Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat

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1 Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat 1. Einleitung Escherichia coli ist in der Lage Glukose und Acetat als Substrat zu verwerten. In diesem Versuch wird das Wachstum unter aeroben Bedingungen auf Glucose und Acetat untersucht. Ziel ist die Aufstellung zweier Wachstumskurven, durch die die exponentielle Wachstumsrate (µ) und die Verdopplungszeit (t d )bestimmt werden können. Die exponentielle Wachstumsrate ist ein Maß für die Geschwindigkeit des Zellwachstums während der exponentiellen Wachstumsphase. Sie errechnet sich aus den zu den Zeiten t 0 und t gemessenen Bakteriendichten x 0 und x t. Die Verdopplungszeit gibt die Zeit für die Verdopplung der Zellmasse an und kann über µ berechnet werden. Für das Aufstellen der Wachstumskurven wird die Zellzahl über die optische Dichte (OD) bestimmt. Die optische Dichte nimmt bis zu einem bestimmten Wert proportional zur Zellzahl zu. Ab einem Wert von 0,5 beginnen sich die Bakterienzellen wegen ihrer Größe gegenseitig zu beschatten und eine genaue Bestimmung der Zellzahl ist nicht mehr möglich. Durch geeignete Verdünnung der Proben kann die Zellzahl jedoch wieder bestimmt werden. Die optische Dichte wird alle 30 Minuten (Zellen, die mit Glucose wachsen) bzw. alle 60 Minuten (Zellen, die mit Acetat wachsen) ermittelt, bis sie einen konstanten Wert annimmt (stationäre Phase). Bei der Verwertung von Glucose und Acetat werden teilweise unterschiedliche Stoffwechselwege genutzt, die maßgeblich für die Teilungsrate der Bakterien sind. Die Glukose wird über die Glykolyse zu Pyruvat abgebaut, das durch die Bildung von AcetylCoA in den Citratzyklus überführt wird und dort vollständig zu Kohlenstoffdioxid oxidiert wird. Die Reduktionsäquivalente werden in die Atmungskette eingeschleust und ein Protonengradient aufgebaut. Durch Abbau des Protonengradienten kann ATP gebildet werden (Energiestoffwechsel). Intermediärprodukte für den Baustoffwechsel können direkt aus der Glykolyse und dem Citratzyklus entnommen werden. Die Synthese von Oxalacetat (OA) aus Phosphoenolpyruvat (PEP) wird von der PEP-Carboxylase katalysiert und dient als anaplerotische Reaktion zum Auffüllen des Citratzykluses. Seite 1 von 14

2 Acetat wird dagegen durch den Glyoxylatzyklus und den Citratzyklus abgebaut. Die Reduktionsäquivalente werden in der Atmungskette zur Bildung von ATP verwendet. Im Glyoxylatzyklus werden zwei Acetat verbraucht, die über Acetyl-Coenzym A (AcetylCoA) eingeschleust werden. Die Bildung von Acetyl-Coenzym A aus Acetat kann direkt durch die Fettsäure-CoA-Synthetase unter Verbrauch von ATP oder durch die Bildung des Zwischenprodukte Acetylphosphat, wobei ein ATP verbraucht wird, erfolgen. Das AcetylCoA reagiert mit Oxalacetat (OA) zu Citrat und weiter zu Isocitrat. Dieses wird durch die Isocitratlyase in Succinat und Glyoxylat gespalten: Isocitratlyase Isocitat + NAD Succinat + Glyoxylat + NADH+H + Unter Verwendung eines weiteren AcetylCoA reagiert das Glyoxylat zu Malat: Glyoxylat + AcetylCoA Malatsynthase Malat Der Glyoxylatzyklus sorgt dafür, dass die notwendigen Verbindungen für den Citratzyklus und für die Gluconeogenese zur Verfügung stehen. Die Bildung von Reduktionsäquivalenten im Citratzyklus ist somit gewährleistet. Diese werden in die Atmungskette eingeschleust und sind für die Bildung eines Protonengradienten verantwortlich. Durch den Abbau des entstandenen Protonengradienten wird ATP gebildet (ATP-Synthase). Um die Intermediärprodukte für den Baustoffwechsel bilden zu können, die bei Wachstum mit Glucose durch die Glykolyse entstehen, muss OA durch die PEP- Carboxykinase zuerst zu PEP umgewandelt werden, um dann in die Gluconeogenese eingehen zu können. PEP-Carboxykinase Oxalacetat + ATP Phosphoenolpyruvat + CO 2 + ADP Des Weiteren wird nach dem Aufstellen einer Eichgerade die Konzentration von Glucose im Medium photometrisch bestimmt. Der Nachweis erfolgt indirekt über oxidiertes 2,2 -Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat (ABTS), dessen Extinktion bei 436nm gemessen wird. Die bestimmte Menge an ABTS ist der Menge an Glucose Seite 2 von 14

3 gleich zu setzten. Dem Versuch liegen zwei Reaktionen zugrunde, die durch die Enzyme Glucoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD) katalysiert werden. GOD Glucose + O 2 + H 2 O Glukonat + H 2 O 2 H 2 O 2 + ABTS red POD ABTS ox + 2 H 2 O Durch die Bestimmung der Glucosekonzentration kann der Extinktionskoeffizient (ε) von dem oxidierten ABTS über das Lambert-Beersche-Gesetz ermittelt werden. Zusätzlich kann die von 1 Mol Glucose gebildete Zellmasse und damit der molare Ertragskoeffizient (Y Gly ) berechnet werden. 2. Material und Methoden Vorkulturen des E. coli-stamms AN387 wurden auf Glucose bzw. Acetat gezüchtet. In zwei Erlenmeyerkolben werden je 15ml M9-Medium + Substrat (Acetat bzw. Glucose; Endkonzentration 3mM) pipettiert und die Medien mit dem entsprechenden Zellen beimpft. Zur Messung der optischen Dichte (OD) wird in regelmäßigen Abständen je 1ml Zellsuspension abgenommen und bei 578nm gegen Luft gemessen. Davon wird der Blindwert (Medium ohne Zellen) abgezogen. Anhand dieser Werte wird eine Wachstumskurve aufgestellt, aus der die Generationszeit, die Verdopplungszeit und die Wachstumsrate berechnet werden. Material: M9-Medium: 50 ml M9-Medium : ml/l M9 (10 x)-salzlösung: Na2HPO4 60 g/l KH2PO4 30 g/l NH4Cl 10 g/l NaCl 5 g/l - 10 ml/l CaCl2 (10 mm) - 1 ml/l MgSO4 (1 M) - 10 ml/l Säurehydrolysiertes Casein (10 %), mit H2O auffüllen. Nach Zusatz aller Lösungen mischen (schwenken)! Seite 3 von 14

4 C-Quelle: - D-Glucose (0.1 M) - Na-Acetat, ph 7 (0.1 M) Zuchtansätze (für jeweils 1 Gruppe): In 2 vorbereitete sterile Erlenmeyerkolben folgende Lösungen pipettieren: A) 15 ml Medium + Glucose (Endkonz. 3 mm) B) 15 ml Medium + Na-Acetat (Endkonz. 3 mm) Die Glucosebestimmung einer unbekannten Probe sowie der Anfangs- und Endkonzentration der Zucht erfolgt durch den direkten Vergleich mit der Standardlösung (500µM). Zusätzlich wird eine Eichgerade (0µM (Blindwert) bis 500µM Glucose) erstellt, mit der die Funktion des Testsystems überprüft wird. Für alle Proben werden Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Ermittlung der Glucosekonzentration erfolgt indirekt nach den in der Einleitung beschriebenen Reaktionen. Die Proben werden wie unten beschrieben zusammen pipettiert und bei 37 C für 30 Minuten im Wasserbad inkubiert (b) Durchführung) Aus den Ergebnissen der Messungen kann der molare Extinktionskoeffizient von ABTS berechnet werden (Lambert.Beersche-Gesetz). Mit dem ermittelten Glucoseverbrauch kann zusätzlich der molare Ertragskoffizient für Glucose bestimmt werden (Y Gly = g Trockenzellen / mol verbrauchter Glucose). Material: a) Lösungen NaPi-Puffer: 700 mg Na2HPO4 x 2 H2O 360 mg NaH2PO4 x H2O auf 50 ml mit H2O auffüllen (davon 500 µl für GOD abzweigen) Glucoseoxidase (für 50 Tests, haltbar bei 4 C) 400 U GOD (aus Schimmelpilz, Grad II) in 500 µl Natrium- Phosphat-Puffer lösen. Lösung ist für 2-3 Tage bei 4 C stabil. Seite 4 von 14

5 Glucosereagenz (für 50 Proben, haltbar bei 4 C) 50 ml NaPi -Puffer 200 U POD (aus Meerrettich, Grad II) 25 mg ABTS, Diammoniumsalz, zugeben. 5 Tr. Chloroform zusetzen. Glucosestandard 100 mg Glucose x H2O in 1 l H2O lösen, bei -20 C aufbewahren. b) Durchführung: (in Eppendorf-Cups) 1 ml Glucosereagenz 50 µl Probe (max. 30 nmol Glucose) 10 µl GOD, mischen Die ausführliche Versuchsbeschreibung ist im Skript zu finden! 3. Ergebnisse 3.1. Wachstum mit Glucose Tab. 1: Ermittlung der optischen Dichte bei Wachstum mit Glucose Blindwert (BW; nur Medium): OD (578nm) = 0,041 0,041 Minuten OD 578 (unverdünnt - BW) 0,159 0,216 0,38 0,576 0,759 0,885 0,919 1,003 1,092 OD 578 (verdünnt - BW) 0,309 0,199 0,219 0,223 0,245 0,268 Verdünnungsfaktor OD 578 (Endwert) 0,2 0,257 0,421 0,618 0,995 1,095 1,115 1,225 1,34 Bei der Berechnung der OD-Endwerte sind nur die rot markierten Messwerte eingegangen. Die unverdünnten Messwerte ab 90 Minuten können für die Ermittlung der OD nicht berücksichtig werden, da sich ab einer OD von 0,5 die Bakterien gegenseitig beschatten. Die OD-Werte zeigen, dass die Zellmasse stetig zugenommen hat und das Wachstum zwischen 30 und 120 Minuten am stärksten ist. Die verdünnten und Seite 5 von 14

6 unverdünnten OD-Werte werden gegen die Zeit in Minuten aufgetragen (siehe Abb. 1). Somit erhält man eine typische Wachstumskurve, die anfangs (0 bis 30 Minuten) eine lag-phase besitzt, dann von Minuten ein exponentielles Wachstum aufweist und schließlich ab 120 Minuten in eine statische Phase übergeht. Eine Absterbe-Phase ist hier allerdings nicht zu erkennen. Dagegen nimmt die Zellzahl ab 180 Minuten nochmals zu. Zudem ist ein großer Unterschied zwischen der verdünnten und unverdünnten Wachstumskurve zu erkennen. Die Werte bei 0, 30 und 60 Minuten sind jedoch identisch, da dort die Proben noch nicht verdünnt wurden. Wachstum mit Glucose 1,6 1,4 1,2 OD ,8 0,6 0,4 0, Zeit in min Wachstumskurve unverdünnt Wachtumskurve verdünnt Abb. 1: Wachstumskurve mit Glucose (linear) Die exponentielle Phase lässt sich besser aufzeigen, wenn die Darstellung der Wachstumskurven halb-logarithmisch erfolgt (siehe Abb. 2). Jedoch zeigt sich auch hier, dass die exponentielle Phase zwischen 30 und 120 Minuten liegt. Aus dem nun theoretisch linearen Bereich können die Wachstumskonstante (µ) und die Verdopplungszeit (t d ) berechnet werden. Auch hier zeigt sich, ähnlich wie bei der linearen Auftragung, dass sich die Wachstumskurven unterscheiden. Seite 6 von 14

7 Wachstum mit Glucose (halb-logarithmisch) ln OD578 0,5 0-0,5-1 -1,5-2 -2, Zeit in Minuten Wachstumskurve unverdünnt (halb-logarithmisch) Wachstumskurve verdünnt (halb-logarithmisch) Exponentieller Bereich Abb. 2: Wachstumskurve mit Glucose (halb-logarithmisch) Berechnung der Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit (t d ) beim Wachstum auf Glucose: µ = (ln x t ln x 0 ) / (t t 0 ) µ = (ln 0,995 ln 0,257) / (90min) = 0,015min -1 t d = ln 2 / µ = 0,693 / 0,015min -1 = 46,2min 3.2. Wachstum mit Acetat Tab. 2: Ermittlung der optischen Dichte bei Wachstum mit Acetat Blindwert (BW; nur Medium): OD (578nm) = 0,041 Minuten OD 578 (unverdünnt - BW) 0,261 0,358 0,47 0,658 0,841 OD 578 (verdünnt - BW) 0,243 0,171 0,207 Verdünnungsfaktor OD 578 (Endwert) 0,261 0,358 0,486 0,855 1,035 Seite 7 von 14

8 Bei der Berechnung der OD-Endwerte sind nur die rot markierten Messwerte eingegangen. Die unverdünnten Messwerte ab 120 Minuten können für die Ermittlung der OD nicht berücksichtigt werden, da sich ab einer OD von 0,5 die Bakterien gegenseitig beschatten und die Messwerte ungenau werden. Beim Wachstum auf Acetat nimmt die Zellmasse bei jeder Messung zu. Die OD steigt zwischen den Messungen bei 60 bis 180 Minuten an. Die Auftragung der OD-Werte gegen die Zeit in Minuten zeigt, dass die Kurve keine eindeutige lag-phase aufweist (siehe Abb. 3). Wiederum unterscheiden sich die Kurven bei den letzten 3 Messungen außerordentlich. Wachstum mit Acetat 1,2 1 OD578 0,8 0,6 0,4 0, Zeit in Minuten Wachstumskurve verdünnt Wachstumskurve unverdünnt Abb. 3: Wachstumskurve mit Acetat (linear) Auch eine halb-logarithmische Auftragung zeigt keine eindeutige lag-phase. Die exponentielle Phase liegt zwischen 60 und 180 Minuten. Das Wachstum nimmt ab 180 Minuten wieder ab (stationäre Phase). Anhand des theoretisch - linearen Bereichs können die Wachstumskonstante (µ) und die Verdopplungszeit (t d ) berechnet werden. Seite 8 von 14

9 Wachstum mit Acetat (halb-logarithmisch) ln OD578 0,5 0-0,5-1 -1, Zeit in Minuten Wachstumskurve unverdünnt (halb-logarithmisch) Wachstumskurve verdünnt (halb-logarithmisch) Exponentieller Bereich Abb. 4: Wachstumskurve mit Acetat (halb-logarithmisch) Berechnung der Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit beim Wachstum mit Acetat: µ = (ln x t ln x 0 ) / (t t 0 ) µ = (ln 0,855 ln 0,358) / (120min) = 0,00725 min -1 t d = ln 2 / µ = 0,693 / 0,00725min -1 = 95,6 min 3.3. Bestimmung der Glucosekonzentration Tab. 3: Wertetabelle der Glucose-Eichgerade [µm Glucose] 0 (=BW) E 436 (1) 0,11 0,214 0,454 0,605 0,764 0,958 E 436 (2) 0,111 0,21 0,455 0,611 0,788 0,947 Mittelwert (MW) 0,1105 0,212 0,4545 0,608 0,776 0,9525 MW - BW 0 0,101 0,344 0,4975 0,6655 0,842 Seite 9 von 14

10 Glucose-Eichgerade y = 0,0017x R 2 = 0,9915 0,9 0,8 Extinktion bei 436nm 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Glucosekonzentration in µm Messwerte Linear (Messwerte) Abb. 5: Glucose-Eichgerade Die Eichgerade der Glucosekonzentration wurde mit Glucosekonzentrationen von 0 bis 500µM aufgestellt. Die Eichgerade dient hier nicht zur Ermittlung der Glucosekonzentration des Versuchsansatzes, sondern erstens zum Nachweis, dass das Testverfahren funktioniert und zweitens der Ermittlung des Extinktionskoeffizienten von 2,2 -Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat (ABTS) über das Lambert-Beersche-Gesetz. Die dazu notwendigen Werte sind in Tabelle 4 angegeben. Tab. 4: Wertetabelle zur Aufstellung der Eichgeraden und Ermittlung von ε von ABTS ox [µm Glucose] MW E 436 (1) 0,11 0,214 0,454 0,605 0,764 0,958 E 436 (2) 0,111 0,21 0,455 0,611 0,788 0,947 Mittelwert (MW) 0,1105 0,212 0,4545 0,608 0,776 0,9525 MW - BW 0 0,101 0,344 0,4975 0,6655 0,842 Verdünnungsfaktor 21,2 21,2 21,2 21,2 21,2 21,2 Produkt aus (MW-BW)*VF 0 2,1412 7, ,547 14, ,8504 Extinktionskoeffizient von ABTS in l / µmol x cm 0 0,021 0,036 0,035 0,035 0,036 0,033 Seite 10 von 14

11 Beispielrechnung bei einer Konzentration von 200µM Glucose: E = Extinktion d = Schichtdicke der Küvette = 1 cm c = Konzentration [µmol / l] Lambert-Beersche-Gesetz: E = ε * d * c ε = E / c * d Verdünnungsfaktor = 1060/50 = 21,2 Unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors: ε = (0,344 * 21,2) / (200µmol/l * 1cm) = 0,036 l/(µmol*cm) = 36 l/(mmol *cm) Tab. 5: Wertetabelle mit E 436nm -Messwerten und berechneter Glucosekonzentration in mm Ende der Anfang der Zucht Unbekante Probe Zucht Verdünnung unverdünnt 0,049 unverdünnt 1:10 1:20 BW 500µM E 436 (1) x 0,448 0,095 1,516 0,934 0,193 0,896 E 436 (2) x 0,505 0,082 1,589 0,884 0,125 0,891 MW x 0,477 0,0885 1,553 0,909 0,159 0,894 MW - BW x 0,318-0,0705 1,394 0,750 0,000 0,735 Glucosegehalt der Probelösung (mit Berücksichtigung der Verdünnung) [mm] x 2, ,486 10,211 0,000 0,500 Die in Tabelle 5 errechneten Glucosekonzentrationen wurden nicht anhand der Eichgeraden berechnet. Die Exktinktion des Glucosestandards wurde bei der Messung bei436nm bestimmt und die restlichen Werte über den Dreisatz berechnet. Es fällt auf, dass sich die Konzentrationen der unbekannten Lösungen unterscheiden, obwohl die verschiedenen Verdünnungsfaktoren eingerechnet wurden. Die Glucosekonzentration am Anfang des Versuchs ist zusätzlich ermittelt worden (2,161mM). Sie unterscheidet sich von der Konzentration, die eigentlich eingesetzt wurde (3mM). Aus den in Tabelle 5 angegebenen und berechneten Werte kann außerdem die Zellmasse berechnet werden, die von einem Mol Glucose und theoretisch von einem Mol Acetat gebildet wird (Y Glucose, Y Acetat ). Seite 11 von 14

12 Man geht davon aus, dass bei einem OD-Wert von 1 300mg Trockengewicht pro einem Liter Kulturvolumen vorhanden ist und kann somit das Trockengewicht des im Versuch vorhandenen Kulturmediums berechnen, um dann anhand des Trockengewichts den molaren Ertragskoeffizienten (Y) zu berechnen. Glucose: 300mg Trockenmasse / 1 Liter Kulturmedium bei einem OD-Wert von 1. OD Ende OD Anfang = OD 1,34 0,2 = 1,14 1 OD = 300mg/l 1,14 OD = x Trockenmasse = 300 * 1,14 = 342 mg / l Y Glucose = Trockenzelle in g / mol Glucose Y Glucose = 0,342 g / 0, mol = 158,26 g / mol Acetat: 300mg Trockenmasse / 1 Liter Kulturmedium bei einem OD-Wert von 1. OD Ende OD Anfang = OD 1,035 0,261 = 0,774 1 OD = 300mg/l 0,774 OD = x Trockenmasse = 300 * 0,774 = 232,2 mg / l Y Acetat = Trockenmasse in g / mol Acetat Y Acetat = 0, 2322/ 0,003 mol = 77,4 g/mol 4. Diskussion Betrachtet man die OD-Werte, die daraus resultierenden Werte der Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit (t d ), sowie den molaren Ertragskoeffizienten (Y) von E.coli-Zellen, die mit Glucose bzw. Acetat als Substrat gewachsen sind, so kommt man zu der Schlussfolgerung, dass Glucose für E.coli Seite 12 von 14

13 das Substrat ist, das für das schnelle Wachstum günstiger zu sein scheint. Die Verdopplungszeit beim Wachstum mit Glucose liegt bei 46,2 Minuten, während die Verdopplungszeit bei Acetat bei 95,6 Minuten liegt und somit über doppelt so groß ist. Daraus resultiert auch die größere Wachstumskonstante von 0,015min -1 der mit Glucose gewachsenen Zellen gegenüber 0,0075min -1 der mit Acetat gewachsenen Zellen. Für die Berechnung der aus den Wachstumskurven resultierenden Werte wurden die verdünnten Messwerte der OD-Messung benutzt, um den Fehler der gegenseitigen Beschattung der Zellen ausschließen zu können. Die Wachstumskurve der E. coli-zellen, die mit Acetat gewachsen sind, weist im Gegensatz zu der Wachstumskurve der E. coli-zellen, die mit Glucose gewachsen sind, eine eindeutigere Einteilung in die typischen Phasen des Bakteriumwachstums einer statischen Kultur auf. Eine häufigere Messung wäre zumindest angemessen gewesen, um die lag-phase von der exponentiellen Phase bei den auf Acetat wachsenden E. coli-zellen unterscheiden zu können. Zusätzlich wäre eine längere Betrachtung des Wachstums sinnvoll gewesen, um das Erreichen der stationären Phase genauer dokumentieren zu können. Bei der Wachstumskurve mit Glucose fällt ab 180min eine weitere Zunahme der Zellmasse auf, obwohl die Kultur eigentlich schon in der stationären Phasen zu sein schien. Dieses doppelte Wachstum, dass man auch als Diauxie bezeichnet, wird durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Substraten bedingt. Zuerst wird die Glucose komplett verstoffwechselt. Danach bilden die Zellen neue Enzyme um ein zweites Substrat verwenden zu können. In vorliegenden Fall wurden wahrscheinlich Aminosäuren in den Stoffwechsel einbezogen. Dadurch kommt das zweite Wachstum zustande. Auch der molare Ertragskoeffizient der Glucose (158,26g/l) ist mehr als doppelt so groß wie der molare Ertragskoeffizient des Acetats (77,4g/l). Die Ergebnisse unterscheiden sich nicht von der theoretischen Annahme, dass Acetat für E. coli das schlechtere Substrat darstellt. Bei der Verwertung von Acetat ist das Wachstum nicht durch die geringere Ausbeute an ATP begrenzt, da das Substrat hier in Überschuss vorliegt. Grund für das langsamere Wachstum sind die Auffüllreaktionen (anaplerotische Reaktionen) der Gluconeogenese und des Glyoxylatzykluses. Bei der Ermittlung der Glucosekonzentration der unbekannten Probe unterscheiden sich die Konzentrationen der 1:10 und 1:20 Verdünnungen trotz Einberechnung der Seite 13 von 14

14 Verdünnungsfaktoren. Man kann davon ausgehen, dass die ermittelte Konzentration der 1:20 Verdünnung genauer ist als die der 1:10 Verdünnung, da die gemessenen Extinktionswerte näher im Bereich der Eichgerade liegen bzw. näher an der gemessenen Extinktion der 500µM Standardglucoselösung. Die ermittelte Anfangskonzentration der Glucoselösung von 2,161µM unterscheidet sich von der theoretisch eingesetzten Konzentration von 3mM. Der Fehler kann durch Pipettierfehler oder durch die Verwendung von Glaspipetten erklärt werden. 5. Literatur Schlegel Allgemeine Mikrobiologie, 7. überarbeitete Auflage, Thieme Verlag, 1992 Skript Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a Seite 14 von 14