laborwelt Protein-Analytik Marktübersicht: Leuchtproteine Nr. 4 / Jahrgang

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1 laborwelt Nr. 4 / Jahrgang Protein-Analytik Imaging: Fluoreszenzund Biolumineszenz-Nachweis von Proteinen Molekulare Greifer: Antikörper-basierte Sensoren zur Proteindetektion Filtrations-Nachweis von alpha-syuclein-aggregaten in Parkinson-Modellen Marktübersicht: Leuchtproteine

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3 Editorial Inhalt Human Proteom- Projekt startet Bereits im August soll es soweit sein. Nachdem Forscher um den scheidenden NIH-Chef Francis Collins das Human Genome Project weitgehend abgeschlossen haben, folgt nun das Human Proteome Project. Näheres werden der Präsident der Human Proteome Organisation (HUPO) Rolf Apweiler (EBI, Hinxton, UK) und Koordinator Mathias Uhlen (Karolinska Institutet, Stockholm) auf dem 7. HUPO-Weltkongress Mitte August in Amsterdam verlauten. Nur soviel scheint klar: Protein- Lokalisationsstudien, wie bereits im Human ProteinAtlas-Projekt gesammelt, sollen mit Daten aus Interaktionsstudien und Informationen über Protein-Binder vernetzt werden. Von der Initiative erhoffen sich Proteinforscher weltweit einen Zugriff auf bessere Ressourcen, um einen tieferen Einblick in das komplexe Wechselspiel auf Proteinebene zu gewinnen. In dieser Themenausgabe Proteinanalytik haben wir versucht, einige der wichtigsten aktuellen Werkzeuge für Sie, liebe Leser, zusammenzustellen Leuchtproteine für Lokalisationsstudien (vgl. Seite 31 und Marktübersicht S. 35). molekulare Binder (vgl. S. 4), die durch den Einsatz amplifizierbarer Oligonukleotid-Sonden die Empfindlichkeit von ELISA- Tests um ein Vielfaches übertreffen, sowie massenspektrometrische Verfahren zur quantitativen Analyse der Proteinzusammensetzung innerhalb komplexer Proben (vgl. Seite 12, 15, 18). Auch der Nachweis der eventuell weiter verbreiteten Proteinregulation durch Lysinmethylierung (S. 23) und ein Filtrationsassay zum Nachweis unlöslicher Proteinaggregate (S. 9) werden vorgestellt. Dies zeigt, dass die derzeitige Ruhe um die Proteinanalytik alles andere als begründet ist. Noch ein Wort in eigener Sache: ein herzliches Dankeschön Ihnen, liebe Leser, für die große Beteiligung an der ersten LABORWELT- Leserumfrage und Ihre überaus positiven Beurteilungen. Was dabei herauskam und wer die glücklichen Gewinner der ipod Nanos sind, erfahren Sie auf Seite 50. Thomas Gabrielczyk In diesem Heft Inhalt Blitzlicht Proteindetektion 4 Molekulare Greifer: Antikörper-basierte Proteinsensoren Prof. Dr. Tomasz Heyduk, St. Louis Medical School, USA Blitzlicht Proteomics 6 Sensitive Quantifizierung von Proteinen durch gezielte Massenspektrometrie Prof. Dr. Ruedi Aebersold et al., ETH Zürich Titel: Proteinanalytik Blick durch die Nano-Spray-Ionenquelle eines linearen Ion-Trap- Massenspektrometers für die Proteomanalyse. Foto: Andy Tao, Purdue University, West Lafayette Blitzlicht Membranfilter 9 Quantifizierung von a-synuclein-aggregaten mit dem PAF-Assay Dr. Michael Kramer, Universität Göttingen Blitzlicht Massenspektrometrie 12 Protein-Quantifizierung nach in-gel-verdau/itraq-markierung Dr. Henning Urlaub et al., MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen Wissenschaft Proteinquantifizierung 15 Quantifizierung Arzneimittel-metabolisierender Leberenzyme Prof. Dr. Katrin Marcus et al., MPC, Universität Bochum Blitzlicht Glykoanalytik 18 Nachweis pathogener Glykanstrukturen mittels Staudinger-Ligation Dr. Udo Sticher, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen Blitzlicht Proteinhaltbarkeit 21 Stabilitätsstudien von Biopharmazeutika Dr. Stefan Künzig, Biopharm GmbH, Heidelberg Blitzlicht Datenbanken 22 Molmeth Datensammlung für molekulare Methoden Prof. Dr. Ulf Landegren et al., Rudbeck Laboratory, Uppsala Report Proteinmodifikation 24 Detektion der Lysinmethylierung in Nicht-Histonproteinen Prof. Dr. Albert Jeltsch et al., Universität Bremen Report Technologietransfer 28 Die lebenswissenschaftliche Innovationsplattform Prof. Dr. Helmut E. Meyer, Prof. Dr. Roland Winter et al., LIP Dortmund Report Leuchtproteine 31 Fluoreszenz- und Biolumineszenzmethoden in der Proteinanalytik Dr. Anke Prinz, Universität Kassel Marktübersicht: Leuchtproteine Fusionsproteine aus GFP und seinen Varianten sowie an Antikörper gekoppelte Oligonukleotidsonden, die nach Targetbindung und Ligation komplementärer Sequenzen leuchten, bieten immer mehr bessere Möglichkeiten, Proteine in vivo und in vitro nachzuweisen. Einen Einblick in die vielfältige Produktwelt, geben die Hersteller in der aktuellen Marktübersicht Leuchtproteine (ab Seite 35). Service Marktübersicht 35 Leuchtproteine 39 Stellenmarkt 45 Verbände 46 Produktwelt 49 Termine 50 Ausblick/Impressum LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/2008 3

4 Blitzlicht Proteindetektion Molekulare Greifer: Antikörper-basierte Proteinsensoren Tomasz Heyduk, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, USA Wir haben neue homogene Antikörper-basierte Sensoren entwickelt, die eine schnelle Detektion von Zielproteinen gestatten, ohne dass komplizierte Probenmanipulationen erforderlich wären. Das Sensor-Design ist so ausgelegt, dass sich damit grundsätzlich jedes Proteintarget detektieren lassen sollte. Die Detektion und das Erfassen der Konzentration eines spezifischen Proteins ist einer der häufig sten Tests in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik. Obgleich der derzeitige Standardtest für die spezifische Proteindektion, ELISA, sich als extrem wertvoll erwiesen hat, gab es doch einen beständigen Bedarf, neue, einfachere und schnellere Alternativen zum ELISA zu entwickeln. Ein aktueller Bericht 1 beschreibt ein neues Testdesign (Abb. 1A), das mit kurzen Oligonukleotiden markierte Antikörper nutzt. Ein Antikörperpaar, das nichtüberlappende Proteinepitope eines Proteins erkennt, wurde mit einem Paar kurzer, komplementärer signalgebender Oligonukleotide über flexible, Nanometer-große Linker verbunden. Die Oligonukleotide sind mit einem Fluorophorpaar versehen, das als Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer (FRET)-Donor und -Akzeptor fungieren kann 2. Die Hybridisierungsenergie der Oligonukleotide ist so gestaltet, dass sie niedrig A B genug ist, um ein signifikantes Annealing der Oligonukleotide zu verhindern, solange die beiden markierten Antiköper in Abwesenheit des Zielproteins gemischt werden. Wenn dagegen die Antiköper an das Targetprotein binden, erhöht dies stark die lokale Konzentration der Signal-Oligonukleo tide, da die Freiheitsgrade für deren Diffusion durch die Bindung stark eingeschränkt werden. Dieser lokale Konzentrationsanstieg führt zum Annealing der Oligonukleotide, wodurch die Fluoro phore sich einander so stark annähern, dass der resultierende Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer als Signal zur Detektion des Zielproteins genutzt werden kann. Die Nanometer-langen Linker geben dabei genügend Raum und gewährleisten eine ausreichende Flexibilität, um den verschiedenen Größen und Formen der Targets Rechnung zu tragen. Kardiales Troponin und das C-reaktive Protein (CRP) wurden als Targets eingesetzt, um das in Abbildung 1A gezeigte Sensor-Design zu validieren. Bei beiden Targets wurden starke FRET-Signale beobachtet, die eine Detektion bis hinab in den picomolaren Konzentrationsbereich ermöglichten (Abb. 1B). Die Sensitivitäten für den Troponin- und CRP-Nachweis wurden auf jeweils rund 40pM beziehungsweise etwa 15 pm abgeschätzt. Die Sensoren waren spezifisch, denn es zeigte sich kein FRET-Signal, als zu den Targets unverwandte Proteine als nichtsspezifische Kontrollen oder wenn Muskel-Troponin als Kontrolle für ähnliche Proteine eingesetzt wurden (nicht gezeigt). Die hohe Spezifität des Sensors scheint durch die für die Signalerzeugung in Anwesenheit des Targets erforderliche Koinzidenz dreier molekularer Ereignisse bedingt (Erkennung des Targetproteins durch beide Antikörper und die Verbindung der komplementären Signal-Oligonukleotide). In Abwesenheit nur einer dieser molekularen Interaktionen, erzeugt der Sensor kein Signal. Um die maximale Assay-Empfindlichkeit zu erzielen, war eine Inkubationszeit von nur 10 bis 15 Minuten nach Mischen der Antikörper mit der Probe erforderlich (nicht gezeigt). Schlussfolgerung Zusammengefasst haben wir neue homogene, Antikörper-basierte Sensoren entwickelt. Der Assay ist extrem einfach durchzuführen, da nur die Zugabe der Probe zum Sensormix erforderlich ist. Dadurch eignet sich der Test gut für Hochdurchsatz-Anwendungen. Der Test ist schnell, erfordert lediglich eine einfache Fluoreszenzauslesung und kann soweit miniaturisiert werden, bis dies durch die technischen Erfordernisse der für den Fluoreszenz-Readout benötigten Geräte limitiert wird. Es werden sehr geringe Mengen markierter Antikörper pro Einzelmessung eingesetzt, da der Sensor niedrige (nanomolare) Antikörperkonzentrationen verwendet, und die Assays können in sehr kleinen Volumina durchgeführt werden. Das Sensor-Design ist dabei nicht spezifisch für irgendein gegebenes Protein und sollte daher für eine Vielzahl von Proteintargets eingesetzt werden können. Diese wünschenswerten Eigenschaften des Assays sollten seine breite Anwendbarkeit in Forschung und medizinischer Diagnose sicherstellen. Literatur [1] Heyduk, E., et al., Anal Chem 80(13): [2] Selvin, P.R., Methods Enzymol, : p Korrespondenzadresse Abb. 1: (A) Design der Antikörper-basierten homogenen Sensoren. (B) Beobachtetes FRET- Signal bei diversen Konzentrationen an kardialem Troponin und CRP. Daten aus [1]. Prof. Dr. Tomasz Heyduk Dept of Biochemistry and Molecular Biology Saint Louis University School of Medicine 1100 S. Grand Blvd.; Saint Louis, MO Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

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6 Blitzlicht Proteomics Sensitive Quantifizierung von Proteinen via gezielter Massenspektrometrie Dr. Vinzenz Lange, Prof. Dr. Ruedi Aebersold Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich In vielen Gebieten der Biologie und Medizin besteht ein großer Bedarf an Verfahren für eine sensitive und zugleich zuverlässige Quantifizierung von Proteinen in großen Probengruppen, dem durch die klassischen massenspektrometrischen Methoden nur ungenügend entsprochen wird. Als Alternative schlagen wir die Verwendung der MRM-Technologie (Multiple Reaction Monitoring) zur gezielten Quantifizierung von Proteinen vor. In einem MRM-Experiment werden zuvor ausgewählte Peptide durch die spezifische Detektion von Peptidfragment-Ionen mit einem Triple-Quadrupole-Massenspektrometer quantifiziert. Die von uns entwickelte Software TIQAM ermöglicht die effiziente Entwicklung und Validierung von MRM-Methoden für eine große Zahl von Proteinen in komplexen Probengemischen. Wir haben TIQAM eingesetzt, um Virulenzfaktoren des Human-Pathogens Streptococcus pyogenes zu quantifizieren und so die spezifischen Anpassungen der Bakterien bei Kontakt mit menschlichem Plasma besser zu charakterisieren 1. Die MRM-Technologie ermöglichte die zuverlässige Quantifizierung von Proteinen, die mit konventionellen LC-MS-Methoden nicht nachweisbar waren. Dies demonstriert das Potential einer gezielten Proteinanalyse mittels MRM für die zuverlässige, hochsensitive Quantifizierung ausgewählter Proteine über viele Proben hinweg. A ausgewählt und fragmentiert. Durch den Vergleich mit Proteindatenbanken kann anhand der so entstandenen Fragment- Ionen-Spektren auf die Peptidsequenz und daher auch auf die in der Probe enthaltenen Proteine zurückgeschlossen werden. Die Signalintensität der Peptid-Ionen in den Massenspektren ermöglicht zudem quantitative Aussagen. Trotz des gewaltigen Potentials für die Identifizierung von Proteinen ist der konventionelle Shotgun Proteomics -Ansatz nur begrenzt geeignet, um eine Gruppe von Proteinen in vielen Proben zu quantifizieren. Dies trifft insbesondere zu, wenn es sich um geringe Mengen von Proteinen in einer komplexen Mischung handelt, da deren Peptid-Ionen nur unzuverlässig für die Fragmentierung selektiert werden. Je geringer die Konzentration eines Proteins im Gemisch ist, umso seltener kann es daher identifiziert und quantifiziert werden. Dies steht im Widerspruch zum Bedarf der klinischen Forschung und der Systembiologie nach zuverlässigen quantitativen Daten über viele Proben hinweg, insbesondere von Proteinen geringerer Konzentration. Daher schlagen wir einen gänzlich neuen Ansatz einer gezielten Proteom-Quantifizierung vor. Aufbauend auf einer umfassenden Charakterisierung des Proteoms werden die Proteine in den zu analysierenden Proben mit hoher Sensitivität nachgewiesen und quantifiziert, ohne dass dafür eine Neuidentifikation durch Fragment- Ionen-Spektren nötig wäre 3,4. Multiple Reaction Monitoring B Abb. 1: (A) MRM-Messung am QQQ-MS. Quadrupol 1: Selektion von Peptid-Ionen. Quadrupol 2: Fragmentierung. Quadrupol 3: Selektion von Fragment-Ionen. (B) Ergebnis der MRM- Quantifizierung von drei Peptiden (blau, rot, grün), zwei Transitionen pro Peptid. Die Proteomforschung zielt darauf ab, alle Proteine eines Systems zu identifizieren, zu charakterisieren und zu quantifizieren. Durch die Entwicklung neuer Technologien vor allem im Bereich der Massenspektrometrie sind wir in den letzten Jahren diesem Ziel sehr viel näher gekommen. Der weitverbreitete Shotgun Proteomics -Ansatz erlaubt heute die routinemäßige Identifizierung von Hunderten Proteinen aus komplexen Gemischen innerhalb weniger Stunden 2. Dafür wird die Mischung der Proteine in der Regel mit Trypsin zu Peptiden verdaut. Das komplexe Peptidgemisch wird mittels HPLC aufgetrennt und das Eluat direkt in das Massenspektrometer (MS) injiziert. Basierend auf den Massenspektren werden die Peptide mit den intensivsten Signalen automatisch Als vorteilhafte Technik für eine solche gezielte Quantifizierung hat sich das Multiple Reaction Monitoring (MRM) erwiesen 5, oft auch Selected Reaction Monitoring (SRM) genannt. In einem Triple Quadrupole -MS (QQQ) wird im ersten Quadrupol ein Peptid- Ion ausgewählt, welches im zweiten Quadrupol durch Gaskollision fragmentiert wird. Im dritten Quadrupol findet die Selektion eines spezifischen Fragments statt, das am Detektor registriert wird. Diese zweistufige Selektion gewährleistet eine hohe Spezifität. Außerdem besticht die MRM-Technologie durch höchste Sensitivität und einen weiten linearen dynamischen Bereich, der die Quantifizierung geringer Proteinmengen in komplexen Mischungen ermöglicht. Voraussetzung für die Quantifizierung einer Substanz durch MRM ist allerdings die genaue Kenntnis des Übergangs ( Transition ) von Peptid-Ion zu Fragment-Ion. Wenn eine Liste geeigneter Transitionen vorliegt, können Peptide höchst sensitiv in einer Probensammlung quantifiziert werden. Dafür summiert das QQQ- MS-Instrument jeweils einige Millisekunden die Ionen einer spezifischen Transition und wechselt dann zur nächsten Transition, bis das Ende der Liste erreicht wurde. So wird alle 6 9. Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

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8 Blitzlicht Proteomics ein bis fünf Sekunden für jede Transition ein Datenpunkt ermittelt, der die Konzentration des Peptids zur gegebenen Zeit widerspiegelt. Die Herausforderung bestand bisher vor allem in der Schwierigkeit Transitionslisten zu erstellen, die eine hochspezifische und sensitive Quantifizierung mittels MRM ermöglichen. TIQAM Targeted Identification for Quantitative Analysis by MRM Daher haben wir die Software TIQAM entwickelt, die den gesamten Prozess der MRM- Methodenentwicklung von der Selektion der Peptide bis zur Validierung und Optimierung von Transitionen unterstützt 1 (http://tools. proteomecenter.org/tiqam/tiqam.html). Nur ein Teil der Peptide, die durch einen tryptischen Verdau entstehen, sind gut im Massenspektrometer nachweisbar. Die Auswahl dieser proteotypischen Peptide (PTP) ist essentiell für einen sensitiven Nachweis des Proteins. Verschiedene Klassifizierungsprogramme wurden veröffentlicht, um die PTPs vorherzusagen 6. Eine noch bessere Auswahl kann anhand vorangegangener Proteomics-Experimente getroffen werden, wie sie beispielsweise in großer Zahl in der frei zugänglichen PeptideAtlas-Datenbank (www.peptideatlas.org) 7 gespeichert sind. Zur Auswahl der PTPs integriert TIQAM Daten sowohl von lokalen Experimenten als auch aus der PeptideAtlas-Datenbank oder von Klassifizierungsprogrammen. Für diese Peptide berechnet TIQAM eine Liste von Transitionen. Der entscheidende Schritt in der MRM-Methodenentwicklung ist die darauffolgende Validierung der errechneten Transitionen. Trotz der hohen Selektivität in der QQQ-Quantifizierung können unspezifische Signale von anderen Peptiden nicht ausgeschlossen werden. Um die Spezifität der Methode zu validieren, können MS/ MS-Spektren aufgenommen werden. Der Vergleich des Fragmentmusters mit der Peptidsequenz ermöglicht die Unterscheidung unspezifischer und spezifischer Signale. TIQAM ermöglicht eine effiziente Validierung, indem es für jedes Peptid sowohl die MRM-Signale und die dazugehörenden MS/ MS-Spektren zusammen mit dem errechneten Fragmentmuster anzeigt. Alle Ergebnisse werden in einer Datenbank gespeichert, so dass die besten validierten Transitionen für die quantitativen Experimente exportiert werden können. Quantifizierung von Virulenzfaktoren aus Streptococcus pyogenes Das Humanpathogen S. pyogenes verursacht jährlich mehr als 600 Millionen Halsentzündungen und über 100 Millionen Hautinfektionen. Mehr als Menschen sterben jedes Jahr in Folge schwerer S. pyogenes-infektionen 8. Eine wichtige Rolle in der Pathogenität verschiedener S. pyogenes-stämme spielen die sogenannten Virulenzfaktoren 9. Für das bessere Verständnis des Krankheitsverlaufes ist insbesondere die Regulation der Virulenzfaktoren im Wechselspiel mit den verschiedenen Milieus des menschlichen Körpers von Interesse. Bei früheren Versuchen, die spezifischen Anpassungen des Pathogens bei Kontakt mit Plasma auf Proteinebene zu analysieren, konnten nur zwei Virulenzfaktoren quantifiziert werden 10. In der Hoffnung, dass die höhere Sensitivität Abb. 2: Durch Kontakt mit Blutplasma wird die Bildung des Proteins Collagenlike surface protein A in S. pyogenes induziert. MRM-Quantifizierung von 10 unabhängigen S. pyogenes- Kulturen nach Inkubation in 0% bis 20% Plasma 1. und der größere dynamische Bereich der MRM-Technologie die Quantifizierung einer größeren Zahl von Proteinen ermöglichen würde, haben wir die Virulenzfaktoren entsprechend der oben skizzierten Strategie gezielt analysiert. Da es bisher keine umfassenden Proteomdaten von S. pyogenes gab, haben wir das Proteom mittels mehrstufiger Peptidtrennung und LC-MS systematisch analysiert. Wir konnten 964 Proteine und damit 57% des erwarteten Proteoms identifizieren. Basierend auf diesen Daten konnten wir Peptide auswählen und mit Hilfe von TIQAM spezifische Transitionen für neun Virulenzfaktoren validieren. Die MRM-Technologie ermöglichte die zuverlässige Quantifizierung dieser Proteine in allen zehn analysierten Proben. Im Gegensatz dazu konnten vier dieser Proteine mit einem konventionellen Shotgun-Ansatz nicht identifiziert werden, drei weitere nur in einem Teil der Proben. Basierend auf diesen Daten konnten drei Virulenzfaktoren identifiziert werden, deren Proteinmenge in Abhängigkeit von der Plasmakonzentration statistisch signifikant ansteigt, während ein weiterer Faktor das gegenteilige Verhalten zeigte. Fazit In verschiedenen Bereichen der Life Sciences, insbesondere jedoch in der Systembiologie und der klinischen Forschung, besteht ein hoher Bedarf an Methoden, die eine sensitive und zuverlässige Quantifizierung von Proteinen über viele Proben hinweg ermöglichen. Durch ihre hervorragenden quantitativen Eigenschaften bietet sich die MRM-Technologie als Ersatz für Antikörper-basierte Methoden an. Zwar kann die MRM-Technologie hinsichtlich ihrer Sensitivität nicht mit empfindlichen ELISA-Methoden konkurrieren, besticht aber dafür durch die Möglichkeit der parallelen Quantifizierung zahlreicher Proteine. Vor allem können neue MRM- Methoden innerhalb von Tagen für viele Proteine ausgearbeitet werden, während die Entwicklung eines ELISA-Nachweises viele Monate in Anspruch nimmt und sehr kostenintensiv ist. Wir haben die Software TIQAM entwickelt, um eine effektive MRM-Methodenentwicklung zu ermöglichen. Mit Hilfe dieser Software konnten wir zuverlässig Streptococcus-Virulenzfaktoren quantifizieren, die unterhalb der Nachweisgrenze eines klassischen LC-MS-Ansatzes lagen. Durch diese hervorragende Sensitivität, in Verbindung mit verlässlicher Quantifizierung großer Probengruppen eröffnet die MRM-Technologie neue Möglichkeiten für die Systembiologie und die klinische Forschung. Literaturhinweise [1] Lange, V., Malmström, J.A., Didion, J., King, N.L., Johansson, B.P., Schäfer, J., Rameseder, J., Wong, C.-H., Deutsch, E.W., Brusniak, M.-Y., Bühlmann, P., Björck, L., Domon, B., Aebersold, R., Mol. Cell. Proteomics (2008), M MCP [2] Aebersold, R., Mann, M., Nature 422 (2003), [3] Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (2005), [4] Malmstrom, J., Lee, H., Aebersold, R., Curr. Opin. Biotechnol. 18 (2007), [5] Stahl-Zeng, J., Lange, V., Ossola, R., Eckhardt, K., Krek, W., Aebersold, R., Domon, B., Mol. Cell. Proteomics 6 (2007), [6] Mallick, P., Schirle, M., Chen, S.S., Flory, M.R., Lee, H., Martin, D., Ranish, J., Raught, B., Schmitt, R., Werner, T., Kuster, B., Aebersold, R., Nat. Biotechnol. 25 (2007), [7] Desiere, F., Deutsch, E.W., King, N.L., Nesvizhskii, A.I., Mallick, P., Eng, J., Chen, S., Eddes, J., Loevenich, S.N., Aebersold, R., Nucleic Acids Res. 34 (2006), D [8] Carapetis, J.R., Steer, A.C., Mulholland, E.K., Weber, M., Lancet Infect. Dis. 5 (2005), [9] Bisno, A.L., Brito, M.O., Collins, C.M., Lancet Infect. Dis. 3 (2003), [10] Johansson, B.P., Levander, F., von Pawel-Rammingen, U., Berggard, T., Bjorck, L., James, P., J. Proteome Res. 4 (2005), Korrespondenzadresse Prof. Dr. Ruedi Aebersold Institut für Molekulare Systembiologie ETH Zürich Wolfgang-Pauli-Str. 16 CH-8093 Zürich Tel.: +41-(0) Fax: +41-(0) Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

9 Blitzlicht Membranfiltration Quantifizierung von a-synucleinaggregaten mit dem PAF-Assay Dr. Michael L. Kramer, Institut für Neuropathologie, Universität Göttingen Wie α-synucleinaggregate die Neurodegeneration bei der Demenz mit Lewykörperchen (DLK) und Parkinson hervorrufen, erschien lange Zeit rätselhaft. Die Anzahl der 5µm bis 25 µm großen und in der Nähe des Zellkernes liegenden Lewykörperchen war viel zu gering, um das beobachtete Ausmaß an Neurodegeneration zu erklären. Durch die Entwicklung eines Protein-Aggregate-Filtrations(PAF)-Assays zum selektiven und sensitiven Nachweis von α-synucleinaggregaten konnten wir erstmals α-synucleinaggregate an den präsynaptischen Terminalen nachweisen. Der PAF-Assay trennt die α-synucleinaggregate von ihren monomeren und oligomeren Isoformen. Die Trennung erfolgt dabei mittels Mikrofiltration durch eine blockierte Nitrozellulosemembran mit Hilfe einer handelsüblichen Slot-Blot-Apparatur. Anschließend wird die Nitrozellulosemembran wie ein Western-Blot entwickelt. Der PAF-Assay löst damit das Problem der inhärenten Unlöslichkeit von α-synucleinaggregaten für Western Blot-, HPLC- und massenspektroskopische Anwendungen, was erstmals quantitative Vergleiche ermöglicht. Dadurch konnten wir nachweisen, dass bei der DLK die absolute Mehrheit der α-synucleinaggregate an den präsynaptischen Terminalen sitzt, was zur synaptischen Dysfunktion führt. Neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer, Demenz mit Lewykörperchen und Parkinson, die durch Ablagerungen von aggregierten Proteinen wie Ab, Tau und α-synuclein hervorgerufen werden, stellen in einer immer älter werdenden Gesellschaft ein wachsendes Problem für die Betroffenen sowie das Gesundheitssystem dar. Denn das Alter ist einer der unvermeidlichen Risikofaktoren dieser Erkrankungen. Daher ist die Kenntnis des genauen Mechanismus der Neurodegeneration, der die klinischen Symptome tatsächlich hervorruft, von entscheidender Bedeutung, um diese Krankheiten effizienter therapieren und deren Fortschreiten zumindest aufhalten zu können. Demenz mit Lewykörperchen One Tube/One-Step PCR Clean-Up Eliminates Spin Columns Conserves PCR Samples Removes Contaminating Primers and dntps Simple Processing No Columns, No Sample Loss Abb. 1: Schematische Darstellung der Detektion von α-synucleinaggregaten mit dem Protein-Aggregate-Filtrations- Assay. Die Standardprozedur für Hirnhomogenate verwendet das Sediment (S) des Zentrifugationsschrittes einschließlich eines DNAse- Verdaus, da der Überstand (ÜS) keine Aggregate enthält. Die gängige Lehrmeinung ist, dass die Ursache für die Demenz oder Bewegungstörungen in dem Absterben der Nervenzellen liegt. Dieses ist historisch begründet, da postmortale, morphologische Untersuchungen der Gehirne eine deutlich erkennbare Atrophie im Bereich des Hippocampus bei Alzheimerpatienten oder eine Depigmentierung der Dopaminproduzierenden grauen Substanz (Substantia nigra) bei Parkinsonspatienten ergab, was nur durch einen Verlust der Nervenzellen zu erklären war. Jedoch ist zu bedenken, dass diese Untersuchungen nur das Endstadium reflektieren und nicht das Stadium, in dem die klinischen Symptome auftreten. Inzwischen wird davon ausgegangen, dass der Beginn der Erkrankungen 10 bis 20 Jahre vor dem Auftreten der ersten klinischen Symptome liegt, die sich erst dann manifestieren, wenn das Gehirn die Ausfälle der betroffenen Hirnbereiche nicht mehr kompensieren kann. Interessanterweise findet Now in Europe USB Europe GmbH Hauptstrasse Staufen Germany T: +49 (0) F: +49 (0) LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

10 Blitzlicht Membranfiltration A B Abb. 2: Quantifizierung von α-synucleinaggregaten mit dem PAF-Assay (A) Eine Hirnhomogenate-Verdünnungsserie eines DLK-Falles und einer Negativkontrolle (KO) wurde mit dem PAF-Assay untersucht. Die aufgetragenen Mengen an Feuchtgewicht Gehirn befinden sich auf der linken Seite. (B) Densitometrische Quantifizierung des PAF-Blots in A unter Verwendung einer logarithmischen Skala für das Feuchtgewicht an Gehirn. Das Ergebnis der linearen Regression ist als Gerade dargestellt. sich im Gegensatz zum Morbus Alzheimer oder Parkinson bei der Demenz mit Lewykörperchen als zweithäufigster Demenz nach Alzheimer kaum ein Absterben von Nervenzellen. Dieses deutete auf einen anderen Mechanismus der Neurodegeneration hin. Die zentrale Fragestellung bei all diesen Erkrankungen ist, wie die Proteinaggregate zur Neurodegeneration führen. Bisher war der Blick durch Methoden, wie die klassische Immunhistochemie oder Western Blot, getrübt, die α-synucleinaggregate weder selektiv noch quantitativ erfassen konnten. So wird die Immunhistochemie sowohl zum Nachweis des an den präsynaptischen Terminalen konzentrierten, nativen α-synucleins als auch zum Nachweis von Lewykörperchen benutzt. Biochemisch wurde versucht, Proteinaggregate mit Methoden wie Western Blot, Massenspektroskopie oder HPLC nachzuweisen oder zu untersuchen. Diese Methoden sind jedoch für die Analyse löslicher Proteine entwickelt worden. Daher müssen die Proteinaggregate zuvor quantitativ aufgelöst werden. Dieses stellt für die Prionen bei BSE und Creutzfeldt- Jakob-Erkrankungen kein Problem dar, da sich Prionproteinaggregate zum Beispiel quantitativ in SDS-Probenpuffer unter Kochen auflösen lassen. Im Gegensatz dazu zeigen andere Proteinaggregate, wie das Ab-Amyloid bei Alzheimer oder die α-synucleinaggregate bei Parkinson und der Demenz mit Lewykörperchen eine inhärente Unlöslichkeit, was gerade quantitative Vergleiche mit den oben genannten Methoden schwierig, wenn nicht unmöglich macht. So ist bei der Analyse von α-synucleinaggregaten mittels Western Blot fast immer ein Schmieren der Immunreaktivität über die gesamte Laufspur zu beobachten und falls auch das Sammelgel gezeigt wird, dass ein Großteil der Immunreaktivität beim Eintritt in das Sammelgel steckenbleibt. Es ist zu befürchten, dass selbst diese sichtbare Immunreaktivität nur einen Teil der partiell in Lösung gebrachten α-synucleinaggregate darstellt. Ein weiteres Problem stellt die Unterscheidung zwischen der nativen und der aggregierten pathologischen Isoform dar. Wenn die klassischen Methoden verwendet werden, die für die Analyse löslicher Proteine gedacht sind, müssen die Aggregate zuvor von der nativen Isoform abgetrennt werden. Daher ist in der Regel zumindest ein Ultrazentrifugationsschritt notwendig, was die Probenvorbereitung sehr aufwendig macht. Wünschenswert wäre daher ein Verfahren, das einerseits das Problem der praktischen Unlöslichkeit der α-synucleinaggregate umgeht und andererseits die Probenvorbereitung möglichst einfach hält. Protein-Aggregate-Filtrations-Assay Mit der Entwicklung des sogenannten Protein- Aggregate-Filtrations(PAF)-Assays konnten diese Probleme gelöst werden. Das Verfahren beruht auf einer Mikrofiltration (Abb. 1) durch eine blockierte Nitrozellulosemembran mit einem Porendurchmesser von 200 nm bis 450 nm, um die α-synucleinaggregate von den monomeren und oligomeren Isoformen (bis zu 24 nm im Durchmesser) abzutrennen. Dabei nutzt der PAF-Assay die praktische Unlöslichkeit der α-synucleinaggregate in Detergenzien wie SDS und SLS aus. Als Probe dienen in der Regel Hirnhomogenate oder Homogenate von Zellkulturen. Diese werden zunächst einer Zentrifugation mit einer gewöhnlichen Tisch-Zentrifuge unterworfen. Anschließend wird das Sediment einem DNAse-Verdau unterzogen, um die viskose DNA aus den Zellkernen abzubauen. Nachdem zu beiden Fraktionen SLS zugegeben wurde, werden die Proben mit Hilfe einer handelsüblichen Slot- oder Dot-Blot-Apparatur durch eine blockierte Nitrozellulosemembran filtriert. Diese Membran kann dann wie ein Western Blot behandelt und die Immunreak- tivität mittels Chemilumineszenz auf einem Film sichtbar gemacht werden. Interessanterweise zeigt sich, dass die Immunoreaktivität aussschließlich im Sediment zu finden ist, wogegen der Überstand, der die monomeren und oligomeren α-synuclein-isoformen enthält, überhaupt kein Signal zeigt (Abb. 1). Quantifizierung Um den α-synucleinaggregate-gehalt verschiedener Proben miteinander vergleichen zu können, ist es erforderlich, die Beziehung zwischen der Menge an Aggregaten und der Signalintensität zu ermitteln. Die densitometrische Auswertung einer Verdünnungsserie eines DLK-Falles (Abb. 2A) zeigt, dass die relative Intensität linear vom Logarithmus des Feuchtgewichts an Gehirnmasse über mehr als zwei Größenordnungen abhängig ist (Abb. 2B). Da das Feuchtgewicht an Gehirnmasse direkt proportional zur Menge an α-synucleinaggregaten (αsa) ist, lässt sich folgende lineare Beziehung mit der Steigung m und dem Achsenabschnitt b ableiten: A B Abb. 3: Subzelluläre Lokalisierung von α-synucleinaggregaten bei DLK. (A) Die Fraktionen eines Saccharosedichtegradienten zur subzellulären Fraktionierung eines DLK-Hirnhomogenates wurden mittels Western Blot auf die synaptosomalen Marker Syntaxin (STX) und Synaptophysin (SPH) untersucht. (B) Screening des Saccharosegradienten auf α-synucleinaggregate mit dem PAF- Assay (unten). Die Auftragung stellt die densitometrischen Quantifizierung von Synaptophysin (grau) und Syntaxin (schwarz) zusammen mit den PAF-Blot-Signalen als relative Menge von α-synucleinaggregaten rαsa (geschlossene Kreise) dar Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

11 Unsere Blitzlicht Leistungen Membranfiltration für Ihren Erfolg (Peak III) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 2 µm co-lokalisiert mit den präsynaptischen Markern. Durch ein weiteres Saccharose-Dichtegradienten- Experiment konnte nachgewiesen werden, dass die α-synucleinaggregate von Peak III tatsächlich in den Synaptosomen gefangen waren und dass der Peak II aus Synaptosomen wahrscheinlich während der Homogenisation freigesetzte α-synucleinaggregate darstellt. Analytik und Entwicklung für unsere Kunden A Abb. 4: Hirnschnitt mit Lewy-Body (Pfeil) RI = m x log [αsa] + b In Ermangelung eines absoluten Standards lässt sich nur der relative α-synucleinaggregategehalt prozentual vergleichen, in dem man die obige Gleichung umformt: rαsa =10 ({RI-b}/m) Aus der Abbildung 2B lässt sich ein Detektionslimit von ca. 10 µg Feuchtgewicht Gehirnmasse extrapolieren, was einem Volumen von 10 nl entspricht. Die Tatsache, dass dieses Volumen von Zellkernen oder Lewykörperchen mit einem Durchmesser von 20 µm ausgefüllt wird, verdeutlicht die außergewöhnliche Sensitivität des PAF-Assays. Subzelluläre Lokalisierung Der Wert neuer Methoden wird meist erst durch ihre Anwendungen sichtbar. In diesem Falle war der PAF-Assay als Screening- Methode zum selektiven und sensitiven Nachweis von α-synuclein-aggregaten, der auch quantitative Vergleiche ermöglicht, unverzichtbar, um zu beweisen, dass die Mehrheit der α-synucleinaggregate im Gegensatz zu den Lewykörperchen an den präsynaptischen Terminalen akkumuliert. Hierzu wurden Hirnhomogenate einer subzellulären Fraktionierung mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation unterworfen, die auch schon zur Aufreinigung von Lewykörperchen oder Synaptosomen verwendet wurde. Der Gradient wurde dann fraktioniert und mit dem PAF-Assay auf α-synucleinaggregate gescreent (Abb. 3B) sowie per Western Blot auf synaptosomale Markerproteine wie Synaptophysin und Syntaxin untersucht (Abb. 3A). Interessanterweise macht die Lewykörperchen-Fraktion (Peak I) maximal 10% der α-synucleinaggregate bei der DLK aus. Die Mehrheit der α-synucleinaggregate Fazit Aufgrund der relativ einfachen Probenvorbereitung sowie der quantitativen Erfassung der α-synucleinaggregate im Sediment nach Zentrifugation mit einer gewöhnlichen Tisch- Zentrifuge, ist der PAF-Assay eine wertvolle Screening-Methode zum selektiven und sensitiven Nachweis von α-synucleinaggregaten in Hirnhomogenaten. Zur genaueren Untersuchung des neurodegenerativen Mechanismus auf molekularer Ebene kann der PAF-Assay ohne Probleme auf entsprechende Zellkulturoder Tiermodelle angewendet werden. Da der PAF-Assay die pathologische Isoform anstelle von Surrogatmarkern nachweist, könnte der Assay möglicherweise zur Frühdiagnose von Parkinson und DLK herangezogen werden. Durch die Entwicklung des PAF-Assays konnten wir völlig neue Erkenntnisse zum Mechanismus der Neurodegeneration bei der Demenz mit Lewykörperchen und wahrscheinlich auch für Parkinson gewinnen. Diese führten zu einem neuen Konzept der Neurodegeneration, in dem die Ansammlung von α-synucleinaggregaten an den präsynaptischen Terminalen zur synaptischen Dysfunktion durch Rückzug der dendritischen Dornenfortsätze (Spines) auf der postsynaptischen Seite führt. Dieses Konzept ebnet den Weg für ganz neue therapeutische Ansatzmöglichkeiten bei DLK und möglicherweise auch bei Parkinson. Literatur [1] Kramer, M. L.; Behrens, C.; Schulz-Schaeffer, W., Selective detection, quantification, and subcellular location of α-synuclein aggregates with a protein aggregate filtration assay. BioTechniques 2008, 44, 403. [2] Kramer, M. L.; Schulz-Schaeffer, W.J, Presynaptic α-synuclein aggregates, not Lewy bodies, cause neurodegeneration in dementia with Lewy bodies. J. Neurosci. 2007, 27, [3] Kramer, M. L. in Signal Transduction in Nervous Cells (ed. Fedorovich S.), Chapter VI, Clogging of synapses cause neurodegeneration in dementia with Lewy bodies, accepted (Research Signpost, Kerala (India)). Korrespondenzadresse Dr. Michael L. Kramer Institut für Neuropathologie Universität Göttingen Analytik von biotechnologischen Arzneimitteln Seit über 20 Jahren bieten wir Analytik-Dienstleistungen an, ausgelegt auf die speziellen Anforderungen unserer Kunden nach höchsten Standards der Qualitätssicherung (GMP/GLP). Methodenentwicklung & -validierung Stabilitätsstudien inklusive Lagerung nach ICH Prüfungen nach Arzneibuch Ausgewählte Methoden der Proteinanalytik: Bioassays und ELISAs N-terminale Sequenzierung und Aminosäureanalyse MALDI-TOF RP-HPLC, SEC, IEC und Peptide Mapping UV-Vis-, Fluoreszenz- IR-Spektroskopie uvm. Entwicklung stabiler Zelllinien Durch die Auswahl geeigneter Expressionssysteme schaffen wir beste Voraussetzungen für einen effizienten Produktionsprozess. Pro- und Eukaryonten Charakterisierung Stabilitätsprüfungen GMP-gemäße Zellbanklagerung BIO P HA R M S G MB H H EI D EL B ER G GLP CERTIFIED Höchste QS-Standards Langjährige regulatorische Erfahrung Lösungen für komplexe Anforderungen I N C Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbh Czernyring 22, D Heidelberg Telefon E LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

12 Blitzlicht Massenspektrometrie Protein-Quantifizierung nach In-Gel-Verdau und itraq -Markierung Dr. Henning Urlaub, Carla Schmidt, Bioanalytische Massenspektrometrie, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen. Dr. Christof Lenz, Applied Biosystems, Darmstadt Ein typischer Arbeitsablauf bei der massenspektrometrischen Proteinquantifizierung durch chemisch stabile Isotopenmarkierung beginnt mit dem enzymatischen Verdau der Proteine in Lösung. Es folgt die chemische Markierung der erzeugten Peptide durch verschiedene isotopenmarkierte Reagenzien (zum Beispiel itraq -114, -115, -116 und -117), das Mischen der Proben sowie die Auftrennung der markierten Peptide und die anschließende Analyse im Massenspektrometer. Gerade bei komplexen Proben ist eine Vortrennung zur Verminderung der Komplexität nötig, um eine möglichst umfassende Quantifizierung zu erreichen. Bei chemisch stabiler Isotopenmarkierung nach In-Lösung-Verdau kann dies zum Beispiel durch mehrdimensionale (2-D-)Flüssigkeitschromatographie erzielt werden. Alternativ dazu wird in der Arbeitsgruppe am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen ein optimierter Arbeitsablauf verwendet, der sich für Proben mittlerer Komplexität (300 bis 400 verschiedene Komponenten) bewährt hat. Die entscheidenden Schritte sind der In-Gel-Verdau nach 1-D-PAGE, die anschließende itraq -Markierung der extrahierten Peptide und die direkte flüssigkeitschromatographische Trennung der markierten Peptide zwecks nachfolgender massenspektrometrischer Analyse. Das Proteom eines Organismus ist ein äußerst dynamisches System. Es verändert sich ständig und passt sich damit den jeweiligen Umwelt- und Entwicklungsbedingungen an. Immer mehr verlagert sich das Interesse der Wissenschaft bei der Proteomforschung von der einfachen Identifizierung von Proteinkomponenten auf die relative und absolute Quantifizierung einzelner Proteine. Mit Hilfe quantitativer Aussagen lassen sich komplexe Zellvorgänge wie Wachstum, Stress oder die Abwehr von Krankheitserregern besser beschreiben. Zur relativen Quantifizierung von Proteinen war noch vor wenigen Jahren die Technik der 2-D-PAGE weitverbreitet. Heute wird vorwiegend eine stabile Isotopenmarkierung mit massenspektrometrischen Analysetechniken eingesetzt, um Proteine mit hoher Sensitivität absolut oder relativ zu quantifizieren. Welche der etablierten Methoden angewandt wird, hängt davon ab, welche biologische Fragestellung zu lösen ist, wie kosten- und zeitintensiv eine Analyse ist und wie das jeweilige Analyselabor ausgestattet ist. Ein optimierter Arbeitsablauf für Proteomanalysen wird in der Arbeitsgruppe Bioanalytische Massenspektrometrie des Max-Planck-Instituts für biophysikalische Chemie in Göttingen zur Quantifizierung von Komponenten makromolekularer Protein- RNA-Komplexe verwendet. Das Verfahren ist für Proteome mittlerer Komplexität aus maximal 300 bis 400 verschiedenen Proteinkomponenten geeignet und besteht aus folgenden Schritten: 1-D-PAGE zur Proteinseparation enzymatischer Protein-Verdau im Gel Extraktion der Peptide aus dem Gel und Multiplex-iTRAQ -Labelling Mischen der entsprechenden Proben (extrahierte und markierte Peptide), Flüssigkeitschromatographie-gekoppelte Tandem-Massenspektrometrie zur Trennung, Detektion, Sequenzierung und Quantifizierung der markierten Peptide. Abb. 1: Workflow des In-Gel-Verdaus und itraq -Labellings. Gel-Bahnen verschiedener Proben wurden mit dem Gelschneider in 23 Proben pro Bahn zerteilt, jeweils weiter zerkleinert und anschließend mit Trypsin hydrolysiert. Extrahierte Peptide wurden in TEAB-Puffer aufgenommen und ein interner Standard hergestellt. Die Proben wurden mit den itraq -Reagenzien markiert und anschließend gemischt. Danach folgte die Quantifizierung durch off-line-flüssigkeitschromatographie und MALDI-MS/MS durch Berechnung der Peakfläche der jeweiligen Reporterionen 114, 115, 116. Mit Hilfe dieses Workflows werden in Göttingen die quantitativen Unterschiede der Proteine des Spleißosoms in verschiedenen funktionellen Stadien untersucht. Das Spleißosom ist eine zelluläre Maschine, die das Herausschneiden nicht kodierender Bereiche (Introns) der unreifen eukaryotischen Boten- RNA (prä-mrna) und das Zusammenschweißen der kodierenden Bereiche (Exons) der prä-mrna zu einer reifen mrna katalysiert (Spleißen) 1. Alternatives Spleißen, also das verschiedenartige Zusammensetzen einer reifen mrna aus mehreren Exons eines Gens, ist eine der Hauptquellen für die hohe Proteinkomplexität in höheren eukaryotischen Organismen. Um zu verstehen, wie dieser komplexe Prozess reguliert wird, ist eine quantitative Analyse der beteiligten Proteinfaktoren während Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

13 Blitzlicht Massenspektrometrie unterschiedlicher funktioneller Stadien des Spleißens erforderlich. 1-D-PAGE und In-Gel-Verdau Optimale Probenvorbereitung und Proteinbeziehungsweise Peptidtrennung sind der Schlüssel zu einer möglichst umfassenden massenspektrometrischen Probenanalyse. Einige Labore hydrolysieren die Proteine in Lösung und trennen anschließend die Peptide chromatographisch vor der massenspektrometrischen Analyse. Andere trennen die Proteine zunächst durch eindimensionale (1-D) oder zweidimensionale (2-D) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) auf und verdauen diese dann im Gel. Die aus dem Gel extrahierten Peptide werden dann flüssigkeitschromatographisch getrennt und sukzessive in das Massenspektrometer eluiert. Der letztere Ansatz hat den Vorteil, dass die Proteine vor dem Verdau nach ihrer Größe (und bei der 2-D-PAGE zusätzlich nach ihrer Ladung) aufgetrennt werden, was die Komplexität deutlich verringert. Der eingesetzte Workflow kombiniert die 1-D-PAGE und chemische Isotopenmarkierung. 5 beziehungsweise 2,5 µg Gesamtprotein eines Protein-RNA-Komplexes wurden in unterschiedlichen Spuren eines Pre-Cast - Fertiggels (Gradientengel, 4%-12%, 8 x 8 cm) aufgetrennt und die Proteine mit kolloidalem Coomassie Blue angefärbt (Abb. 1). Danach folgte die enzymatische In-Gel-Hydrolyse der aufgetrennten Proteine. Um sicherzustellen, dass das gesamte Probenmaterial für die Analyse zur Verfügung steht, wurde eine spezielle Technik eingesetzt: Aus jeder einzelnen Spur des Gels wurden mit einem speziellen Gel-Schneider 23 Gelstücke von exakt der gleichen Größe (3 x 7 mm, Abbildung A B C Abb. 2: Gelschneider 2) präpariert. Danach wurden die Proteine in den einzelnen Gelstücken mit Trypsin in Gegenwart von Triethyl ammoniumbicarbonat (TEAB) als Puffer hydrolysiert und die extrahierten Peptide in 20 µl 100 mm TEAB-Puffer gelöst. Durch Mischen von jeweils 5 µl der extrahierten Peptide eines jeden Geldstückes der einen Spur (5 µg) mit dem gleichen Volumen von extrahierten Peptiden aus dem entsprechenden Gelstück der anderen Spur (2,5 µg) wurde ein interner Standard hergestellt und mit 5 ml TEAB auf 15 µl Gesamtvolumen aufgefüllt. itraq -Markierung Im nächsten Schritt wurden die extrahierten Peptide eines jeden Gelstücks und den jeweiligen internen Standard im nächsten Schritt mit dem 4-plexen itraq -Reagenz markiert. Multiplex Kit 1 : Peptide der einen Probe wurden mit itraq -Reagenz 115, Peptide aus der anderen mit itraq -116 und der interne Standard mit itraq -114 markiert. itraq steht für isobares Tagging zur relativen und absoluten Proteinquantifizierung. Inzwischen ist das itraq -Reagenz auch als 8-plexe Version für die simultane Markierung von acht Proben erhältlich. itraq markiert die N-Termini von Proteinen und Peptiden und lysinhaltige Seitenketten mit vier (beziehungsweise beim 8-plexen Kit mit acht) verschiedenen isobaren Tags von jeweils 144,1 Da. Die Tags unterscheiden sich nicht in ihrer Masse (Isobare), wohl aber in ihrer Ordnungszahl. Deshalb erzeugen die markierten Peptide zunächst im intakten Zustand (im MS-Modus des Massenspektrometers zur Detektion des ionisierten Peptides) nur ein massenspektrometrisches Signal. Werden die isobaren Tags der Peptide im MS/MS- Modus nun fragmentiert, entsteht ein Markerion (114.1, 115.1, 116.1, 117.1), das spezifisch für den jeweiligen itraq -Tag ist. Je nach Menge des markierten Peptides erzeugen die sciflexarrayers are non-contact dispensers for automated Pico, Nano and Microliter sample handling in Life Sciences. sciflexarrayers are a fully scaleable technology that allows to use only a single technology from R&D projects to industrial production. Applications include: DNA Microarrays Protein and Antibody Microarrays Cell Transfection Arrays nano PCR MALDI sample preparation Biosensors Glycan Microarrays Cell based screening Inquire about your ultra-low volume application! LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

14 Blitzlicht Massenspektrometrie Tags Signale unterschiedlicher Stärke, die die massenspektrometrische Quantifizierung der Peptide erlauben (Abb. 1). Die Quantifizierung ist also erst nach der Fragmentierung der markierten Peptide im Massenspektrometer möglich. Gegenüber anderen Techniken des chemischen, enzymatischen oder metabolischen Labellings hat itraq einige Vorteile: Es besteht die Möglichkeit zum Multiplexing. Zusammen mit einem internen Peptidstandard können Peptide auch absolut quantifiziert werden. Die massenspektrometrische Signalintensität ist sowohl im MS- als auch im MS/ MS-Modus höher als bei vergleichbaren Techniken. Wie bei allen anderen Markierungstechniken ist zu beachten, dass die Probenmenge vor der Analyse genau bestimmt wird und sowohl der Verdau als auch das Labelling in korrespondierenden Proben gleichermaßen effizient verlaufen. Nur unter diesen Bedingungen lassen sich zuverlässige Aussagen treffen. LC-MS/MS A B Abb. 3: Quantifizierung verschiedener Spleißosomen-Proteine nach In-Gel- Verdau und itraq -Labelling. MS/ MS-Spektren von itraq markierten Peptiden aus spleißosomalen Proteinen in unterschiedlichen funktionellen Stadien des humanen Spleißens. A. Protein Brr2/200K zeigt ein äquimolares Verhältnis, während Protein Aquarius ein Verhältnis von 1 zu 3 zeigt und damit erst mit einem bestimmten Stadium des prä-mrna- Spleißens mit der entsprechenden zellulären Maschinerie assoziiert ist. Zur Quantifizierung der Isotopen-markierten Peptide kann die Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionisiation (MALDI) und Elektronenspray- Ionisierungs- (ESI-)Massenspektrometrie eingesetzt werden. Beide Verfahren bestimmen das Verhältnis Masse/Ladung eines Proteins/ Peptids (m/z) exakt (MS-Experiment). Sowohl im ESI- als auch im MALDI-Massenspektrometer können darüber hinaus Peptide isoliert und fragmentiert werden, um Sequenzinformationen zu gewinnen. Das Protein wird identifiziert, indem die gemessenen Peptid- und Fragmentmassen mit theoretischen Peptid- und Fragmentmassen aus Proteindatenbanken verglichen werden. Um komplexe Peptidgemische vor der massenspektrometrischen Analyse aufzutrennen und dadurch die Komplexität zu verringern, hat sich in den vergangenen Jahren die Kopplung von Nano-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung organischer Lösungsmittel mit Massenspektrometrie etabliert. Bei der ESI-Massenspektrometrie ist die Chromatographie online gekoppelt, das heißt, die Peptide eluieren direkt in das Massenspektrometer, wo sie ionisiert werden. Dies ist bei der MALDI-Massenspektrometrie nicht möglich. Hier werden die eluierenden Peptide mit der MALDI-Matrix gemischt und alle 15 bis 30 Sekunden mit einem Spotter auf einen MALDI-Probenteller aufgebracht ( LC-offline ). So werden die Peptide eines komplexen Peptidgemisches auf 300 bis 500 (je nach Länge der flüssigkeitschromatographischen Trennung auch mehr) verschiedenen Matrix-Spots verteilt. Die einzelnen Spots können in modernen MALDI-Massenspektrometern vollautomatisch gemessen werden. Bei der Analyse von itraq -markierten Peptiden ist zu beachten, dass das Massenspektrometer insbesondere den unteren m/z-bereich (zwischen 100 und 200 m/z) gut abbildet, da hier die itraq -Markerionen zur Quantifizierung herangezogen werden. Dies ist bei Qq-ToF- und MALDI-Instrumenten der Fall. Ferner gilt, dass möglichst viele MS/ MS-Fragmentspektren eines Peptids aufgenommen und addiert werden, damit das Verhältnis der einzelnen Markerionen konstant ist. Zur quantitativen Analyse von itraq markierten Peptiden wird ein 4800 MALDI-ToF/ ToF TM -Instrument (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies) eingesetzt. Die Auftrennung der Peptide erfolgt direkt nach der eigentlichen Markierungsreaktion durch Off- Line-Flüssigkeitschromatographie, nachdem überschüssiges Reagenz abgetrennt wurde. Ein Beispiel für die Quantifizierung von Peptiden im MALDIToF/ToF-Massenspektrometer nach In-Gel-Verdau ist in Abbildung 3 gezeigt. Abbildung 3a zeigt ein Peptid eines Spleißosomen-Proteins (U5- spezifisches humanes Brr2/200K), dessen Abundanz sich in den unterschiedlichen funktionellen Stadien des Spleißosoms nicht ändert (Verhältnis 1:1), während das humane Protein Aquarius in dem einen funktionellen Stadium des Spleißen deutlich stärker vorhanden ist (Abb. 3B). Fazit itraq -Labelling In-Gel-hydrolysierter Proteine ist ein reproduzierbares Verfahren, mit dem Proben hinsichtlich ihrer Proteinmengen miteinander verglichen, also relativ quantifiziert werden können. Es besitzt den Vorteil, dass die Proteine zunächst nach Größe aufgetrennt und sichtbar gemacht werden. Die Methode funktioniert besonders zuverlässig, wenn Proben mittlerer Komplexität eingesetzt werden. Die Markierung der Peptide erfordert keine zusätzlichen Schritte wie Entsalzen oder chromatographische Auftrennung und kann deshalb direkt an den In-Gel-Verdau angeschlossen werden. Auch die flüssigkeitschromatographische Auftrennung der markierten Peptide ist ohne weitere Schritte direkt vor der Analyse möglich. Die Methode hat sich bei einer Vielzahl unterschiedlicher Protein- (RNA)-Komplexe zur relativen Quantifizierung bewährt. Literatur [1] Will, CL and Lührmann R RNA World III CSH Laboratory Press (2005) [2] Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Mol Cell Proteomics (2004) Korrespondenzadresse Dr. Henning Urlaub Bioanalytische Massenspektrometrie Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Am Fassberg 11, Göttingen Tel.: +49-(0) index.html Dr. Christof Lenz Applied Biosystems Frankfurter Straße 129 b, Darmstadt Tel.: +49-(0) Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

15 Wissenschaft Massenspektrometrie Quantitativer Nachweis von Leberenzymen des Arzneistoff-Abbaus Dr. Anke Schnabel, Dr. Elmar Langenfeld, Gorden Redlich, Prof. Dr. Katrin Marcus Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Prof. Dr. Ulrich Zanger, Dr. Margarete Fischer-Bosch Institut für klinische Pharmakologie, Stuttgart Für eine Vielzahl von Proteinen sind der Nachweis und die Quantifizierung mittels immunologischer Methoden wie ELISA und Western-Blotting aufgrund fehlender spezifischer Antikörper nicht möglich. Das massenspektrometrische Verfahren AQUA (absolute quantification) umgeht die Antikörperproblematik und erlaubt die Bestimmung der Stoffmengen von Proteinen in komplexen Proben. In unserer Gruppe kombinieren wir die 1D-SDS PAGE und Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (rphplc) mit der massenspektrometrischen Messtechnik Multiple Reaction Monitoring (MRM) unter Verwendung eines Triple-Quadrupole-Massenspektrometers, um AQUA-Analysen durchzuführen. Das Ziel der Systembiologie ist es, die dynamischen Abläufe einer Zelle, eines Organs oder eines ganzen Organismus zu verstehen und abzubilden. In einem interdisziplinären Ansatz, der die Biologie mit der Mathematik, den Systemwissenschaften und der Informatik verbindet, sollen physiologische Vorgänge aufgeklärt und in mathematische Modelle übersetzt werden, um so die biologischen Prozesse besser zu verstehen. Im Mittelpunkt des BMBF-Förderschwerpunkts Systembiologie HepatoSys steht die Leber. Das Vorhaben im Netzwerk Detoxifikation ist die systemorientierte Beschreibung des Arzneistoffwechsels in der menschlichen Leberzelle. Dafür ist ein enger Informationsaustausch zwischen experimentell und theoretisch arbeitenden Wissenschaftlern erforderlich. Neben qualitativen Informationen, beispielsweise über die am Abbau eines Arzneistoffs beteiligten Enzyme und die dabei entstehenden Metabolite, werden für die Modellierung und Simulation der Detoxifikation vor allem quantitative Daten des Transkriptoms, des Proteoms und des Metaboloms benötigt. Während sich für die Transkriptomanalyse die Echtzeit-RT-PCR anbietet, stellt die Bestimmung der Konzentrationen und Stoffmengen der Proteine in Zellkompartimenten, Zellen oder Geweben immer noch eine Herausforderung dar. Bei den Biotransformationsreaktionen von Arzneistoffen wird zwischen Phase-I- und Phase-II-Reaktionen unterschieden. In den Phase-I-Reaktionen werden funktionelle Gruppen (z. B. eine Hydroxylgruppe) in das Molekül eingeführt oder freigelegt. Phase-II- Reaktionen sind Konjugationsreaktionen, bei denen polare, negativ geladene endogene Moleküle (z. B. Glukuronsäure) an funktionelle Gruppen des Moleküls gekoppelt werden. Die entstehenden Metabolite sind meist besser wasserlöslich und können über den Urin beziehungsweise die Galle aus dem Körper ausgeschieden werden. Für den oxidativen LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

16 Wissenschaft Massenspektrometrie Eine Methode, um Proteine in einer komplexen Probe mittels Massenspektrometrie absolut zu quantifizieren, ist die AQUA-Analyse 1,2. Dabei werden synthetische, isotopenmarkierte Peptide als interner Standard zur Probe gemischt. Eine effiziente massenspektrometrische Technik für eine AQUA-Analyse ist das Multiple Reaction Monitoring (siehe Hintergrund). Durchführung eines AQUA-Experimentes Abb.1: Die 12 Cytochrom-P450-Enzyme (CYP) des oxidativen Phase-I-Metabolismus mit Relevanz im Arzneistoffabbau. Sie gehören sieben Subfamilien der Genfamilien 1, 2 und 3 an. Laborwelt Hintergrund Multiple Reaction Monitoring (MRM) Ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, mehreren Linsen, vier Quadrupolen (Q0 bis Q3) und einem Detektor. Während Q0 ein Hilfsquadrupol darstellt, der die in der ESI (electrospray ionization)-ionenquelle generierten Peptid ionen fokussiert, dienen Q1 und Q3 als Massenanalysatoren und Q2 als Kollisionszelle zur Fragmentierung der Peptide. Beim Einsatz des Multiple Reaction Monitoring (MRM) für die Proteinquantifizierung wird in Q1 ein Vorläufer-Peptidion mit einem definierten Masse-zu-Ladungs- Phase-I-Metabolismus von Arzneistoffen sind 12 Cytochrom-P450-Enzyme (CYP) von zentraler Bedeutung. Sie gehören sieben Subfamilien der Genfamilien 1, 2 und 3 an (Abb. 1) und weisen innerhalb ihrer Subfamilie hohe Aminosäuresequenzhomologien auf. So sind zum Beispiel die Isoformen der CYP2C- und CYP3A-Subfamilie zu 70 % bzw. 75 % homolog. Nicht alle 12 CYP-Enzyme können mittels immunologischer Verfahren, wie ELISA und Western-Blotting, quantifiziert werden, denn es fehlen zum Teil Isoform-spezifische Antikörper. Massenspektrometrische Analyseverfahren umgehen diese Problematik und erlauben es, zwischen hochhomologen Isoformen zu unterscheiden. Verhältnis (m/z) selektiert. Dieses wird in Q2 durch Kollision mit einem inerten Gas (z.b. N 2 ) fragmentiert. In Q3 wird nur ein bestimmtes Fragmention zur Detektion selektiert. Nur wenn ein Peptidion und dessen Fragmention das jeweils vorgegebene m/z-verhältnis in Q1 bzw. Q3 aufweisen, wird ein Signal am Detektor aufgezeichnet. Auf diese Weise erlaubt das MRM eine sensitive Detektion von Vorläufer- Fragment-Ionen-Übergängen, welche ein spezifisches, diagnostisches Signal für das Vorhandensein eines Peptids darstellen. In einem ersten Arbeitsschritt wird das Zielprotein theoretisch mit einer geeigneten Protease, meist Trypsin, verdaut. Trypsin spaltet Aminosäureketten C-terminal von Lysin und Arginin, und es kann eine Vorhersage über die entstehenden Peptide (in-silico-peptide) getroffen werden. Mit den in-silico-peptiden wird anschließend ein Datenbankabgleich durchgeführt, um die Spezifität der Peptide für das Zielprotein sicherzustellen. Nicht alle Peptide sind für eine MS-Analyse geeignet, da chemische Eigenschaften der Peptide, wie die Aminosäurezusammensetzung, Peptidlänge und Hydrophobizität, einen Einfluss auf das Verhalten bei der Auftrennung in der rphplc und bei der Ionisierung in der Ionenquelle des Massenspektrometers haben. Das führt dazu, dass Peptide desselben Proteins mit verschiedenen Häufigkeiten detektiert werden. Durchschnittlich machen drei Peptide eines Proteins 95% aller Beobachtungen dieses Proteins aus. So genannte proteotypische Peptide stellen diagnostisch wertvolle Peptide dar, da sie experimentell nachweisbar sind und ein spezifisches Protein oder eine Proteinisoform eindeutig identifizieren 3. Im zweiten, analytischen Arbeitsschritt (Abb. 2A) erfolgt der Nachweis der ausgewählten Peptide einer komplexen Probe mittels rphplc-esi-ms/ms im MRM-Modus. Dazu wird die biologische Probe zuvor per 1D-SDS PAGE aufgetrennt, das erhaltene Gel wird Coomassie-gefärbt und die Gelbande ausgeschnitten, die das Zielprotein enthält. Dies reduziert die Komplexität der Probe. Nach dem Verdau werden die entstandenen Peptide mittels rphplc getrennt und online in das Massenspektrometer geleitet. Hierbei werden proteotypische Peptide des Zielproteins im MRM detektiert und ihre Identität mittels MS/MS sichergestellt. Die MS/MS- Analyse, bei der Fragmentionenspektren der Peptide generiert werden, dient ebenfalls dazu, die intensivsten Fragmentionen der Peptide zu finden. MRM-Übergänge müssen unter dem Aspekt optimaler Selektivität und Empfindlichkeit gewählt werden. An welcher Stelle im Peptid die Fragmentierung erfolgt, hängt von den Sequenzeigenschaften des Peptids ab. Beispielsweise wird N-terminal zu Prolin oder Histidin, oder C-terminal zu Asparaginsäure eine sehr intensive Fragmentierung Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

17 Wissenschaft Massenspektrometrie beobachtet. Diese dominanten Fragmentionen werden bei der Auswahl der MRM-Übergänge berücksichtigt. Das erhaltene MRM-Signal ist sehr intensiv und eignet sich daher für eine quantitative Auswertung besonders gut. Von den proteotypischen Peptiden werden anschließend Standardpeptide synthetisiert, in die eine schwere, isotopenmarkierte Aminosäure eingebaut wird. Für die absolute Quantifizierung des Zielproteins in einer komplexen Probe (Abb.2B) wird eine definierte Menge des Standardpeptids der Proteinprobe zugesetzt, diese Probe proteolytisch gespalten und mittels rphplc getrennt. Die Detektion erfolgt anschießend durch MRM. Die absolute Quantifizierung des Proteins sollte mindestens durch zwei spezifische Peptide erfolgen. Für die Berechnung der absoluten Proteinmenge werden die jeweiligen Flächen unter der MRM-Intensität/Zeit-Kurve im MRM-Chromatogramm des nativen Peptids und des Standardpeptids verglichen. Quantifizierung von CYP2D6 in humaner Leber Die AQUA-Methode wurde erfolgreich für die absolute Quantifizierung von Cytochrom- P450-Enzymen in humaner Leber etabliert und angewendet. Die Validierung der Methode soll hier am Beispiel von CYP2D6 dargestellt werden. Die CYP2D6-Ausprägung zeigt in der Bevölkerung große interindividuelle Unterschiede. Diese zeigen sich in der Metabolisierungsrate seiner Substrate (z.b. Psychopharmaka, Antiarrhythmika, β-blocker u.a.): so gibt es langsame, mittlere, schnelle ( normale") und ultraschnelle Metabolisierer. Dieser Polymorphismus ist genetisch bedingt. Mutationen verändern teils die katalytischen Eigenschaften, hauptsächlich aber die gebildete Menge des Enzyms. 5% bis 10% der A B Abb. 2: Arbeitsablauf der AQUA-Analyse. (A) Auswahl der Standardpeptide für die Quantifizierung des Zielproteins. (B) Absolute Quantifizierung eines Proteins in komplexer Probe. europäischen Bevölkerung trägt zwei nichtfunktionelle Allele ( poor metaboliser ) hier wird CYP2D6 gar nicht exprimiert. Leberproben solcher Personen stellen eine analytfreie Probenmatrix dar und können daher für einen Wiederfindungsversuch verwendet werden. Dazu wurden Mikrosomenfraktionen dieser Lebern mit definierten Mengen an aufgereinigtem, rekombinantem CYP2D6 versetzt und die Konzentrationen mit der AQUA-Methode bestimmt. Bei diesem Versuch wurde im Bereich von 0 bis 1000 fmol CYP2D6 eine Wiederfindungsrate zwischen 91% und 114% bestimmt (Abb. 3). Zusätzlich wurden Vergleichsmessungen mit der AQUA-Methode und einem quantitativen Western-Blot durchgeführt. Dazu standen ein guter Antikörper 4 sowie das aufgereinigte, rekombinante CYP2D6-Protein für eine Kalibrierkurve zur Verfügung. Der Gehalt von CYP2D6 wurde in 26 ausgewählten Leberproben mit beiden Messmethoden bestimmt. Die starke Korrelation der Western-Blot- Daten bestätigen die quantitativen Daten der AQUA-Analyse (Abb. 4). Weiterhin beweist die schmale Weite des 95%-Konfidenzintervalls der AQUA-Daten eine gute Wiederholbarkeit der Ergebnisse und Präzision der Messmethode. Fazit Abb. 4: Konzentrationen von CYP2D6 in 26 Leberproben. Korrelation von AQUA-Daten (zwei bis sechs Replikate; 95%-Konfidenzintervall) und Western-Blot-Daten (Duplikate; Standardabweichung). (Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman rs=0,93). Literatur [1] Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W., Gygi, S.P., Proc Natl Acad Sci U S A 100 (2003), [2] Barnidge, D.R., Dratz, E.A., Martin, T., Bonilla, L.E., Moran, L.B., Lindall, A., Anal Chem. 75 (2003), [3] Küster, B., Schirle, M., Mallick, P. and Aebersold, R., Nat Rev Mol Cell Biol 6 (2005), [4] Zanger, U.M., Fischer, J., Raimundo, S., Stüven, T., Evert, B.O., Schwab, M., Eichelbaum, M., Pharmacogenetics 11 (2001), Abb. 3: Wiederfindung von rekombinantem CYP2D6 in Lebermikrosomen mit der Messmethode AQUA. Die Fehlerbalken repräsentieren die Grenzen des 95%-Konfidenzintervalls. Der Fehler der eingesetzten CYP2D6-Menge wurde mit ±5% angenommen (Aminosäureanalyse). Für systembiologische Forschungsansätze ist die Entwicklung von Methoden erforderlich, mit deren Hilfe ein komplexes biologisches Netzwerk quantitativ erfasst werden kann. Die hier vorgestellte AQUA-Strategie ermöglicht die Bestimmung von Absolutzahlen von Proteinmolekülen in komplexen Proben. Darüber hinaus erlaubt es diese Messmethode, mehrere Proteine in einem einzigen Probenlauf simultan zu quantifizieren und reduziert damit den Zeitaufwand und Bedarf an Probenmaterial. Korrespondenzadresse Prof. Dr. Katrin Marcus Funktionelle Proteomik Medizinisches Proteom-Center, MA4/59a Ruhr-Universität Bochum Universitätsstr. 150, Bochum Tel.: +49-(0) Fax: +49-(0) LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

18 Blitzlicht Glykoanalytik Nachweis pathogener Glykanstrukturen mittels Staudinger-Ligation Dr. Udo Sticher, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen Unter den mehr als 100 bekannten Arten posttranslationaler Modifikationen ist die Glykosylierung die am weitesten verbreitete. Zudem sind Veränderungen des Zuckeranteils mit einer Vielzahl von Krankheitsbildern assoziiert 1, zum Beispiel die Sialinsäure-Expression auf Zelloberflächen- Glykoproteinen und die Modifikation intrazellulärer Proteine durch O-gebundenes b-n-acetylglucosamin (O-GlcNAc). Deshalb wird der Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Glykosylierungen wachsende Bedeutung zuteil. Von den Sialinsäuren auf der Zelloberfläche ist bekannt, dass sie eine Vielzahl zellulärer Interaktionen beeinflussen, wie die Zellentwicklung, Differenzierung und Tumorprogression. Zudem wurde gezeigt, dass eine erhöhte Sialyltransferase-Aktivität und die daraus resultierende Hypersialysierung mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko von Primärtumoren assoziiert ist. Die O-GlcNAc-Modifikation nimmt Einfluss auf die Transkription, Translation und bestimmte Signalwege. Zudem liefern diverse Studien Anhaltspunkte für eine Beteiligung der O-GlcNAc-Modifikationen an der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen und Diabetes 2. Dieser Beitrag beleuchtet die Anreicherungsmöglichkeiten von Glykoproteinen unter Einsatz der Staudinger-Ligation, mit der sich der Einbau und die Präsentation sowohl von Sialinsäure- und O-GlcNAc-Modifikationen untersuchen lassen. Abb 1: Metabolic Oligosaccharid Engineering zur Detektion Azid-markierter Kohlenhydrate Die Staudinger-Ligation ist eine Reaktion einer funktionellen Azidgruppe mit einem Phosphinderivat unter Ausbildung einer Amidbindung. Durch den Einbau Azid-modifizierter Mannose, einem Vorläufer der Sialinsäure, sowie von Azid-modifiziertem N-Acetyl-Glucosamin, können in der Zellkultur modifizierte Glykoproteine erzeugt werden. FLAG-Phosphin, das aufgrund seiner immunchemischen Vielseitigkeit verwendet wird, dient zur Markierung der Azid-modifizierten Glykoproteine. In Kombination mit Immunpräzipitation und LC-MS/MS wurde diese Technik eingesetzt, um Sialinsäure und O-GlcNAc-modifizierte Glykoproteine zu identifizieren. Glykane und Pathogenese Die Beziehung zwischen zellulärer Glykosylierung und menschlichen Krankheitsbildern steht seit vielen Jahren im Fokus intensiver Studien 1. Trotz eines hohen wissenschaftlichen Einsatzes schreitet die molekulare Aufklärung der Glykanfunktion und -struktur aber nur sehr langsam voran. Ein Grund dafür ist der Mangel an geeigneten analytischen Techniken. Gleichwohl gelang einigen Arbeitsgruppen der Nachweis, dass das Auftreten von Sialinsäuren auf Zelloberflächenproteinen sowie die O-GlcNAc-Modifikation intrazellulärer Proteine mit der Ausbildung bestimmter Krankheitsbilder in Zusammenhang stehen 1. Exprimieren Tumorzellen hochverzweigte, stark sialylierte Strukturen, so kann dies Einfluss auf das Wachstum von Tumoren 3 sowie die Entwicklung und Lebensfähigkeit von Organismen nehmen 4. Neue Forschungsergebnisse beleuchten zudem die kritische Rolle der O-GlcNAc-Modifikationen bei Diabetes und der Alzheimer-Krankheit 2. Ein Werkzeug, mit dem sich die differentielle Expression von Sialinsäuren auf Zelloberflächen und die interne O-Glykosylierung von Proteinen untersuchen und nachverfolgen ließe, wäre daher von hohem Nutzen für alle Wissenschaftler, die die Beziehung zwischen der Glykanexpression und Krankheitszuständen untersuchen. Metabolic Oligosaccharide Engineering Als Methode der Wahl, um Glykanstrukturen durch den Einbau von in der Natur nicht vorkommender Monosaccharide zu modulieren, hat sich das Metabolic Oligosaccharide Engineering (Abb. 1) erwiesen. Durch den Einsatz der unnatürlichen chemischen Reporter findet das Prinzip der Bioorthogonalität Anwendung. Je nachdem, welche Glykanstrukturen analysiert werden sollen, können verschiedene Azido- Zucker (N-Azidoacetylglukosamin (Ac4GlcNAz), N-Azidoacetylgalaktosamin (Ac4GalNAz) oder N-Azidoacetylmannosamin (Ac4Man- NAz) eingesetzt werden. Die Acetyl-Gruppen erhöhen die Permeabilität der Zellmembran und ermöglichen es den Azido-Zuckern, die Zellmembran zu passieren. Innerhalb der Zelle werden die Acetyl-Gruppen dann durch Carboxyesterasen von den Monosacchariden entfernt und die Zuckerketten nachfolgend von Glykosyltransferasen eingebaut. Dabei wird N-α- Azidoacetylmannosamin (Ac4GlcNAz) zur N-α- Azido-Sialinsäure (NeuNAz) verstoffwechselt, die in Zelloberflächen-Glykoproteine eingebaut wird. N-α-Azido-Acetylglukosamin (Ac4GlcNAz) wird in intrazelluläre Glykoproteine eingebaut. Wir haben das so modifizierte Glykoprotein anschließend mit einem FLAG-Phosphin-Derivat markiert. Dabei reagiert der Phosphinanteil mit der Azido-Gruppe in einer Staudinger-Ligation 5 unter Ausbildung einer stabilen Amid-Bindung. Die Bildung der Azid-Phosphin-Bindung wird energetisch bevorzugt, da es in Zellen oder Geweben keine vergleichbar reaktiven funktionellen Gruppen gibt. Die Reaktion läuft bei neutralem ph zwischen 7,0 und 7,4 in wässriger Umgebung ab und hat keine toxischen Effekte auf die Zellen. Das gebundene FLAG- Peptid-Epitop kann anschließend mit Hilfe eines FLAG-spezifischen Antikörpers detektiert Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

19 A B Abb. 2: (A) Western Blot von Proteinen, die ManNAz enthalten. (B) Dot Blot der Immunpräzipitation von ManNAz enthaltendem Protein (1 und 2) und Kontrolle (3). Der Blot zeigt die Beladung (a), nach Antikörper-Inkubation (b), die ungebundene Fraktion (c), Waschen (d-g) und das Eluat (h). werden. Durch den Einsatz dieser Technik in Kombination mit der Immunpräzipitation und LC-MS/MS konnten so die sialylierten und O-GlcNAc-modifizierten Glykoproteine identifiziert werden. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Artikel, der den Einsatz der modifizierten Staudinger-Ligation zur Anreicherung modifizierter Glykokonjugate beschreibt, die wir als neue und wertvolle Methode für die Analyse von Glykoproteinen vorschlagen möchten. Materialien & Methoden Wenn nicht anders angegeben, stammen alle Materialien von Sigma-Aldrich Ac4ManNAz und Ac4GlcNAz (Kat.-Nr. A7605 und A7355) FLAG-Phoshine (Kat.-Nr. GPHOS1) Cell Dissoziation Solution (Kat.-Nr. C5914) RIPA Buffer (Kat.-Nr. R0278) Monoclonal ANTI-FLAG BioM2 antibody produced in mouse (Kat.-Nr. F9291) Streptavidin-Agarose (Kat.-Nr. S1638) Tris-Buffered Saline with 3% nonfat milk (Kat.-Nr. T8793) Tris-Buffered Saline, with Tween 20, ph 8.0 (Kat.-Nr. T9039) Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase (HRP) antibody produced in mouse (Kat.-Nr. A8592) Chemiluminescent Peroxidase Substrate-3 (Kat.-Nr. CPS3) Einbau unnatürlicher Azido-Zucker nur Ethanol enthielt. Nach dem Abdampfen des Ethanols wurde jede Flasche mit 2,0 x 10 6 HeLa-Zellen befüllt. Die Ac4ManNAz-Flaschen wurden für drei Tage, die Ac4GlcNAz-Flaschen für 24 Stunden bei 37 C in einem CO 2 -Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung der Zelldissoziierungs-Lösung geerntet. Die Kontrollprobe wurde mit 0,2 ml FLAG-Phosphin (250 µm, gelöst in PBS) inkubiert, die gepoolte Ac4ManNAz-Probe mit 1,8 ml FLAG- Phosphin-Lösung (250 mm), beide über Nacht bei 2 C-8 C unter ständiger Rotation. Nach dieser Einbauphase wurden die Ac4ManNAz-Zellen mit PBS gewaschen und mit RIPA-Puffer lysiert. Die Ac4GlcNAz-Zellen wurden in PBS, versetzt mit Proteaseinhibitoren, mittels Ultraschall auf Eis lysiert. Nach der Lyse wurden auch diese Zellen mit FLAG-Phosphin-Lösung über Nacht bei 2-8 C inkubiert. Immunpräzipitation FLAG-markierter Glykoproteine Das Zelllysat mit den FLAG-markierten Zelloberflächen-Glykoproteinen wurde denaturiert, reduziert und alkyliert und anschließend über Nacht mit dem ANTI-FLAG BioM2-Konjugat (300 µg) inkubiert. Dieser Ansatz wurde dann wiederum mit Streptavidin-Agarose zur Reinigung des Glykoprotein-Biotin-Konjugates inkubiert. Nach mehreren Waschschritten mit PBS und Wasser wurde das Protein mit 0,1 M Essigsäure, ph 2,0, eluiert. Um die Effizienz der Immunpräzipitation zu bestimmen, wurde eine Dot Blot-Analyse (Abb. 2B) durchgeführt. Das gereinigte Protein wurde tryptisch verdaut, und die Glykoproteine wurden vor der MS-Analyse mittels PNGase F deglykosyliert. Für den Dot Blot wurden die Proben auf Nitrocellulose gespottet (1µL/Square). Sowohl der Dot Blot als auch der Western Blot wurden mit monoklonaler ANTI-FLAG-M2-Peroxidase versetzt und mit CPS3 visualisiert. MS-Analyse der angereicherten Glykoproteine Das LC/MS/MS-System zur Ac4ManNAz-Analyse bestand aus einem Agilent 1100 LC-System, das an ein Thermo LTQ-Massenspektometer mit Elektrospray-Interface (ESI) im positiven Ionenmodus, Elektrospray-Nadel-Spannung 4,5 kv gekoppelt war. Die chromatographische Trennung wurde wie folgt durchgeführt: Säule: 2,1 mm x 150 mm (Supelco Discovery HS C18, 5 mm), Flussrate: 100 µl/min, mobile Phase: (A) 0,1% Ameisensäure in Wasser und (B) 0,1% Ameisensäure in Acetonitril. Die RP-Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0% auf 15% B für 5 Minuten eluiert, gefolgt von 15 auf 60% B für 50 Minuten bei einer Flussrate von 100 µl/min. Die Ac4GlcNAz-Probe wurde mittels eines LCQ Ion Trap-Massenspektrometers analysiert, das mit einem Magic 2002 (Michrom BioResources) LC-System und einem Elektrospray- Blitzlicht Glykoanalytik Turning ideas into value. BIOTECHNICA Flagship Event for the European Biotech Industry now cooperating with the science conference EUROPEAN BIOPERSPECTIVES. BioScience meets BioBusiness meets BioPolitics: your platform of choice for developing new business leads, forging strategic alliances and driving knowledge transfer. Hannover Germany 7 9 October 2008 Hannover Germany 7 9 October 2008 Ac4ManNAz und Ac4GlcNAz (600µL) wurden Four Columns for Your Success in Ethanol gelöst und in T75-Zellkulturflaschen überführt. Als Kontrolle diente eine Flasche, die International Trade Fair, Conferences, Partnering and Award for Biotechnology LABORWELT 9. Jahrgang Nr. 4/

20 Blitzlicht Glykoanalytik BIOCOM Verlag GmbH Tab: 1: Liste der identifizierten Proteine aus Ac4ManNAz-modifizierten Zellen Protein Protein from Ribosomal L29e family (1) Protein from Ribosomal L29e family (2) 60S ribosomal Protein L13 Interface (Proxeon) gekoppelt war. Die Reverse Phase-HPLC wurde mit einer Kapillarsäule (75 µm ID) gepackt mit Vydac C18 durchgeführt. Zusammensetzung Laufmittel A: 5% Acetonitril, 0,1% Essigsäure und 0,005% HFBA (Heptafluorbuttersäureanhydrid), Zusammensetzung Laufmittel B: 95% Acetonitril, 0,1% Essigsäure und 0,005% HFBA. Flussrate 200nL/min, Dauer des Gradienten 35 Minuten durchgeführt. Die Kapillarspannung betrug 28,5 V. Resultate und Diskussion Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen deutlich die Vorteile und Möglichkeiten, die der Einbau von Azido-Zuckern in Kombination mit der optimierten Immunpräzipitation für die Analyse von Glykanstrukturen bietet. Nach Inkubation mit Ac4ManNAz konnten die NeuAz-enthaltenden Proteine einfach mittels eines Western Blots visualisiert werden (Abb. 2A). Die Immunpräzipitation zeigte hervorragende Ergebnisse. Dieses optimierte Verfahren berücksichtigt den möglichen Einfluss sterischer Behinderungen durch die Denaturierung des Proteins und die Verwendung einer Kombination von löslichem ANTI-FLAG BioM2-Konjugat und Strepavidinbeschichteten Agarose-Beads, um das markierte Protein abzufangen. Das kombinierte ANTI- FLAG BioM2/Streptavidin-System ermöglicht die bevorzugte Elution (bei niedrigem ph) von FLAG-markierten Glykoproteinen, während das M2-Biotin am Trägermaterial verbleibt. Der Verlauf dieser optimierten Immunpräzipitation kann schnell und einfach durch einen Dot Blot visualisiert werden. Das Protein wurde nur in der Beladung und dem Eluat visualisiert, was die Effektivität der Immunpräzipitation mit dem FLAG-System belegt. Eigenschaft similar to 60S ribosomal protein L29 Ion Transport Protein Protein from serpin family Tab. 2: Liste der identifizierten Proteine aus Ac4GlcNAz-modifizierten Zellen ** bekannte O-GlcNAz-Proteine Protein Eigenschaft Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase** Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor Subunit 1 Heat Shock Cognate 71 kda protein Heat shock 70 kda Protein 6 78 kda Glucose-regulated Protein Rho-associated Proteinkinase 2 Ryanodine Rezeptor 3 Alpha-Enolase Aspartat Aminotransferase, Alpha-Actin-2** mitochondrial Elongation Factor 1-alpha 1** Probable G-Protein coupled Receptor 133 Fructosamine-3-Kinase Protein FAM9B Transcription Initiation Factor TFIID Contactin-associated Protein-like kda subunit Die erfolgreiche Anreicherung ermöglicht im Anschluß die Analyse und Identifizierung der Proteine mittels Massenspektrometrie. Unter Einsatz dieser Technik wurden verschiedene Proteine sowohl in den Ac4ManNAz- (Tab. 1) wie auch den Ac4GlcNAz-Proben (Tab. 2) nachgewiesen. Die Ac4GlcNAz-Identifizierung war sehr erfolgreich, mit nur einem Protein, das in der Negativkontrolle gefunden werden konnte. Von einigen der identifizierten Proteine ist bekannt, dass sie O-GlcNA-acetyliert sind, während andere erstmalig identifiziert wurden. Zusammengefasst wurde durch Einsatz von Azido-Zuckern in Kombination mit einer modifizierten Staudinger-Ligation eine spezifische FLAG-Immunpräzipitations-Technik entwickelt, die die nachfolgende LC-MS/MS-Analyse von Glykoproteinen und die die Identifizierung bislang unbekannter, O-GlcNAc-modifizierter Proteine ermöglicht. Literatur [1] Brockhausen, I., Schutzbach, J., Kuhns, W., ACTA ANATO- MICA 161 (1998), [2] Dias, W.B., Hart, G.W. Mol Biosyst 3 (2007), [3] Fukuda, M., Cancer Res 56 (1996), [4] Varki, A., Glycobiology 3 (1993), [5] Prescher, J.A., Dube, D.H., Bertozzi, C.R., Nature 430 (2004), Korrespondenzadresse Dr. Udo Sticher Sigma-Aldrich Chemie GmbH Eschenstr. 5, Taufkirchen Tel./Fax: +49-(0) / Jahrgang Nr. 4/2008 LABORWELT

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