Mercodia C-peptide ELISA
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- Nadja Ingeborg Buchholz
- vor 7 Jahren
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1 Mercodia C-peptide ELISA Gebrauchsinformation REAGENZIEN FÜR 96 BESTIMMUNGEN Zum Gebrauch in der in vitro Diagnostik Hersteller Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE Uppsala Schweden
2 ERKLÄRUNG DER SYMBOLE AUF DEN ETIKETTEN Reagenzien für 96 Bestimmungen = 96 Verfallsdatum Lagerungstemperatur 2 8 C Lot Nr. Zum Gebrauch in der in vitro-diagnostik Mercodia
3 ZIELSETZUNG Mercodia C-peptide ELISA bietet eine Methode zur quantitativen Bestimmung von humanem C-Peptid in Serum, Plasma und Urin. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES TESTES Die qualitative und quantitative Auswertung der Funktion der ß-Zellen der langerhans schen Inselzellen ist nicht nur aussagekräftig in der pre- und postdiagnostischen Studie des Diabetes Mellitus, sondern auch relevant in der praktischen Anwendung als Hinweis auf die richtige Wahl der Behandlung. Der peripherale Insulinspiegel ist wegen der hohen und variablen Absorption von der portalen Zirkulation in die Leber nicht repräsentativ für die Analyse der ß-Zellenfunktion. Desweiteren kann ein Insulintest nicht zwischen endogenem und exogenem Insulin unterscheiden. Innerhalb der ß-Zellen ist das Proinsulin aus einem Molekül C-Peptid und einem Molekül Insulin zusammengesetzt. Das C-Peptid wird nach der Aufspaltung in die Zirkulation abgegeben, so dass die Konzentration von C-Peptiden gleich der des Insulins ist. Im Gegensatz zu Insulin werden die C-Peptid nur minimal von der Leber aufgenommen. Deshalb reflektiert die C-Peptidkonzentration im Blut die Sekretion von den ß-Zellen viel genauer als die Insulinkonzentration. Die C-Peptidkonzentration im Urin korreliert mit der Konzentration im Plasma. Da jedoch der Unterschied im Abbau zwischen den Individuen, so wie innerhalb einzelner Personen, ziemlich gross ist, führt die Messung der Urinkonzentration zu einer ungenauen Aussage über die ß- Zellenfunktion. DAS TESTPRINZIP Mercodia C-Peptide ELISA ist ein enzymatischer, zweiseitiger Immunoassay mit einer Festphase. Der Test basiert auf der direkten Sandwich-Technik, in welcher zwei monoklonale Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen im Insulinmolekül gerichtet sind. Während der Inkubation reagiert das C-Peptid in der Probe mit den Anti-C-Peptid-Antikörpern, welche auf der Mikrotitierplatte gebunden sind. Nach der Waschung wird das Peroxidasekonjugat mit den Anti-C- Petid-Antikörpern zugefügt und nach einer zweiten Inkubation nochmals gewaschen, um die ungebundenen, enzymatisch gekennzeichneten Antikörper zu entfernen. Das gebundene Konjugat wird durch 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine (TMB) sichtbar gemacht. Durch Zugabe von Säure wird die Reaktion gestoppt. Der dadurch erhaltene colometrische Endpunkt wird nun spektrophotometrisch abgelesen. WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN Nur für in vitro Diagnostik. Der Inhalt dieses Kits darf nicht in Kontakt mit Wiederkäuern oder Schweinen kommen. Die Stop Solution in diesem Kit enthält 0.5 M H 2 SO 4. Bitte Routinevorkehrungen für gefährliche Chemikalien beachten! Für sämtliche Patientenproben sollten die Vorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit Blutderivaten beachtet werden. Jede Vertiefung kann nur einmal verwendet werden. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Pipetten mit entsprechenden Volumen (vorzugsweise Mehrfachpipetten für die 3
4 Zugabe von Enzyme Conjugat 1X Lösung, Assay Buffer, Substrate TMB und Stop Solution) Teströhrchen, Becherglas und Messzylinder für die Aufbereitung der Reagenzien Redestilliertes Wasser Magnetrührer Vortex Mixer Mikroplattenleser (450 nm Filter) Plattenschüttler ( Umdrehungen pro Minute, Orbitalbewegung) Waschvorrichtung für die Mikrotiterplatten mit Überlauf-Waschfunktion (Empfehlung) REAGENZIEN Jedes Mercodia C-Peptide ELISA Kit enthält Reagenzien für 96 Brunnen. Dies reicht aus für 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat. Für grössere Versuchserien ist es empfehlenswert zusammengemischte Reagenzien aus Packungen mit der selben Lot. Nummer anzuwenden. Das Haltbarkeitsdatum für das komplette Kit ist auf dem Etikett der Packung vermerkt. Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2 8 C. Coated Plate 1 Platte 96 Brunnen Gebrauchsfertig Monoklonale Anti-C-Peptid der Maus 8 Brunnen-Strips Die unbenutzten Mikrotiterstreifen können in der mit Klebeband versiegelten Originalverpackung bei 2 8 C bis zu 2 Monate lang aufbewahrt werden. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 Fläschen 1000 µl Gefriergetrocknet Gelbfärbung Geben Sie 1000 µl Konzentrationen sind auf den Fläschchen angegeben. redstilliertes Wasser Lagerung von rekonstituierten Calibrators: 2-8 C max 1 Woche pro Fläschchen Lagerung von rekonstituierten Calibrators länger als 1 Woche hinzu. erfordern eine Temperatur von 20 C. Calibrator 0 1 Fläschen 5 ml Gebrauchsfertig Gelbfärbung Assay Buffer 1 Fläschen 6 ml Gebrauchsfertig Rotfärbung Enzyme Conjugate 11X 1 Fläschen 1.2 ml Zubereitung, Peroxidasekonjugierte monoklonale Anti-C-Peptide der Maus siehe nachfolgend Enzyme Conjugate Buffer 1 Fläschen 12 ml Gebrauchsfertig Blaufärbung Wash Buffer 21X 1 Flasche 50 ml Mit 1000 ml re- Lagerung nach Verdünnung: destilliertem Wasser 2 Monate bei 2-8 C die Wash Buffer1X Lösung herstellen Substrate TMB 1 Flasche 22 ml Gebrauchsfertig Farblose Lösung Achtung! Lichtempfindlich! Stop Solution 1 Fläschen 7 ml Gebrauchsfertig 0.5 M H 2 SO 4 4
5 Vorbereitung der Enzyme Conjugate 1X Lösung Vorbereiten der benötigten Enzyme Conjugate 1X Lösung durch mischen von Enzyme Conjugate 11X (1+10) mit Enzyme Conjugate Buffer entsprechend der folgenden Tabelle. Bei Vorbereitung der Enzymkonjugat 1X Lösung für die ganze Platte, Enzym Conjugate Buffer komplett in das Fläschchen Enzyme Conjugate 11X schütten. Vorsichtig mischen. Anzahl Streifen 12 Streifen 8 Streifen 6 Streifen 4 Streifen Enzyme Conjugate 11X 1 Fläschen 700 μl 500 μl 350 μl Lagerung nach Verdünnung: 1 Woche bei 2-8 C. Enzyme Conjugate Buffer 1 Fläschen 7 ml 5 ml 3.5 ml PRÄPARATGEWINNUNG UND HANDHABUNG Serum Gewinnen von Blut durch Venenpunktion, gerinnen lassen und das Serum durch Zentrifugieren abtrennen. Die Proben können bis zu 3 Tagen bei 2 8 C aufbewahrt werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von 20 C. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Plasma Gewinnen von Blut durch Venenpunktion. Verhinderung einer Koagulation des Venenblutes durch die Zugabe von Heparin oder EDTA. Anschließend Trennung der Plasmafraktion durch Zentrifugieren. Die Proben können bis zu 3 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von 20 C. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Urin Einsammlung von Urin über 24 Stunden (keine Konservierungsmittel). Die Proben sollten zwischen den Einsammlungen bei 2 8C aufbewahrt werden. Ermittlung des gesamten Volumens. Mischung einer Probe für die Analyse, bestehend aus gleich großen Anteilen des Gesamturines. Die Proben sollten vor Gebrauch nicht länger als 24 Stunden bei 2 8C gelagert werden. Für längere Aufbewahrung sollten die Proben bei 70C eingefroren werden. Wiederholtes einfrieren und auftauen sollte vermieden werden. Zellreste sollten vor der Analyse entfernt werden, entweder durch Filtrierung oder Zentrifugierung. Vorbereitung der Proben Die Urinproben vor dem Gebrauch mit Calibrator 0 im Verhältnis 1/10 v/v verdünnen. Normalerweise ist eine Verdünnung der Plasm- und Serumproben nicht notwendig. Liegt jedoch die Konzentration über der von Calibrator 5 wird eine Verdünnung von mit Calibrator 0 empfohlen. 5
6 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien müssen vor Beginn auf Raumtemperatur gebracht werden. Ebenso sollte für jeden Test eine Kalibratorkurve gemacht werden. 1. Vorbereiten Sie die Enzyme Conjugate 1X Lösung und den Wash Buffer 1X Lösung. 2. Vorbereiten genügender Mikrotiterplatten für die Calibrators, Kontrollen und Proben im Dublikat. 3. Pipettieren von 25 μl von jedem Calibrator, Kontrollen und der Proben in die dafür vor gesehenen Brunnen. 4. Zugabe von 50 μl Assay Buffer in die Brunnen. 5. Inkubation auf einem Schüttler ( rpm) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 25 C) mal waschen mit 700 μl Wash Buffer 1X Lösung pro Vertiefung unter Verwendung eines Platten Waschautomaten mit Überlauf-Waschfunktion. Nach der letzten Waschung Wash Buffer-Reste gründlich entfernen, indem der Rahmen mit den Streifen (Öffnung nach unten) mehrmals kräftig auf eine saugfähige Unterlage aufgeschlagen wird. Einwirkzeit während der Waschprozedur sollte vermieden werden. Wird manuell gewaschen, bitte folgendermaßen vorgehen: Reaktionsvolumen durch Umdrehen der Mikrotiterplatte über einem Ausgussbecken verwerfen. 350 μl Wash Buffer 1X Lösung in jede Vertiefung geben. Wash Buffer 1X Lösung verwerfen und mehrmals kräftig gegen saugfähiges Papier schlagen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. 5-mal wiederholen. Längere Einwirkzeiten während dieser Waschprozedur vermeiden. 7. Zugabe von 100 μl Enzyme Conjugate 1X Lösung in die Brunnen. 8. Inkubation auf einem Schüttler ( rpm) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 25 C). 9. Waschvorgang wie im Punkt 6 beschrieben μl TMB Substrate beifügen Minuten Inkubation bei Raumtemperatur (18 25 C). 12. Zugabe von 50 μl Stop Solution in jeden Brunnen. Um eine gute Mischung zu gewährleisten, wird empfohlen, die Platte für 5 Sekunden auf den Schüttler zu stellen. 13. Messen der Absorbance bei 450 nm und auswerten. Das Resultat sollte innerhalb von 30 Minuten abgelesen werden. Beachten Sie! Um Kontaminationen zwischen dem Konjugat und dem Substrat zu vermeiden, empfehlen wir Ihnen separate Pipetten zu verwenden. 6
7 QUALITÄTSKONTROLLE Die Verwendung von kommerziellen Kontrollen, wie die Mercodia Diabetes Antigen Control (Produkte-Nr: / ) und/oder interne Serumpoole mit tiefer, mittlerer und hoher C-Peptidkonzentrationen, angewandt als Proben, ist ratsam, um tägliche Gültigkeit der Resultate zu sichern. Es wird jedem Labor empfohlen, folgende Daten eines jeden Testes zu erfassen: Kit Lot-Nummer, verdünnung und/oder rekonstruierte Daten von Kitkomponenten, OD Werte der Blanks, Calibrators und Kontrollen. Wir empfehlen den Laboratorien, sich bezüglich der Anzahl der regelmäßigen Qualitätskontrollen an die gesetzlichen Richtlinien oder Akkreditierungs-Vorgaben zu halten. BERECHNUNG DER RESULTATE Computergestützte Berechnung Es kann eine computergestützte Berechnung der Absorbanzwerte der Calibrators, ausser Calibrator 0, und deren Konzentration mit Hilfe einer cubic spline regression erfolgen, um die Konzentration an C-peptid zu ermitteln. Manuelle Berechnung 1. Einzeichnen der für die Calibrators, ausser Calibrator 0, erthaltenen Absorbanzwerte im Verhältnis zur C-peptid-Konzentration auf einem log-log Papier und Erstellen einer Kalibratorkurve. 2. Die Konzentration der Proben aus der Kalibratorkurve ablesen. Beispiel von Resultaten Brunnen Identität A 450 pmol/l Mittlerwert 1A B 1C D 1E F 1G H 2A B 2C D 2E F 2G H 3A B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Probe 1 Probe 2 Probe 3 *Die Konzentration ist auf dem Fläschchen angegeben / / / / / / / / /
8 Beispiel einer Kalibratorkurve Hier wird eine typische Kalibratorkurve gezeigt. Sie soll nicht zur Berechnung aktueller Testergebnisse benutzt werden. GRENZEN DES VERFAHRENS Wie bei allen diagnostischen Tests sollte auch hier eine endgültige klinische Beurteilung nicht auf den Resultaten eines Einzeltests beruhen, sondern erst nach Erhalt der Ergebnisse aller klinischen und Laborbefunde abgegeben werden. Lipemic, Icteric oder hämolysierte Proben beeinträchtigen den Versuch nicht. Beim Pipettieren des Konjugates und Substrates sollten separate Pipetten verwendet werden. ERWARTETE WERTE Es wird empfohlen, dass jedes Labor eigene Referenzwerte etabliert. Die folgenden Resultate können als Richtlinie gelten, bis das Labor genügend eigene Daten gesammelt hat. Die Werte von 136 augenscheinlich gesunden und fastenden Personen erreichten einen Mittelwert von 742 pmol/l (2.2 μg/l) und einen Medianwert von 628 pmol/l (1.9 μg/l). Die Spannweite betrug pmol/l ( μg/l) bezogen auf die zentralen 95% der beobachteten Werte. 8
9 TESTCHARAKTERISIERUNG Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze ist als Nachweisvermögen nach ISO11843 Teil 1 definiert. Das Nachweisvermögen sollte als Bestandteil einer Methodenvalidierung und nicht als die niedrigste Konzentration, die gemessen werden kann, betrachtet werden. Die Nachweisgrenze ist 25 pmol/l, bestimmt nach der in ISO Teil 4 beschriebenen Methode. Die Konzentration von Proben mit Absorbanz unter Calibrator 1 sollte nicht berechnet werden, stattdessen als kleiner oder gleich ( ) der Konzentration angegeben werden, die auf dem Fläschchen für Calibrator 1 angegeben ist. Wiederfindung Serum: Die Wiederfindung nach Zugabe beträgt % (Mittlerwert 104 %). Urine: Die Wiederfindung nach Zugabe beträgt % (Mittlerwert 99 %). Hookeffekt Bei Proben mit einer Konzentration bis zu pmol/l wurde kein Hook-Effekt festgestellt. Präzision Jede Probe wurde unter 7 verschiedenen Gelegerheiten 4 mal gemessen. Variationskoeffizient Probe Mittelwert pmol/l während des Testes % zwischen den Testen % total Testen % Spezifität Insulin < % Proinsulin 2 % Proinsulin des (31-32) 3 % Proinsulin split (32-33) 2 % Proinsulin des (64-65) 74 % Proinsulin split (65-66) 10 % KALIBRIERUNG Mercodia C-peptide ELISA wurde gemäß der International Reference Reagent für C-peptide, IRR C-peptide 84/510 kalibriert. 9
10 UMRECHNUNGSFAKTOR 1 μg/l entspricht 331 pmol/l HAFTUNG Die hier aufgeführten Durchführungsdaten wurden mit dem indizierten Verfahren gewonnen. Jede von Mercodia AB nicht empfohlene Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Resultate beeinträchtigen. In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte, implizierte oder gesetzliche Garantie ab, die implizierte Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. Mercodia AB und deren Vertreter können dann weder für direkte Schäden noch für Folgeschädenhaftbar gemacht werden. REFERENZEN Gaines-Das RE and Bristow AF (1988) WHO international reference reagents for human proinsulin and human insulin C-peptide. J. Biol Stand 16: Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulineamia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47: Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53: Weitere Referenzen können auf unserer Website gefunden werden: 10
11 Calibrators, Kontrollen* und Proben beifügen ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLBLATTES Mercodia C-peptide ELISA 25 μl X-O Graf Tryckeri AB Assay Buffer beifügen Inkubieren Platte mit Wash Buffer 1X Lösung waschen Enzyme Conjugate 1X Lösung beifügen 50 μl 1 Stunde auf einem Schüttler bei C, rpm 700 µl, 6 mal 100 μl Inkubieren Platte mit Wash Buffer 1X Lösung waschen Substrate TMB beifügen Inkubieren Stop Solution beifügen 1 Stunde auf einem Schüttler bei C, rpm 700 µl, 6 mal 200 μl 15 minutes bei C 50 μl Sicherstellen von Durchmischung 5 Sek. Messung A 450 Ergebnisse auswerten *Nicht in der Packung enthalten Für vollständige Details siehe Seite Version 10.0
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