Verbesserung der Qualitätssicherung KOLT

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1 Verbesserung der Qualitätssicherung bei Blutspenderscreening PCR Testung KOLT M. Schmidt, M. K. Hourfar, W. Sireis, E. Seifried

2 Übersicht 7 Risiken in der PCR Präanalytische Bedingungen Zentrifugation versus Bead extraktion Interne Kontrolle Probenverwechslung Poolauflösung Analytische Sensitivität Präserokonversionsproben

3 DRK Baden-Württemberg Hessen Methode CE Prozesse Pooling in 96 Pool (100µl pro Probe) Vorzentrifugation (15 min bei 6.000xg) Hochtourige Zentrifugation (1h bei xg) Pooling mit Tecan manuelles Verfahren Manuelles Verfahren Keine Barcodekontrolle Ca. 24 Pools pro Mitarbeiter und Arbeitsschicht HAV, HBV, HCV, HIV-1, PB19 Manuelle Extraktion (Qiagen) Amplifikation (ABI)

4 DRK Baden-Württemberg Hessen Methode CE Prozesse Zelos x100 Pooling in 96 Pool (100µl pro Probe) Vollautomatische Extraktion (1,5h für 22 Pools) Pooling mit Tecan Automatisches Verfahren Komplette Barcodekontrolle 66 Pools pro Gerät und Arbeitsschicht HAV, HBV, HCV, HIV-1, PB19 Amplifikation (ABI)

5 Risiko 1: Präanalytische Bedingungen Studiendesign Messung des Haematokrits von 144 Proben Spiken der Proben mit HBV, HCV und HIV-1 adaptiert an das Plasmavolumen mit 6 verschiedenen Konzentrationen Lagerung der Proben bei Raumtemperatur und 4 C 8 C Extraktion der Proben mit dem Zelos x100 Amplifikation der Proben auf HBV, HCV und HIV-1 Probit Analyse mit SPSS

6 Untersuchungszeitpunkte T0 Basis Evaluation ARM A Raumtemperatur ARM B 4 C - 8 C T1 = 24h Zeit (t) T2 = 48h T3 = 72h T4 = 168h

7 Ergebnisse HBV HBV IU/ml % Nachweisgrenze Pool PCR Lagerung Raumtemperatur T0 T1 T2 T3 T4 Start 24h 48h 72h 168h Zeit (h) Lagerung 4 C 8 C Oberes Konfidenzintervall bei Raumtemperatur

8 Ergebnisse HCV HCV IU/ml PEI Anforderungen an die analytische Sensitivität für PCR Systeme Lagerung Raumtemperatur Lagerung 4 C 8 C Oberes Konfidenzintervall bei Raumtemperatur Sicherheitsdistanz zu den PEI Kriterien IU/ml 403 IU/ml 0 T0 T1 T2 T3 T4 Start 24h 48h 72h 168h Zeit (h) 1200 IU/ml Kein Unterschied zwischen Raumtemperatur und 4 C 8 C

9 Ergebnisse HIV PEI Anforderungen an die analytische Sensitivität für PCR Systeme Lagerung Raumtemperatur HIV-1 IU/ml Sicherheitsdistanz zu den PEI Kriterien 5402 IU/ml Lagerung 4 C 8 C Oberes Konfidenzintervall bei Raumtemperatur IU/ml 2596 IU/ml 1504 IU/ml 0 T0 T1 T2 T3 T4 Start 24h 48h 72h 168h Zeit (h) Leicht besser Ergebnisse bei 4 C-8 C

10 Risiko 2: Zentrifugation versus Bead Extraktion Manuelles Verfahren Automatisches Verfahren Einlesen der barcodierten Pools Vorzentrifugation nach dem Poolen mit Barcodes Manuelles dekantieren des Überstandes in ein neues Zentrifugationsgefäß Einlesen der Barcodierten Internen Kontrolle, Beads, Puffer Anreicherung durch hochtourige Zentrifugation Aufnahme der Beads Manuelles verwerfen des Überstandes und Entfernung des Fettes Verteilung der Internen Kontrolle Manuelle Zugabe des Lysepuffers mit Interner Kontrolle

11 Einfluss von lipämischen Proben auf die Zentrifugation A: Normales Plasma B: Lipämisches Plasma (Triglyceride 1500mg/dl, Cholesterol 500mg/dl) 1: Viruskonzentration vor Anreicherung 2: Viruskonzentration nach Anreicherung Viruskonzentration IU/ml A B A B A B Qrtl. 2. Qrtl. 3. Qrtl. 4. Qrtl. HCV HBV HIV Effizienz der Virusanreicherung (%) % 27% 78% 60% 99,8% 1. BQrtl. L 2. BQrtl. L 3. BQrtl. L HCV HBV HIV 85%

12 Risiko 3: Interne Kontrolle Manuelles Verfahren Automatisches Verfahren Manuelle Vorzentrifugation Manuelles Überführen des Überstandes Manuelle Hauptzentrifugation Manuelles Dekantieren des Überstandes Barcode Kontrolle der IC Charge Zugabe durch den Tecan zu Beginn des Extraktion Monitoring der gesamten Beads-Extraktion Manuelles Entfernen des Fettes Zugabe der Internen Kontrolle mit dem Lysepuffer Monitoring der Extraktion

13 Risiko 4: Probenverwechslung 3x möglich Manuelles Verfahren 1. Manuelles dekantieren des Überstandes in ein neues Zentrifugationsgefäß 2. Manuelles Pipettierung auf die Qiagensäulen 3. PCR Ansatz nach Vorlage

14 Risiko 4: Probenverwechslung ausgeschlossen Automatisches Verfahren

15 Risiko 5: Poolauflösung (mindestens 24h) Manuelles Verfahren Primäres Screening Bildung von 20 Subpools Bestätigungspool + Einzeprobe + Originalröhrchen 8 x x 8 Freigabe Uhr Tag 2 Tag 1 Tag 2

16 Risiko 5: Poolauflösung (1 h) Automatisches Verfahren Poolauflösung aus der Rückstellplatte als Einzel-PCR Extraktion innerhalb 1 Stunde

17 Risiko 5: Poolauflösung (1 h) Automatisches Verfahren Probenvorbereitung Auswertung Einzelprobenextraktion Auswertung

18 Risiko 5: Poolauflösung Vorteile Automatisches Verfahren Gesamtfreigabe innerhalb eines Arbeitstages Freigabe aller Pools eines Arbeitstages erst nach plausibler Poolauflösung Bessere Versorgung der Klinik mit Blutprodukte gerade bei verkürzter Haltbarkeit der Thrombozytenkonzentrate

19 Risiko 5: Kostenrechnung Poolauflösung Mit dem Automaten besteht die Möglichkeit HAV und Parvovirus B19 simlutan zu detektieren Einsparung von PCR Puffer (QTMP) Ausgaben durch mehr PCR Reaktionen bei einer Poolauflösung Automatisches Verfahren Bei höherer Sicherheit und besserer Versorgung Einsparungen Poolauflösung Automat Ausgaben Poolauflösung Automat

20 Zusammenfassung 1 In Kombination mit der automatischen Extraktion mit dem Zelos x100, und dem DRK PCR Kits zeigt sich eine Virusstabilität bis zu 7 Tagen für die Trennung von zellulären Bestandteilen vom Plasma, somit ist eine Zentrifugation innerhalb von 72h bei einer Lagerung bei Raumtemperatur als sicher zu betrachten Die Effizienz der Anreicherungszentrifugation ist abhängig vom Parameter und Lipidgehalt im Pool Die Interne Kontrolle monitort bei der automatischen Extraktion den kompletten Prozess, beim manuellen Verfahren lediglich die Extraktion Beim manuellen Verfahren kann eine Probenverwechslung in drei Arbeitsprozessen erfolgen, bei der automatischen Extraktion ist der gesamt Prozess Barcode kontrolliert Die Poolauflösung erfordert im manuellen Verfahren mindestens 24 h, beim automatischen Verfahren erfolgt die Auflösung tagesaktuell

21 Zusammenfassung 2 Bei Präserokonversionspools erfolgt die Freigabe erst nach Poolauflösung Bessere Versorgung mit Blutprodukten durch eine Tagesaktuelle Poolauflösung

22 Acknowledgement E. Seifried W. Sireis M. K. Hourfar K. Gubbe U. Winkler M. Brücher A. Borejdo

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