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1 Dr. Tobias Schafmeier, BZH

2 Einführungsversuche A: Genauigkeit und Präzision des Pipettierens mit Kolbenhubpipette B: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten von Methylenblau Absorptionsspektrum von NADH/NAD + C: Herstellung eines Puffers mit gegebenem ph-wert Ermittlung der Pufferkapazität

3 A: Pipettieren

4 Pipettieren mit Kolbenhubpipetten Genauigkeit und Präzision: ht präzise Präzise, aber nicht präzise, abergenau nicht genau Präzise, aber nicht genau Genau und präzise Genau und präzise präzise & genau Genau, aber nicht genau, aberpräzise nicht präzise Präzise

5 Pipettieren mit Kolbenhubpipetten Geeignete Pipetten für geeignete Volumina verwenden! Verdünnungen: 1:2 bedeutet 1 Teil konzentrierte Lösung plus 1 Teil Wasser! 1:10 bedeutet 1 Teil konzentrierte Lösung plus 9 Teile Wasser! Verdünnungen um einen Faktor 100 immer in mehreren Schritten!

6 B: Photometrie

7 Grundlagen: Elektromagnetische Wellen

8 Elektromagnetische Wellen: Licht

9 Licht, Wellenlänge und Farbe

10 Farbsehen

11 Farbsehen normal (Trichromat) Rotschwäche (Trichromat) Rotblindheit (Dichromat) Farbenblindheit (Monochromat)

12 Farbsehen normal Rotblindheit Farbenblindheit

13 Aufbau eines Photometers: Photometrie

14 Photometrie Küvetten: mikro halbmikro makro

15 Küvetten: Photometrie

16 Photometrie: Molarer Extinktionskoeffizient DEFINITION: der molare Extinktionskoeffizient (ε mol ) ist eine Stoffkonstante und definiert als die Extinktion einer 1 molaren Lösung der absorbierenden Substanz bei einer Schichtdicke von 1 cm und einer definierten Wellenlänge und Temperatur. ε mol von NADH in Abhängigkeit von der Wellenlänge

17 Photometrie: Das Gesetz von Lambert und Beer (Δ)E = ε mol x c x d Das Gesetz von Lambert und Beer beschreibt die durch eine chemische Verbindung bedingte Lichtabsorption beim Durchqueren der Küvette: Dabei bedeuten: (Δ)E: die im Photometer gemessene Extinktion, bzw. die Extinktionsdifferenz ( = lg des Quotienten aus einfallender und ausfallender Lichtintensität) ε mol : der molare Extinktionskoeffizient in l x mol -1 x cm -1 c: die Konzentration der chemischen Verbindung in mol/l d: die Schichtdicke der Küvette in cm Bei bekanntem molaren Extinktionskoeffizienten und bekannter Schichtdicke kann somit aus der gemessenen Extinktion durch Umformung der Formel die Konzentration einer chemischen Verbindung berechnet werden.

18 Photometrie: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten von Methylenblau Chemie Redoxindikator Medizin Antidot bei Kohlenmonoxid-, Nitrit- und Anilinvergiftungen (beschleunigt Abbau von Methämoglobin) Antiseptikum Bekämpfung von Malaria Antirheumatikum Diagnosezwecke Molekularbiologie Färben von DNA und RNA in Gelen und auf Membranen

19 Photometrie: Absorptionsspektrum von NADH/NAD+ Absorptionsspektrum = Veränderung der Absorption einer Substanz über einen bestimmten Wellenlängenbereich Charakteristisches zweites Absorptionsmaximum von NADH bei 340 nm:

20 Photometrie: Absorptionsspektrum von NADH/NAD + Nicotinamid Phosphat Adenin Ribose B A D C > Absorbiert Licht mit λ = 340 nm > Absorbiert Licht mit λ = 260 nm

21 Photometrie: Absorptionsspektrum von NADH/NAD + Das entstandene Dihydropyridin-Ringsystem besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum von 340 nm, die bei NAD+ fehlt.

22 Photometrie: Absorptionsspektrum von NADH/NAD + Reaktion der Lactat-Dehydrogenase (LDH): Reaktionen, bei denen NADH oder NAD + entsteht, können im Labor für einen Enzymatisch-Optischen Test (EOT) benutzt werden.

23 C: ph/puffer

24 Säuren und Basen Definition nach Brönsted (1923): Säuren: Protonendonatoren Basen: Protonenakzeptoren Nach Abgabe eines Protons geht die Säure in ihre konjugierte Base über und umgekehrt: S B - + H + (Protolytsystem)

25 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert ph-wert: 2H 2 O <=> H 3 O + + OH - [H 3 O + ] x [OH - ] / [H 2 O] 2 = K (MWG) [H 3 O + ] x [OH - ] = K x [H 2 O] 2 ([H 2 O] 2 näherungsweise konstant) [H 3 O + ] x [OH - ] = K W = 1 x mol 2 /l 2 (Ionenprodukt von H 2 0) [H 3 O + ] = [OH - ] = 1 x 10-7 mol/l (bei 25 C) In neutralen Lösungen sind die Konzentrationen von H 3 O + (Oxonium-, Hydroniumionen) und OH - (Hydroxidionen) gleich groß (10-7 mol/l). In sauren Lösungen überwiegt die H 3 O + - Konzentration; in alkalischen die von OH -. Das Produkt der Konzentrationen ist jedoch konstant. Kennt man daher eine Konzentration, so ergibt sich die andere aus der obigen Beziehung. Zur Charakterisierung von verdünnten wässrigen Lösungen hat man die H 3 O + -Konzentration gewählt und verwendet als Maßzahl dafür den negativen Exponenten ihrer Zehnerpotenz. Diese dimensionslose Zahl bezeichnet man als ph-wert (potentia Hydrogenii): ph = - log [H 3 O + ] In sauren Lösungen sind die ph-werte kleiner als 7, in alkalischen liegt der ph-wert über 7. Bei ph = 7 ist eine Lösung neutral

26 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert ph-wert:

27 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert ph-wert:

28 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert

29 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Puffer: Definition: wässrige Systeme deren ph-wert sich bei Zugabe von geringen Mengen an Säuren/Basen nur unwesentlich verändert bestehen aus schwacher Säure (Base) und deren konjugierter Base (Säure) Biol. Bedeutung: Enzyme besitzen ein ph-optimum, außerhalb dessen sie unzureichend funktionieren ph z.b. in Blut muss konstant gehalten werden. Lösung: biologische Puffersysteme (CO 2 /Bicarbonat, Hb, Plasmaproteine) Beispiele aus dem Laboralltag: Tris, Phosphat, HEPES, MOPS, Acetat

30 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Puffer (Beispiele): HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)

31 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Pufferkapazität: Definition: die Menge starker Base (oder Säure), die durch eine Pufferlösung ohne wesentliche Änderung des ph aufgenommen werden kann. Sie gibt an, wie viele H 3 O + bzw. OH - - Ionen in einen Liter der Lösung zugegeben werden müssen, um deren ph-wert um eine Einheit abzusenken bzw. zu erhöhen. Die Einheit der Pufferkapazität ist mol/l. Die Pufferkapazität ist abhängig von den in der Lösung vorliegenden Mengen an schwacher Säure oder Base: In einer basischen Lösung kann nur so lange H 3 O + abgepuffert werden, so lange die schwache Base vorliegt und umgekehrt. Als Faustregel kann man sagen, dass ein Puffer erschöpft ist, sobald das Verhältnis der Säure/Base Konzentration den Wert 1 zu 10 (bzw. 10 zu 1) überschreitet. Der ph-wert eines Puffers kann daher um +/-1 schwanken, bevor er erschöpft ist.

32 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Titration: Der pk s -Wert (K s : Dissoziationskonstante) beschreibt den ph, bei dem Säure und konjugierte Base in der gleichen Konzentration vorliegen (Konstante für jedes Puffersystem) Die Pufferkapazität ist am höchsten bei ph = pk s ± 1

33 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Titration: Titrationskurve von 10 ml 0,1M Essigsäure mit 0,1 M NaOH Äquivalenzpunkt (ÄP): Wendepunkt der Titrationskurve, gleiche Stoffmenge von Säure und Base Neutralpunkt: ph = 7; entspricht ÄP bei Titration starker Säuren mit starken Basen

34 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Die Henderson-Hasselbalch-Gleichung: Massenwirkungsgesetz für die Dissoziation von Essigsäure umformen logarithmieren Allgemein:

35 Messung des ph-werts Indikatoren (z.b. Lackmuspapier; Farbumschlag bei bestimmten ph-werten) Vorteile: Schnell und einfach durchführber, keine Besondere Ausstattung von Nöten Nachteile: relativ ungenau, Indikatoren sind ph-wert spezifisch

36 Messung des ph-werts Indikatoren (z.b. Lackmuspapier; Farbumschlag bei bestimmten ph-werten)

37 Messung des ph-werts Indikatoren (z.b. Lackmuspapier; Farbumschlag bei bestimmten ph-werten) Vorteile: Schnell und einfach durchführber, keine Besondere Ausstattung von Nöten Nachteile: relativ ungenau, Indikatoren sind ph-wert spezifisch elektrochemisch (z.b. ph-meter) Vorteile: ermöglicht genaue Messung des ph bei erfolgter Kalibrierung des Geräts Nachteile: bei vorhandener Ausstattung keine, benötigt allerdings Vorbereitung

38 Herstellung eines Puffers mit gegebenen ph-wert Das ph-meter: Prinzip (Bsp. Glaselektrode): Gemessen wird das elektrochemische Potential zwischen einer bekannten (innen) und einer unbekannten Flüssigkeit (außen). Nur die kleinen H 3 O + Ionen können in nennenswertem Maße mit der Glasmembran interagieren, d.h. es wird im Grunde nur deren Potential gemessen. Eine Bezugselektrode ist über ein Diaphragma mit der zu messenden Lösung verbunden. Aus der Potenzialdifferenz zur Bezugselektrode entsteht eine Spannung, die weitgehend linear den ph-wert abbildet (Nernst-Gleichung).

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