Skript zum Versuch Elektrospray-Ionisation und Massenspektrometrie. Betreuerin: Oxana Upir

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1 Skript zum Versuch Elektrospray-Ionisation und Massenspektrometrie Betreuerin: Oxana Upir

2 1. Inhaltsverzeichnis 1. Inhaltsverzeichnis i 2. Einleitung 1 3. Theorie Massen und Massenspektren Nominelle Ionenmasse Isotopische Masse Monoisotopische Masse Häufigste Masse Relative Masse und Molekülmasse ESI Quadrupol Detektor 7 4. Ziele und Aufgaben 8 5. Anhang I Abbildungsverzeichnis I i

3 2. Einleitung Der Einsatz der Massenspektrometrie (MS) zur Analyse von Elementen und Molekülen ist ein wichtiger Bestandteil in der analytischen Chemie. Die massenspektrometrische Analyse ist dank zahlreicher Entwicklungen über die letzten Jahrzehnte zu einer wirkungsvollen Methode geworden, um Molekülmassen, Bindungsenergien und Stoßquerschnitte zu bestimmen oder chemische Strukturen aufzuklären. 1 Das Anwendungsgebiet der Massenspektrometrie beschränkt sich aber nicht nur auf die Routineanalytik, sondern erstreckt sich über ein weites Feld der gegenwertigen Forschung und dient der Selektion, Präparation, Leitung und sogar dem zeitweiligen Einfangen der Ionen. 2,3 So können chemische Reaktionen unter Bedingungen beobachtet werden, bei denen Wechselwirklungen mit anderen Substanzen, wie beispielsweise Lösungsmittel, nicht vorhanden sind. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse dienen als Verständnisgrundlage für viele Reaktionen und Experimente, die unter nass-chemischen Laborbedingungen durchgeführt werden. Die Vorteile der Massenspektrometrie liegen in der Sensitivität, dem geringe Probenverbrauch, der breiten Anwendungsmöglichkeit was die Molekülklasse und größe angeht und die Möglichkeit der Kopplungen mit anderen separierenden Methoden, wie beispielsweise der Flüssigchromatographie. 4 Dadurch findet die Massenspektrometrie breite Anwendung in allen naturwissenschaftlichen Bereichen. Ein Massespektrometer besteht grundsätzlich aus einer Ionen-Quelle, einem Ionenseparator und einem Detektor. Diese Elemente können technisch unterschiedlich realisiert und je nach Aufgabenfeld kombiniert werden. Typische Ionisationsmethoden sind Elektronenstoßionisation (EI, engl.: electron ionization), chemische Ionisation (CI, engl.: chemical ionisation), Elektrospray-Ionisation (ESI, engl.: electrospray ionisation) und Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI, engl.: matrix assisted laser desorption ionisation). Zu den am häufigsten verwendeten Separatoren zählt das Quadrupol und der Flugzeitmassenseparator (TOF, engl.: time of flight). Jede dieser Methoden hat ihre eigenen Vor- und Nachteile, sodass sich ein Massenspektrometer durch die jeweilige Kombination für ein oder mehrere Anwendungsgebiete eignet. 5 Manche Geräte besitzen zusätzlich austauschbare Ionisationsquellen, sodass ein breiteres Spektrum an Substanzproben abgedeckt werden kann. In diesem Versuch soll die Funktionsweise eines ESI-Quadrupol-MS ergründet und der Einfluss verschiedener Ionisationsparamter auf das Massenspektrum untersucht werden. Dafür soll zunächst eine Lösung eines organischen Moleküls hergestellt werden und die detektierten Massen-Signale durch Änderung der Quellparameter optimiert werden. Anschließend soll eine NaCl- Lösung untersucht werden. Natrium- und Chloridionen können im Übergang aus der Lösung in die Gasphase Cluster bilden, die dann ebenfalls detektiert werden können. Auf Grundlage der so ermittelten Clusterzusammensetzungen können Mutmaßungen über die Struktur der Cluster in Abhängigkeit ihrer Atomanzahl aufstellt werden. 6 1 P. B. Armentrout: Mass Spectrometry-Not Just a Structural Tool: The Use od Guided Ion Beam Tandem Mass Spectrometry to Determine Thermochemistry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2002, 13, , doi /S (02) D. Gerlich: Application of rf fields and collision dynamics in atomic mass spectrometry, J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, , doi: /b404032p 3 E. de Hoffmann, V. Stroobant: Mass Spectroemtry-Principles and Applications, John Wiley & sons Ltd, 2007, ISBN: C. A. Schalley: Modern Mass Spectrometry, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2003, doi: / J. H. Gross: Mass Spectrometry, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2011, doi: / D. Zhang, R. G. Cooks: Doubly charged cluster ions [(NaCl)m(Na)2]2+: magic numbers, dissociation, and structure, Int. J. Mass Spectrom, 2000, 195,

4 3. Theorie 3.1. Massen und Massenspektren Nominelle Ionenmasse Die nominelle Masse eines Atoms ist die ganzzahlige Zahl des häufigsten natürlich vorkommenden stabilen Isotops. Die nominelle Masse eines Moleküls setzt sich entsprechend aus den nominellen Massen jedes einzelnen Atoms zusammen. Die nominelle Masse ist immer eine ganzzahlige Zahl. Sie dient einer groben Abschätzung der Molekülmasse. Beispiel: Nominelle Masse von SnCl 2 ist 120 u u = 190 u. 35 Cl ist das häufigste Isotop und auch das mit der geringsten Masse. 120 Sn ist das häufigste stabile Isotop, aber nicht das mit der geringsten Masse, was 112 Sn wäre Isotopische Masse Die isotopische Masse ist die exakte Masse eines Isotops. Lediglich bei 12 C ist die isotopische Masse genau gleich der nominellen Masse, u. 5 Beispiel: 1 H: H: u Monoisotopische Masse Die monoisotopische Masse eines Atoms ist die exakte Masse seines häufigsten Isotops. Bei Molekülen ist es die Summe der häufigsten Isotope der einzelnen Atome. Bei organischen Molekülen ist es meist das Molekül mit geringster Masse, da 12 C sehr viel häufiger vorkommt als 13 C (siehe Abb. 1a-c) Häufigste Masse Die häufigste Masse ist die mit der größten Intensität. Bei kleinen organischen Molekülen ist es die monoisotopische Masse. Bei großen Molekülen steigt jedoch die Wahrscheinlichkeit, mindestens ein anderes als das häufigste Isotop, z.b. 13 C, im Molekül zu haben. Daher kann die häufigste Masse von der monoisotopischen Masse abweichen, wie in Abb. 1d gezeigt Relative Masse und Molekülmasse Die relative Masse eines Atoms setzt sich aus den Wahrscheinlichkeiten der natürlich vorkommenden Isotope und ihren Massen zusammen. Man beachte, dass es in Wirklichkeit keine Atome mit dieser Masse gibt und sie daher im Massenspektrum nicht auftauchen. Für Moleküle ist die relative Masse die Summe der relativen Atommassen und wird als Molekülmasse bezeichnet. Beispiel: 35 Cl hat die exakte Masse u und kommt mit einer Häufigkeit von 75,78% vor. 37 Cl hat eine Masse von u und kommt mit ca % in der Natur vor. Daraus ergibt sich eine relative Masse von u. 5 7 M. Hesse, H. Meier, B. Zeeh: Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, Georg Thieme Verlag KG, 2012, ISBN

5 (a) (b) (c) (d) Häufigste Masse Monoisotopische Mass e Abbildung 1 Theoretische Isotopenverteilung von (a) C 5 -, (b) C 50 -, (c) C und (d) C 150 -Molekülen generiert durch 3

6 3.2. ESI Elektrospray-Ionisation ist eine weit verbreitete Ionisationsmethode, bei der eine Lösung der zu untersuchenden Substanz unter atmosphärischem Druck durch eine dünne Kapillare versprüht wird. Zwischen der Kapillare und dem Eingangsbereich ins Vakuum wird ein Potential von 1-5 kv angelegt. Zusammen mit einem inerten Gasstrom, der die Kapillare umspült, bewirkt das Potential, dass das Lösungsmittel verdampft und die Moleküle ionisiert werden. Da durch die adiabatische Expansion der Lösemitteltröpfchen die Temperatur dieser sinkt, ist es unbedingt notwendig, die Kapillare zu heizen. Dadurch kann das Gefrieren der Lösung an der Spitze vermieden werden und das Verdampfen der Lösemittels wird unterstützt. Es gibt einige leicht unterschiedliche Theorien dazu, wie der genaue Ionisationsvorgang abläuft, die in der Literatur diskutiert werden. 5 In Abb. 2a ist eine Variante dargestellt, die als wahrscheinlich angenommen wird. Zunächst bildet sich an der Spitze ein so genannter Taylor-Kegel aus, aus dem einzelne Tropfen austreten. Durch Verdampfen des Lösungsmittels nähern sich die geladenen Moleküle an, bis es zu einer Coulomb-Explosion kommt und kleinere Tröpfchen entstehen. Dieser Vorgang wiederholt sich, bis schließlich durch Verdampfen der letzten Lösemittelmoleküle nur noch geladene Molekülionen übrig bleiben, die ins Vakuum überführt werden. Grundsätzlich gibt es unterschiedliche Ausführungen von ESI-Quellen. Manche sprühen, wie in der Abb. 2a gezeigt direkt auf die Öffnung zum Vakuumbereich, andere sprühen seitlich oder sogar orthogonal zum Vakuumeingang, um zu verhindern, dass übermäßig viel Lösungsmittel und Gas in den Vakuumbereich gelangt. Auch sind mehrere Vakuumstufen, von atmosphärischem Druck ins Grob- und dann Feinvakuum notwendig. Je nach Apperatur ist der ESI-Bereich unterschiedlich gestaltet. In Abb. 2b sehen Sie den Quellenbereich des im Versuch verwendeten Gerätes. Die Ionen werden durch die angelegten Potentiale durch die Z-Konfiguration der Quelle geleitet und gelangen dann zum Quadrupol. Welche Ionen mittels ESI gebildet werden, hängt von der Polarität des Moleküls, den Eigenschaften des Lösemittels und der An- bzw. Abwesenheit von Verunreinigung, insbesondere durch Alkalimental-Ionen, ab. Tabelle 1 stellt die häufigsten Ionenarten zusammen, die bei der ESI detektiert werden. (a) (b) Lösungsmittel mit Probensubstanz Massenspektrometer Abbildung 2 (a) Schematische Darstellung des Ionisationsvorgangs mittels ESI. 8 (b) Aufbau der ESI-Quelle am verwendeten Gerät. 9 8 Abb. nach: 9 Abb. nach: Waters Corporation: ZMD User s Guide, Issue 2,Massachusettes, USA 4

7 Tabelle 1 Ionenarten, die bei der Elektrospray-Ionisation häufig auftreten. Molekül Positive Ionen Negative Ionen unpolar [M+H] +, [M+Alkali] + [M-H] -, [M+A] - [M-H] -, [M+A] -, Mittel-stark bis stark polar [M+H] +, [M+Alkali] + [M-H n +Alkali n+1 ] + [M-H n +Alkali n+1 ] - Ionisch K +, [K n +A n-1 ] + A -, [C n-1 +A n ] Quadrupol 5 Ein Quadrupolmassenfilter besteht aus vier parallel angeordneten Elektroden, die im Querschnitt ein Quadrat bilden. Die jeweils gegenüberliegenden Stäbe sind elektrisch miteinander verbunden. Zur Erzeugung eines Quadrupolfeldes wird an den Stabpaaren eine positive bzw. negative Gleichspannung angelegt, die zusätzlich mit einer Wechselspannung überlagert wird. Die Wechselspannung ist dabei zwischen den Stabpaaren um 180 phasenverschoben (siehe Abb. 3). Gleichung (1) beschreibt die angelegte Spannung U ges = U + A cos ωt, (1) wobei U die Gleichspannung, A die Amplitude der Wechselspannung und ω die Kreisfrequenz der Wechselspannung angibt. Die geladenen Teilchen fliegen bei angelegtem Quadrupolfeld auf schraubenförmigen Bahnen entlang der Hauptachse des Quadrupols und werden je nach ihrem Massezu-Ladungsverhältnis auf stabilen Bahnen hindurch geleitet (Abb. 3b) oder an den Stäben entladen (Abb. 3c und 3d). Es ist zu erkennen, dass zu schwere Ionen (Abb. 3c) in einer anderen Ebene herausgefiltert werden als leichte Ionen (Abb. 3d). Durch Variation der Kreisfrequenz sowie der Gleich- und Wechselspannung kann das Masse-zu-Ladungsverhältnis für die stabilen Bahnen vorgegeben werden. Abbildung 3 Darstellungen eines Quadrupols in Simion 8.1 mit berechneten Ionentrajektorien. Abb. (a) und (b) zeigen die Trajektorien eines stabilen Ions in 3D und y-z-ebene. Abb. (c) bzw. (d) zeigen instabilen Trajektorien eines zu schweren/leichten Ions SIMION 8.1., D.J. Manura, D.A. Dahl, Scientific Instrument Services, Inc. (SIS),

8 Die stabilen Trajektorien der Ionen lassen sich durch Aufstellen von Bewegungsgleichungen und Umformung mit den Parametern a und q, a = 4 z e U m r 2 ω 2 (2) q = 2 z e A m r 2 ω 2 (3) als Differenzialgleichungen nach Mathieu beschreiben, deren Lösung bekannt sind. Dabei ist m die Masse und z die Ladung des Ions und r der Radius des Kreises, auf dem die Quadrupolstäbe sitzen. 11 Das Verhältnis aus a/q ist dabei immer 2 U/A, was die Steigung der Arbeitsgeraden angibt, mit der das Quadrupol betrieben wird. Durch Einführen eines Stabilitätsdiagramms (Abb. 4) für a und q kann der stabile und instabile Bereich der Ionenbewegung dargestellt werden. Abbildung 4 Stabilitätsdiagramm für ein Quadrupolfeld mit einer Arbeitsgeraden und dem stabilen Bereich der Ionentrajektorie unterhalb des Dreiecks. Werden die beiden Parameter a und q so gewählt, dass sie unterhalb des Dreiecks liegen, so befindet sich das entsprechende Ion auf einer stabilen Bahn im Quadrupolfeld und wird so von den instabilen Ionen abgetrennt. Zur Aufnahme eines Massenspektrums wird die Gleichspannung sowie die Amplitude der Wechselspannung und damit die Parameter a und q variiert. Dadurch kann der stabile Bereich der Ionentrajektorien für verschiedene Molekülgrößen durchlaufen und der Ionenstrom jeder einzelnen Masse mit einem Detektor ermittelt werden. Dieser Ionenstrom kann dann gegen das Massezu-Ladungsverhältnis aufgetragen werden. Bei dem hier verwendeten Instrument gibt es vor dem filternden Quadrupol zusätzlich noch einen kurzen Quadrupol, der als Prefilter bezeichnet wird. Dieser dient dazu, die elektrischen Felder aus der Quellen-Region abzuschirmen und bereits erste Verschmutzungen herauszufiltern. Der Prefilter kann im Vergleich zum Qudrupol leichter herausgenommen und gereinigt werden. 11 W. Paul, H.P. Reinhard, U von Zahn: Das elektrische Massenfilter als Massenspektrometer und Isotopentrenner, Z. Phys., 1958, 152, 2, , doi: /BF

9 3.4. Detektor Der in diesem Aufbau verwendete Detektor setzt sich aus einer Konversionsdynode, einem Phosphorschirm, einer Photokathode und einem Elektronenvervielfacher zusammen (siehe Abb.5). Bei der Konversionsdynode schlagen die auftreffenden Ionen Elektronen heraus, die wiederum durch Auftreffen auf den Phosphorschirm Photonen induzieren. Die Photonen können dann in den vakuumversiegelten Photoelektronenvervielfacher eintreten und dort an der Photokathode Elektronen freisetzen, die anschließend in Form einer Kaskade vervielfältigt werden. Das so entstandene Signal wird dann in ein digitales Signal umgewandelt und mittels einer Software am Computer verarbeitet. Der Photoelektronenvervielfältiger, auch Photomultiplier genannt, wird immer unter Vakuum gehalten, selbst wann die Quadrupolkammer belüftet wird. Dadurch wird eine Kontamination des Photomultipliers verhindert und die Lebensdauer des Detektors erhöht. Abbildung 5 Aufbau des Detektors. 7

10 4. Ziele und Aufgaben Ziel des Versuchs ist es, den Umgang mit einem ESI-Quadrupol zu erlernen und an verschiedenen organischen Substanzen zu erproben. Es sollen Coffein- und NaCl-Lösungen untersucht werden 1) Für eine massenspektrometrische Messung ist es notwendig, sich darüber im Klaren zu sein, welche Massen überhaupt zu erwarten sind. Neben der Molekülmasse können bei organischen Molekülen auch Fragmente detektierbar sein. Überlegen Sie sich vor Beginn des Versuchs anhand der Molekülstruktur, welche Molekülmassen zu erwarten sind und welche Fragmente möglicherweise entstehen können. Überlegen Sie, wie sich die Isotopenverteilung von NaCl-Clustern mit zunehmender Atomzahl verändert. Gehen Sie davon aus, dass sich meist Cluster in der Form Na n+1 Cl n + bilden. 2) Für die Untersuchung werden aus den Stammlösungen Verdünnungen hergestellt. Die Coffein- Probe soll am Ende in Acetonitril/Wasser im Volumenverhältnis 50%:50% gelöst sein. Zusätzlich wird eine geringe Menge Ameisensäure zugegeben. Diese begünstigt die Protonation der zu untersuchenden Substanz. NaCl wird ausschließlich in Wasser gelöst. Anschließend wird 1 ml Probenlösung mit einer Spritze aufgenommen und diese in der Spritzpumpe befestigt. 3) Das Gerät wird nun für die Messung vorbereitet. Hierfür wird die Stickstoffleitung geöffnet und der Zufluss in den Quellenbereich mittels Software gestartet. Die Spritzenpumpe wird angeschaltet und die Messung durch die Software begonnen. Optimieren Sie die Quellparameter so, dass das Molekülsignal möglichst intensiv ist. Stellen Sie dafür die Auflösung (LM Res und HM Res) auf Fünf. Folgende Parameter können variiert werden: Gasfluss, Kapillarspannung, Konus-Spannung, Extractor-Spannung, Ionen Energie, Abstand der Kapillare zum Konus. 4) Erhöhen Sie nun die Auflösung und nehmen Sie ein Massenspektrum auf. Sind die von Ihnen erwarteten Fragmente detektierbar? Welche Massensignale sehen Sie und wie können diese erklärt werden? Variieren Sie einen der oben genannten Quellparameter und nehmen Sie Spektren auf. Welchen Einfluss hat der Parameter auf den Molekülionenpeak und die Fragmente? 5) Führen Sie nun eine Messung mit der NaCl-Lösung durch. Optimieren Sie die Parameter so, dass auch schwerere Cluster detektiert werden können. Nehmen Sie ein Spektrum auf. Ordnen Sie den Massen Summenformeln zu und stellen Sie Mutmaßungen über die Struktur der Cluster auf, indem Sie die Gitterstruktur von kristallinem NaCl berücksichtigen. 6) Um die Kapillarleitung zu säubern, muss diese nach einer Messung mit Lösungsmittel gespült werden. Nehmen Sie dafür reines Acetonitril und erhöhen Sie die Flussrate an der Spritzenpumpe. Literatur zur Vorbereitung: J. H. Gross: Mass Spectrometry, Springer-Verlag M. Hesse, H. Meier, B. Zeeh: Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, Thieme-Verlag 8

11 5. Anhang Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Theoretische Isotopenverteilung von (a) C5-, (b) C50-, (c) C100- und (d) C150- Molekülen generiert durch Abbildung 2 (a) Schematische Darstellung des Ionisationsvorgangs mittels ESI. (b) Aufbau der ESI- Quelle am verwendeten Aufbau. Abbildung 3 Darstellungen eines Quadrupols in Simion 8.1 mit berechneten Ionentrajektorien. Abb. (a) und (b) zeigen die Trajektorien eines stabilen Ions in 3D und y-z-ebene. Abb. (c) bzw. (d) zeigen instabilen Trajektorien eines zu schweren/leichten Ions. Abbildung 4 Stabilitätsdiagramm für ein Quadrupolfeld mit einer Arbeitsgeraden und dem stabilen Bereich der Ionentrajektorie unterhalb des Dreiecks. Abbildung 5 Aufbau des Detektors. Anhang I