psi pressure, 30 khz frequency cells/second max for high yield Tissue cells, adherent cell lines (15-20 micrometer cell size)

115 Und was mache ich jetzt damit? Klassische Immunologie: Aufreinigung von Subpopulationen - gerade wenn mehr als ein Sortkriterium gebraucht wird Gewinnung sehr seltener Populationen - < 0,1% Abtrennung transfizierter Zellen - Dank des 561 nm Lasers gehen nicht nur GFP und dsred, sondern auch mcherry, mplum etc MLR mit genau definierten Ratios mit Hilfe der Einzelzellablage

116 Und was mache ich jetzt damit? Klassische Immunologie: Aufreinigung von Subpopulationen - gerade wenn mehr als ein Sortkriterium gebraucht wird Gewinnung sehr seltener Populationen - < 0,1% Abtrennung transfizierter Zellen - Dank des 561 nm Lasers gehen nicht nur GFP und dsred, sondern auch mcherry, mplum etc MLR mit genau definierten Ratios mit Hilfe der Einzelzellablage

117 Und was mache ich jetzt damit? Zellbiologie: FRET z.b. zwischen CFP und YFP Klonierung durch Einzelzellablage in well Platten Messung von phosphorylierten Proteinen aus der Signalkaskade

118 Beispiel für eine 4 Wege Sortierung Während der T-Zell Reifung im Thymus durchlaufen unreife CD4-CD8- Zellen vier distinkte Stufen, die durch unterschiedliche Expression von CD44 und CD25 gekennzeichnet sind: CD44 hi -CD25 - CD44 hi -CD25 + CD44 lo -CD25 + CD44 lo -CD25 -

119 Ziel Sortierung der vier CD44 / CD25 populationen 5 Farben Ansatz CD44 CD4 PE CD8 PE-Cy7 CD3 APC CD25 APC-Cy7

120 Gating Strategie Lymphozyten (85% total) Doppelt negative (1.8% total) CD3-negativ (1.3% total)

121 Gating Strategie Lymphozyten (85% total) Doppelt negative (1.8% total) CD3-negativ (1.3% total) 0.1% 0.2% 0.3% 0.7%

122 Ergebnis CD25 - CD44 + Population Aggregate mit negativen Zellen können für eine Verunreinigung sorgen.

123 Ergebnis CD25 - CD44 - Population Aggregate mit positiven Zellen wurden ausgeschlossen, deshalb 100% Reinheit

124

125 Danke schön!!!

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