Erzeugung biochemischer Mangelmutanten von Escherichia coli mit Hilfe von Hydrazin und Hydrazinderivaten

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1 ERZEUGUNG BIOCEMISCER MANGELMUTANTEN VON ESCERICIA COLI 151 Erzeugung biochemischer Mangelmutanten von Escherichia coli mit ilfe von ydrazin und ydrazinderivaten Von F. L in g e n s Aus der Biochemischen Abteilung des Chemischen Institutes der Universität Tübingen (Z. Naturforschg. 19 b, [1964] ; eingegangen am 9. August 1963) Bei der Einwirkung von ydrazin und ydrazinderivaten auf E. coli-zellen werden biochemische Mangelmutanten erhalten. Als ergiebigste Methode erwies sich die Induktion mit ilfe des unsubstituierten ydrazins mit anschließender dreistündiger Penicillinselektion. Biochemische Mangelmutanten von Mikroorganismen sind besonders geeignete Objekte zur Untersuchung biologischer Syntheseketten1. Mutanten können u. a. durch Einwirkung von Strahlen und von chemischen Agentien induziert werden1_5. Im folgenden wird über die mutagene W irkung von y drazin und ydrazinderivaten auf E. coli-zellen berichtet. Gibt man zu einer Suspension von E. coli-zellen in Puffer von pn 8,0 ydrazinsulfat, so beobachtet man eine Inaktivierung bezüglich der Fähigkeit der Zellen zu Kolonienbildung. Das Ausmaß der A b tötung kann durch Ausplatten der behandelten Zel- Einwirkung Überlebende [Stdn.] [%] 1 16,6 2 5,95 3 2,03 4 0,94 5 0, ,16 7 0,09 8 0,03 Abb. 1. Inaktivierung mit ydrazin (0,2-m. Lösung). len auf Komplettmedium und Bestimmung der Kolonienzahl im Vergleich mit dem Zelltiter der unbehandelten Zellsuspension bestimmt werden (Abb. 1). W ird der Inaktivierungsvorgang zu dem Zeitpunkt, an dem 99,9% der Zellen inaktiviert sind, durch Verdünnen unterbrochen, so läßt sich durch Ausplatten der Restpopulation auf Komplettagar, Bebrüten und anschließender Anwendung der L e d e r b e r g - Stempeltechnik6 zeigen, daß biochemische Mangelmutanten entstanden sind. Die Isolierung von M u tanten nach diesem Verfahren ist ziemlich mühsam, da nur ein geringer Teil der Restpopulation aus Mutanten besteht. Die Mutationsrate beträgt ca. 1 Prozent. In weiteren Versuchen kam deshalb die Penicillin-Anreicherungsmethode nach L e d e r b e r g und Z i n d e r 7 und D a v i s 8 zur Anwendung, bei der das Gemisch von Wildstammzellen und Mangelmutanten in Minimalmedium, bestehend aus Glucose und Salzen, unter Zusatz von Penicillin inkubiert wird. Penicillin tötet selektiv in Vermehrung begriffene Bakterien9. Da in Minimalmedium nur der Wildtyp wachsen kann, wird eine Anreicherung der auxotrophen Mutanten erzielt. Erfahrungsgemäß werden bei der Anwendung der Penicillin-Anreiche- rungsmethode unabhängig vom mutagenen Agens nur wenig Vitamin-Mangelmutanten erhalten. So konnten unter 1000 mit UV-Strahlen induzierten und mit Penicillin selektionierten Mutanten nur 3 Vitamin-Mangelmutanten festgestellt werden10. Von D a v is 11 wurde angegeben, daß die Vitamin- 1. e l l m a n n u. F. L in g e n s, Angew. Chem. 7 3, 107 [1961]. 2 E. F r e e s e, in: Molecular Genetics Part I, ed. J.. T a y l o r, Academic Press, New York 1963, S R. W. K a p l a n, Naturwissenschaften 49, 457 [1962]. 4 Chemische Mutagenese, Erwin-Baur-Gedächtnisvorlesungen I, Abh. dtsch. Akad. Wiss. Berlin Strahleninduzierte Mutagenese, Erwin-Baur-Gedächtnisvorlesungen II, Abh. dtsch. Akad. Wiss. Berlin J. L e d e r b e r g u. E. M. L e d e r b e r g, J. Bacteriol. 63, 399 [1952], 7 J. L e d e r b e r g u. N. Z i n d e r, J. Amer. chem. Soc. 70, 4267 [1948]. 8 B. D. D a v is, J. Amer. chem. Soc. 70, 4267 [1948]. * J. T. P a r k u. J. L. S t r o m in g e r, Science [New York] 125, 99 [1957]. 10 F. L in g e n s u. R. N a g e l, unveröffentlicht. 11 B. D. D a v i s, Experientia [Basel] 6, 41 [1950], Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.v. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. Zum ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung Keine Bearbeitung ) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. On it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition no derivative works ). This is to allow reuse in the area of future scientific usage.

2 152 F. LINGENS Mangelmutanten durch Kreuzfütterungs-Phäno- m ene1 verlorengehen. Vitamin-Mangelmutanten wachsen im Vergleich mit Aminosäure-, Purin- und Pyrimidin-Mangelmutanten schon mit sehr geringen Mengen an Endprodukt ihrer blockierten Synthesekette, so daß schon die von den abgetöteten W ildtypzellen abgegebenen Vitaminmengen zum Wachstum und damit auch zur Abtötung durch Penicillin genügen. Deshalb wird die Inkubation mit Penicillin zweckmäßigerweise mit einer zu hohen Zellkonzentration 11 vorgenommen. Andererseits besitzen die Zellen vor der Penicillinzugabe normalerweise eine Reserve an Metaboliten, die wiederum den Vitamin-Mangelmutanten bevorzugt noch ein gewisses Wachstum ermöglicht, das ihren Verlust zur Folge hat. ier kann man vor der Anwendung des Penicillins die Zellen längere Zeit in einem stickstoff-freien Minimalmedium unter Zusatz von Glucose inkubieren. Auf diese Weise werden u. a. die Vorräte an sti desto ffhaltigen Vitaminen erschöpft. Üblicherweise läßt man zur Anreicherung das Penicillin 24 Stdn. einwirken. Die Inaktivierungs- kurve von E. coli mit Penicillin (Abb. 2) zeigt, daß schon nach 3 Stdn. eine Abtötung bis auf 2% erzielt wird. Man kann annehmen, daß in diesem Zeitraum die Wahrscheinlichkeit erheblich geringer ist, V itamin-mangelmutanten durch Kreuzfütterungs-Phä- nomene zu verlieren. Anreicherungsversuche mit einer nur 3-stdg. Penicillineinwirkung bestätigten diese Annahme. Ein neuartiges Penicillin12: Ampicillin = Binotal [6- ( d -( ) -a-amino-a-phenylacetamido) -penicillansäure], das besonders wirksam gegenüber gramnegativen Bakterien ist, wurde auch in diesen Versuchen eingesetzt. Die Inaktivierungskurve (Abb. 3) unter den zur Anreicherung notwendigen Bedingungen zeigt, daß sich nur ein geringer Vorteil im Vergleich zum Penicillin G bietet. Einwirkung [Stdn.] Überlebende [%] 1 15,9 2 2,17 3 1,45 4 1,12 5 1,01 6 0,87 7 0,51 8 0,65 Abb. 3. Abtötung mit Binotal (1,2 mg/ml). Wenn man die Inaktivierimg durch ydrazin über den ganzen pn-bereich verfolgt, so zeigt sich, daß nur im alkalischen, sondern auch im neutralen und sauren Milieu eine Inaktivierung erfolgt. P. % Überlebende Behandelt Unbehandelt Einwirkung Überlebende [Stdn.] [%] 32,4 3,25 1,95 1,63 1,15 1,09 0,65 0,72 Abb. 2. Abtötung mit Penicillin- G-K (1,2 mg/ml). 12 E. A u h a g e n, Ch. G l o x h u b e r, G. e c h t, Th. K n o t t,. Ox- t e n, E. R a u e n b u s c h, K.. R is s e, J. S c h m i d, W. S c h o l t a n u. A. M. W a l t e r, Arzneimittel-Forsch. 12, 791 [1962]. 2 0, , ,3 90,5 5 87, , , , , ,7 82 Tab. 1. Einwirkung von ydrazinsulfat auf E. coli-zellen in Abhängigkeit vom p - W e r t ; 0,2-m., 30 Minuten. Im sauren Bereich tritt auch ohne Zusatz von ydrazin Inaktivierung ein, die aber geringer ist. Nach Einwirkung von ydrazinsulfat bei pn 2,7 ließen sich ebenfalls Mutanten isolieren. Man könnte annehmen, daß die Mutation allein durch die Einwir-

3 ERZEUGUNG BIOCEMISCER MANGELMUTANTEN VON ESCERICIA COLI 153 kung von Säure auf die Desoxyribonucleinsäure13,14 zu erklären sei. Tatsächlich konnte aber in einem entsprechenden Parallelansatz ohne Zusatz von ydrazinsulfat keine einzige Mutante isoliert werden. Die Versuche zur Mutationsauslösung wurden auch auf ydrazinderivate ausgedehnt. Bisher kamen Methylhydrazin, symmetrisches und asymmetrisches Dimethylhydrazin zur Anwendung. M it symmetrischem Dimethylhydrazin wurden sowohl bei Ph 8,0 als auch bei pn 2,1 Mutanten isoliert. Die In aktivierung von E. coli durch symmetrisches Dimethylhydrazin bei pa 8,0 ist in Abb. 4 dargestellt. Die Inaktivierung durch symmetrisches Dimethylhydrazin verläuft gleichartig zu der durch ydrazin. Unter vergleichbaren Bedingungen werden aber mit symmetrischem Dimethylhydrazin viel weniger Mutanten erhalten. Beim Vergleich der mit verschiedenen Methoden erzielten Mutanten fällt auf, daß nach langer Peni- 100 cillineinwirkung besonders viel Mutanten der Gruppe 1 isoliert werden. Ihre genaue Austestung zeigt, daß es sich überwiegend um Cystein- und Methionin-Mangelmutanten handelt. Das gleiche haben wir auch bei mit UV-Strahlen induzierten Mutanten beobachtet10. Auf der anderen Seite ist bemerkenswert, daß ohne Penicillin-Anreicherung relativ viele e Mutanten zu beobachten sind, die zwar auf Komplettmedium wachsen, die aber mit den angewendeten Gruppengemischen und den Einzelsubstanzen zum Wachstum zu bringen sind. Diskussion der Wirkungsweise von ydrazin und y d r a z i n d e r i v a t e n Durch Untersuchungen von T a k e m u r a und M i y a z a k i 15 ist gezeigt worden, daß DNS mit wasserfreiem ydrazin in eine pyrimidinfreie DNS umgewandelt wird. Es werden also spezifisch die Pyrimidinbasen entfernt. Aus früheren Untersuchungen geht hervor, auf welche Weise die Pyrim i dine Uracil, Thymin und Cytosin umgewandelt werden. Aus dem Uracil entsteht Pyrazolon unter Freisetzung von arnstoff, aus Thymin werden entsprechend Methylpyrazolon und arnstoff gebildet, und aus Cytosin sollen Aminopyrazol und arnstoff entstehen. 0 II \ / \ N + an - N 2 o II \ / \ N + h 2n - c o - n h 2 0,001 0, a Stdn. Einwirkung Einwirkung [Stdn.] Überlebende [%] a) b) o 1 14,3 24,6 2 2,6 2,18 3 1,16 0,94 4 0,18 0, ,0026 0, ,00063 Abb. 4. Inaktivierung mit symmetrischem Dimethylhydrazin (0,2-/n. Lösung). 0 N / I O II C 3 \ A / O' w I + h 2n - N 2 - N 0 II C 3 \ A / - N ^ i + h 2n - c o - n h 2 Aus den Nucleosiden werden die gleichen eterocyclen unter intermediärer Bildung von Ribosylhamstoff bzw. 2-Desoxyribosylharnstoff gebildet. 13 E. B a u t z -Fr e e s e, Proc. nat. Acad. Sei. USA 47, 540 [1961]. 14 S. G r e e r u. S. Z a m e n h o f, J. molecular Biol. 4, 123 [1962]. 15 S. T a k e m u r a u. M. M i y a z a k i, Bull. chem. Soc. [Japan] 32, 926 [1959]. 16 F. B a r o n u. D. M. B r o w n, J. chem. Soc. [London] 1955, P. A. L e v e n e u. L. W. B a s s, J. biol. Chemistry 71, 167 [1926]. 18 R. F o s s e, P h. a g n e u. R. D u b o is, C. R. hebd. Seances Acad. Sei. 178, 578 [1924]. 19 R. F o s s e, A. ie u l l e u. L. W. B a s s, C. R. hebd. Seances Acad. Sei. 178, 811 [1924].

4 154 F. LINGENS P [Penicillin] Gesamtzahl Pepton 8.0 ohne _ Stdn Stdn _ ohne 3 1 _ Stdn lf, Tal). 2. Biochemische Mangelmutanten durch Einwirkung von ydrazin. P [Penicillin] Gesamtzahl Pepton 8.0 ohne 3 _ 1 _ - _ 2 8,0 24 Stdn Stdn _ Stdn Tab. 3. Biochemische Mangelmutanten durch Einwirkung von symmetrischem Dimethylhydrazin. I Gesamtzahl Pepton 24 Stdn. Penicillin Tab. 4. Biochemische Mangelmutanten durch Einwirkung von asymmetrischem Dimethylhydrazin. Gesamtzahl Pepton 24 Stdn. Penicillin Tab. 5. Biochemische Mangelmutanten durch Einwirkung von Monomethylhydrazin. Glykosylharnstoff-Verbindungen sind stabil und zerfallen in arnstoff und Zucker. Auf diese Weise werden mit wasserfreiem ydrazin aus DNS die Pyrimidinbasen vollständig entfernt, so daß Fehlstellen entstehen. Über entsprechende Umsetzungen mit ydrazinderivaten war bisher s bekannt, über eigene Untersuchungen wird in Kürze berichtet werden 20. Während über die mutagene W irkung21,22 und die Wirkungsweise von ydroxylamin ausführliche Arbeiten vorliegen, ist bisher über die mutagene Wirkung von ydrazin nur wenig bekannt. Nach Untersuchung von F r e e s e, B a u t z und B a utz - F re e se 22 entfaltet ydrazin an Phagen nur 20 F. L in g e n s u.. S c h n e id e r - B e r n lö h r, in Vorbereitung. 21 E. F r e e s e, E. B a u t z - F r e e s e u. E. B a u t z, J. molecular Biol. 3, 133 [1961]. 22 E. F r e e s e, E. B a u t z u. E. B a u t z -Fr e e s e, Proc. nat. Acad. Sei. USA 47, 845 [1961]. eine geringe mutagene Wirkung. In weiteren Untersuchungen soll geklärt werden, wie die mutagene Wirkung von ydrazin und ydrazinderivaten zu erklären ist. Beschreibung der Versuche Verwendeter Mikroorganismus E. coli, Stamm 15 (ATCC 9723). Verwendete Medien 1. Komplettmedium: 8 g Nutrient Broth (Firma Difco, Chicago), 5 g NaCl, 1 l Wasser. Für Schrägröhrchen und Platten folgendes Rezept: 15 g Nutrient Broth, 5 g NaCl, 20 g Agar. 23. S c h u s t e r, J. molecular Biol. 3, 447 [1961]. 24 D. W. V e r w o e r d,. K o h l h a g e u. W. Z i l l i g, Nature [London] 192, 1038 [1961]. 25 D. M. B r o w n u. P. S c h e l l, J. molecular Biol. 3, 709 [1961].

5 ERZEUGUNG BIOCEMISCER MANGELMUTANTEN VON ESCERICIA COLI 2. Minimalmedium: 3,5 g K 2 P 0 4, 1,5 g K 2P 0 4, 0,5 g Na-citrat , 0,1g M gs04, 1,0 g (N4)2S 04, 1,0 g Glucose, 1 l Wasser. Dem Minimalmedium für Platten und Schrägröhrchen wird vor dem Autoklavie ren 2% Agar zugesetzt. 3. Salzlösung: 5 g NaCl, 0,12 g M gs04, 1 / Wasser. Der E. coli-stamm wurde zunächst in flüssigem Komplettmedium über Nacht vorgezüchtet. Die auf der Zentrifuge mit Salzlösung gewaschenen Zellen wurden in Salzlösung auf geschwemmt und mit gleichen Volu mina 0,2-m. ydrazinsulfat-lösung (oder einem ande ren Agens) und S ö r e n s e n -Puffer des gewünschten P-Wertes bei 37 C inkubiert. Nach der erforderlichen Einwirkungszeit wurde 1 : 100 mit Komplettmedium verdünnt und unmittelbar darauf die Plattierung auf Komplettplatten vorgenommen. Bei der Anwendung der Penicillin-Anreicherung wurde nach der Verdünnung mit Komplettmedium zunächst 24 Stdn. bebrütet. An schließend wurden die Zellen auf der Zentrifuge zweimal mit Salzlösung gewaschen und in N-freiem Minimal medium suspendiert und 5 Stdn. bei 37 C bebrütet In K a p s e n b e r g -Röhrchen wurden 6 mg Penicillin-GNatriumsalz oder-kaliumsalz, 5 ml Minimalmedium und dazu 1 Tropfen der Bakteriensuspension gegeben. Nach 20-stdg. Bebrütung bei 37 wurden je 5 Tropfen auf eine Komplettplatte verteilt. Nach Bebrütung ab hier gilt die Beschreibung auch wieder für Versuche ohne Penicillin-Anreicherung wurde am nächsten Tag das Kolonienmuster mit dem L e d e r b e r g -Stem pel zunächst auf je eine Minimal- und dann auf eine Komplettplatte übertragen. Am nächsten Tage wurden von der Komplettplatte diejenigen Kolonien, die auf der Minimalplatte kein Wachstum zeigten, abgeimpft und zur Kontrolle einem Strichtest unterworfen. Die Stämme mit selektivem Wachstum auf der Komplett platte wurden einem Blättchentest unterworfen. Dazu wurden die vorgezüchteten Einzelstämme in Platten mit Minimalagar suspendiert. Nach dem Erstarren wurden sterile Filtrierpapierblättchen aufgetragen, die Gemi sche von Aminosäuren, Vitaminen, Purinen und Pyrimidinen in folgender Gruppierung enthalten: Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 L-Cystin L-Leucin L-Tyrosin L-Methionin L-Isoleucin L-Phenylalanin L-Threonin L-Arginin L-ydroxyprolin L-Valin L-Tryptophan Gruppe 4 L-Prolin L-Lysin p-aminobenzoesäure L-Glutaminsäure L-istidin Pyridoxin-Cl Nicotinsäureamid Shikimisäure Gruppe 5 L-Serin L-Glycin L-Alanin L-Asparaginsäure Gruppe 6 Thiamin Riboflavin Ca-Panthothenat Biotin Folsäure Inosit Gruppe 7 Adenin Guanin Uracil Nach Bebrütung wurde am nächsten Tag registriert, um welche Blättchen eine Zellvermehrung stattgefunden hatte. Mit gleicher Technik wurde schließlich unter Ver wendung von Blättchen mit jeweils 1 Verbindung der genaue Wuchsstoffbedarf ermittelt. 155 Die nähere Austestung der ohne Penicillinbehand lung bei p 8,0 isolierten Mutanten ergab: 1 Mutante mit Wachstum mit Cystin oder Methionin, 1 mit Prolin und 1 mit Thiamin. Die mit 24-stdg. Penicillineinwirkung bei p 8,0 iso lierten Mutanten wurden vollständig ausgetestet. Unter den Mutanten der Gruppe 2 befand sich 1, die nur durch gleichzeitige Gabe von Valin und Lysin zum Wachstum gebracht werden konnte. Unter den Mutan ten der Gruppe 3 befanden sich 4 Tyrosin- -, 11 Phe nylalanin-*, 39 Tryptophan--, 2 Shikimisäure--, 1 Nicotinsäure-- und 3 Pyridoxin- -Mutanten. 16 Mutan ten wuchsen nur bei gleichzeitiger Gabe von Tyrosin und Phenylalanin, 10 nur bei Zugabe von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan und 2 nur bei Zugabe von Tyrosin, Phenylalanin und p-aminobenzoesäure. 2 Mutanten wuchsen mit Tyrosin oder Phenylalanin, 1 mit Phenylalanin oder Tryptophan, 1 mit Tryptophan oder Shikimisäure und 1 mit Pyridoxin oder Cystin. Von den Mutanten der Gruppe 4 wurden 26 ausge testet. Es zeigten sich 6 Treonin-- und 18 Prolin--Mutanten. 1 Mutante benötigte Threonin oder Lysin, 1 Prolin oder Asparaginsäure. Unter den Mutanten der Gruppe 5 befanden sich 1 Glycin--, 2 Serin--, und 1 Asparaginsäure--Mutante. 3 Mutanten wuchsen mit Serin oder Glycin, 2 mit Serin oder Cystin, 6 mit Serin, Methionin oder Cystin, 5 mit Serin, Glycin, Cystin oder Methionin, 1 mit Glycin, Alanin, Cystin oder Methio nin, und 1 konnte nur durch gleichzeitige Gabe von Serin und Methionin gezüchtet werden. In der Gruppe 6 trat eine Thiamin--Mutante auf. Unter den Mutanten der Gruppe 7 befanden sich 4 Adenin- -Mutanten, 4 wuchsen mit Adenin oder Guanin, 1 mit Adenin, Guanin oder Uracil, 1 mit Adenin, Guanin oder istidin, 1 mit Adenin, Guanin, Cystin oder Methionin und 1 mit Guanin unter gleichzeitiger Zugabe von Cystin oder mit Cystin allein. Die mit 3-stdg. Penicillineinwirkung bei pn 8,0 iso lierten Mutanten wurden vollständig ausgetestet. Unter den Mutanten der Gruppe 3 befanden sich 7 Ty rosin--, 10 Phenylalanin- -, 29 Tryptophan--, 2 p-ami nobenzoesäure--, 2 Pyridoxin--, 2 Nicotinsäure- - und 4 Shikimisäure--Mutanten. 6 Mutanten benötigten Tyrosin und Phenylalanin, 1 benötigte Phenylalanin oder Tyrosin und Phenylalanin, 2 benötigten Tyrosin, Phenylalanin und p-aminobenzoesäure, 7 Tyrosin und Phenylalanin und Tryptophan, 1 benötigte Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und p-aminobenzoesäure, 1 Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und p-aminoben zoesäure und Gruppe 4, 1 Tyrosin oder Arginin und Uracil, 1 Phenylalanin oder Tryptophan, 1 Tryptophan oder Cystin, 1 Phenylalanin oder Tryptophan oder Cy stin oder Arginin, 1 Tryptophan oder p-aminobenzoe säure, 1 Pyridoxin oder Isoleucin, 1 Nicotinsäure oder Threonin, 1 Shikimisäure oder Leucin, 1 Nicotinsäure oder Pantothensäure, 1 Tyrosin und Phenylalanin oder Arginin oder Isoleucin oder Isoleucin und Valin oder istidin oder Adenin oder Guanin. Unter den 45 ausgetesteten Mutanten der Gruppe 4 befanden sich 29 Prolin-- und 13 Threonin--Mutanten. 1 Mutante wuchs mit Threonin, Isoleucin, Leucin oder

6 156 ERZEUGUNG BIOCEMISCER MANGELMUTANTEN VON ESCERICIA COLI Valin, 1 mit Threonin, Serin oder Glycin, 1 mit Threonin, Serin, Glycin oder Leucin. 8 Mutanten der Gruppe 5 ergaben 4 Glycin-- und 1 Serin--Mutante; 2 Mutanten wuchsen mit Serin oder Glycin, und 1 wuchs mit Serin, Glycin, Adenin oder Guanin. In der Gruppe 6 traten 1 Thiamin-- und 1 Pantothensäure--Mutante auf. Die 48 Mutanten der Gruppe 7 konnten folgendermaßen aufgeschlüsselt werden: 12 Adenin--, 5 Guanin--Mutanten, 23 zeigten Wachstum mit Adenin oder Guanin, 2 mit Adenin, Guanin oder Uracil, 3 mit Adenin, Guanin oder istidin, 1 mit Adenin oder istidin und 2 nur bei gleichzeitiger Gabe von Uracil und Arginin. Von den ohne Penicillinbehandlung bei ph 2,7 gewonnenen Mutanten konnte 1 als Lysin- bestimmt werden. Die mit 24 Stdn. Penicillinbehandlung bei pn 2,7 isolierten Mutanten wurden nur teilweise aufgeschlüsselt. Unter 140 Mutanten der Gruppe 1 befanden sich 86 Cystin--, 2 Methionin-- und 3 Arginin~-Mutanten. 47 wuchsen mit Cystin oder Methionin, 1 wuchs mit Cystin, Methionin oder Arginin und 1 nur bei gleichzeitiger Gabe von Methionin und Arginin. Die Mutanten der Gruppe 2 setzten sich folgendermaßen zusammen: 17 Leucin-, 18 Isoleucin-, 2 Valin-, 5 Lysinund 43 istidin- ; 7 wuchsen mit Isoleucin und Valin, 4 mit Isoleucin oder Valin und 11 mit Isoleucin oder mit Isoleucin und Valin, 1 wuchs mit Leucin oder Isoleucin und 1 mit Leucin und Isoleucin oder Isoleucin und Valin. Unter den Mutanten der Gruppe 3 traten 3 Tyrosin- -, 2 Phenylalanin--, 10 Tryptophan-^, 3 Pyridoxin-- und 1 Nicotinsäure--Mutante auf. 1 Mutante benötigte ein Gemisch von Tyrosin und Phenylalanin, und 2 wuchsen unter gleichzeitiger Gabe von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan. Die Mutanten der Gruppe 4 setzten sich zusammen aus 11 Threonin--, 12 Prolin--Mutanten und 1 Glutaminsäure--Mutante; außerdem ließen sich 3 Mutanten isolieren, die mit Prolin oder Glutaminsäure wuchsen. Von den 41 Mutanten der Gruppe 5 wuchsen 4 mit Serin, 1 mit Glycin und 1 mit Asparaginsäure, 9 zeigten Wachstum mit Serin oder Glycin, 16 mit Serin oder der Gruppe 1, 7 mit Serin oder Glycin oder der Gruppe 1, 1 mit Glycin oder der Gruppe 1, 1 Mutante wuchs mit Serin, Glycin, Asparaginsäure oder istidin, und 1 wuchs nur mit der Gesamtgruppe 5. In der Gruppe 6 trat 1 Folsäure-Mangelmutante auf. In der Gruppe 7 wuchsen 5 Mutanten mit Adenin, 2 mit Uracil, 5 mit Adenin oder Guanin, 2 mit Adenin, Guanin oder istidin und 1 Mutante nur mit der Gesamtgruppe. Die in der Tab. 3 aufgeführten Mutanten wurden nur z. T. genau bestimmt. Die Mutanten der Gruppe 3, die bei ph 8,0 nach 24-stdg. Penicillineinwirkung isoliert worden waren, bestanden aus 2 Tryptophan-- Mutanten und 2 Mutanten, die nur bei gleichzeitiger Gabe von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan zum Wachstum gebracht werden konnten. Bei der Mutante der Gruppe 4 handelte es sich um eine Threonin-- Mutante. Nach Induktion bei pn 8,0 und 3-stdg. Penicillineinwirkung traten in der Gruppe 3 2 Tryptophan Mangelmutanten auf. Die Behandlung mit symmetrischem Dimethylhydrazin bei pn 2,1 und 24-stdg. Penicillineinwirkung lieferte in der Gruppe 4 6 Threonin-- und 2 Prolin-- Mutanten, in der Gruppe 5 1 Glycin--Mutante, in der Gruppe 7 1 Uracil--Mutante, und mit Pepton wuchsen 5 Mutanten. Diese wuchsen selektiv mit Glycylglycin und konnten auch mit größeren Mengen Glycin langsam zum Wachstum gebracht werden. Unter den Mutanten der Gruppe 2 befanden sich 3 istidin--und 1 Leucin--Mutante, 1 wuchs mit dem Gemisch Isoleucin und Valin. Bei den Mutanten der Gruppe 4 wurden 2 als Prolin- identifiziert. In Gruppe 5 wuchsen 4 mit Glycin, 1 mit Serin und 7 mit Serin oder Glycin. Die Mutante der Gruppe 7 erwies sich als Uracil-. 1 Mutante der Gruppe 5 wuchs mit Serin oder Glycin. Fräulein U. R uess danke ich für fleißige und selbständige Mitarbeit. Die offmann LaRoche AG und err Professor Dr. 0. Wiss, Basel, unterstützten diese Untersuchungen mit Biochemikalien, die Farbenfabriken Bayer AG mit verschiedenen Penicillinen. Dem Ministerium für Wissenschaftliche Forschung, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen Industrie danke ich für ihre materielle ilfe.