Roche Applied Science Quantifizierungsstrategien mit dem LightCycler 480 PCR-Analysesystem

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1 Roche Applied Science Quantifizierungsstrategien mit dem LightCycler 480 PCR-Analysesystem

2 Inhalt Einleitung 3 Quantifizieren aber wie? 5 Quantifizierungsstrategien im Überblick 6 Absolute Quantifizierung Absolute Quantifizierung mit externen Standards, ohne bzw. mit interner Kontrolle 8 Relative Quantifizierung 13 Auswertung im Basic Modus 15 Auswertung im Advanced Modus 17 Auswertung im Advanced Modus mit Standards, ohne Calibrator 19 Auswertung im Advanced Modus mit Standards, mit Calibrator 21 Quantifizieren mit der Universal ProbeLibrary 23 Auswahl eines geeigneten Referenzgens für die Relative Quantifizierung 25 Einfluss der Effizienzkorrektur 27 Einfluss der Effizienzkorrektur bei der Relativen Quantifizierung 28 Anhang Möglichkeiten und Grenzen der Quantifizierung mit Multiplex-PCR 30 Definitionen 33 Weitere Applikationsfelder: Genotypisierung (SNP-Analyse) 36 Bestellinformationen 39 Nützliche Informationen, Tipps und Tricks zur Quantifzierung 43 2

3 Einleitung Eine Hauptanwendung des LightCycler PCR-Analysesystems von Roche Applied Science ist die Quantifizierung. Mit der Einführung des ersten LightCycler PCR-Analysesystems vor mehr als 10 Jahren haben wir neue Standards in der Quantifizierung gesetzt. Im Unterschied zur Endpunktanalyse ermöglicht die Real-Time-Messung die kinetische Quantifizierung. Damit analysieren Sie Ihre Daten in der log-linearen Phase bei konstanter Amplifikationseffizienz. Diese Broschüre gibt Ihnen einen Überblick über die vielfältigen Quantifizierungsstrategien. Allen gemeinsam ist die Datenanalyse in der log-linearen Phase. Je nachdem, welche Quantifizierungsstrategie Sie wählen, können Sie die Ergebnisse als absolute Werte (Absolute Quantifizierung) oder Verhältnisse (Relative Quantifizierung) darstellen. Weitere Unterschiede bestehen hinsichtlich Aufwand und Genauigkeit der Ergebnisse. Beide Methoden nutzen den Vorteil, dass die Fluoreszenz und die Menge des PCR-Produktes, das während der PCR akkumuliert wird, korrelieren. Fehlerrate bei unterschiedlichen PCR-Effizienzen: In den meisten Fällen erfolgt die PCR-Reaktion nicht mit der maximalen Effizienz, E = 2 (Verdopplung pro Zyklus). E ist abhängig von Sequenz, Fragmentlänge, PCR-Primer sowie Reinheit der Nukleinsäure. Wenn für die Kalkulation des Ergebnisses, basierend auf der Gleichung N = N o E n, trotzdem mit E = 2 gerechnet wird, obwohl tatsächlich abweichende PCR-Effizienzen vorliegen, ergeben sich folgende Fehler (in %): N = Anzahl der Moleküle im PCR-Zyklus n N o = Ausgangsmenge Moleküle E = Amplifikationseffizienz n = Zyklus, an dem das Signal aus dem Hintergrund tritt (Crossing Point) Fehlerrate bei unterschiedlicher PCR-Effizienz PCR-Effizienz (E) Detektionszyklen (n) ,00 1,97 16 % 35 % 57 % 70 % 83 % 1,95 29 % 66 % 113 % 142 % 175 % 1,90 67 % 179 % 365 % 500 % 678 % 1, % 376 % 937 % 1891 % 2161 % 1, % 722 % 2260 % 3900 % 6665 % 1, % 2480 % % % % Fehlerberechnung: (2 n /E n 1) x 100 = Fehler (in %), wobei n die Anzahl der Zyklen angibt Weichen die Effizienzen zwischen Target- und Referenzgen zum Beispiel um 0,05 voneinander ab, vervierfacht sich der Fehler von 175 % auf 678 % im Zyklus 40. 3

4 Roche Applied Science bietet inzwischen verschiedene Real-Time-PCR-Instrumente an: Mit den karussellbasierten LightCycler Systemen können Sie das Zielgen bereits auf vielfältige Art untersuchen. Eine Erweiterung der Möglichkeiten in Hinblick auf Probenzahlen und Analysemöglichkeiten bietet das Plattenformat des LightCycler 480 PCR-Analysesystems. Bis zu 384 Proben können in einem Lauf untersucht werden. Eine hervorragende Methode unbekannte oder bekannte SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu detektieren bietet die LightCycler 480 Gene Scanning Software. In Kombination mit dem High Resolution Melting (HRM)-Farbstoff kann so ein erfolgreiches Screening bekannter und unbekannter Mutationen durchgeführt werden. Untersuchung des Zielgens Vorkommen Exprimierte Mengen Varianten Identifizierung Ja/Nein Detektion Kopien/µl Vergleich mit Housekeeping- Genen Bekannt Unbekannt Schmelzkurve Absolute Quantifizierung Standardkurven Relative Quantifizierung Genotypisierung Schmelzkurven Endpunkt Gene Scanning mittels High Resolution Melting Kalibrator LightCycler 1.5 und 2.0 PCR-Analysesystem LightCycler 480 PCR-Analysesystem Applikationsmöglichkeiten der verschiedenen LightCycler PCR-Analysesysteme. Diese Broschüre bietet einen Überblick über die Möglichkeiten der Quantifizierung mit dem LightCycler 480 PCR-Analysesystem und dient dazu, Ihnen die Auswahl der für Sie besten Strategie zu erleichtern. Aufwand (z. B. Auswahl von Standards, Referenzgenen, Effizienzbestimmungen) sollten im Verhältnis zum Nutzen stehen (welche Aussage soll bei Ihrer Anwendung getroffen werden etc.). 4

5 Quantifizieren aber wie? Für die Real-Time-PCR sind eine Vielzahl von Quantifizierungsmethoden beschrieben worden, die sich hinsichtlich Erfordernissen, Komplexität und Reproduzierbarkeit unterscheiden. Prinzipiell ist es möglich, all diese Methoden zwei Hauptanalyse-Methoden zuzuordnen Absolute und Relative Quantifizierung. Die Entscheidung, welches die am besten geeignete Technik für Ihre Anwendung ist, hängt von der Komplexität der Analyse und der Form des Endergebnisses ab: Absolute Quantifizierung erlaubt die Quantifizierung einer einzelnen Target-Sequenz und gibt das Ergebnis als absoluten Wert (z. B. in Kopien/µl) an. Diese Analysen werden routinemäßig in der Virologie und Mikrobiologie durchgeführt. Relative Quantifizierung vergleicht die Mengen zwei verschiedener Target-Sequenzen in einer einzigen Probe (z. B. Target-Gen und Referenzgen) und gibt das Ergebnis als Verhältnis von Target zu Referenzgen an. Absolute Quantifizierung, S. 8 z. B. Bakterien und Viren Relative Quantifizierung, S. 13 z. B. mrna und Gendosis-Bestimmung Externe Standards ohne interne Kontrolle (Mono Color) S. 8 Externe Standards mit interner Kontrolle (Dual Color) S. 8 Basic Modus S. 15 Advanced Modus S. 17 C T -Methode E-Methode Angabe absoluter Mengen mit Einheit Angabe des rel. Verhältnisses (wahlweise mit oder ohne Calibrator) Target-Gen Referenzgen 5

6 Quantifizierungsstrategien im Überblick Absolute Quantifizierung mit externen Standards mit externen Standards und interner Kontrolle Seite 8 Anwendungen Quantifizierung z. B. von Bakterien und Viren Ergebnis wird angegeben als absolute Menge mit Einheit, z. B. Kopien, µg Referenzgen wird mitgeführt nein Format Standards SYBR Green I HybProbe Probes: Mono Color Hydrolysis Probes: Mono Color 3 5 (neue Standardkurve) 1 (importierte Standardkurve) HybProbe Probes: Dual Color Hydrolysis Probes: Dual Color Calibrator nein C P -Analyse Second Derivative Maximum Fit Point -Methode Kontrollen ja: positiv und negativ ja: positiv und negativ ja: interne Kontrolle Erfasster Konzentrationsbereich Mono Color: 10 log-stufen Dual Color: mind. 3 log-stufen Effizienz E Target = E Standard Korrektur nein: keine Korrekturen möglich ja: von falsch negativen Ergebnissen 6

7 Relative Quantifizierung Auswertung mit Basic Relative Quantification Analysis Auswertung mit Advanced Relative Quantification Analysis Anwendbar für optimierte Assays mit vergleichbarer Amplifikationseffizienz. Routine-Auswertungen, One Click to Result Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmung Standard-Einstellung Verhältnis Target-Gen zu Referenzgen und/oder Verhältnis Target-Gen zu Referenzgen normalisiert zu einem Calibrator. (Es werden grundsätzlich beide Verhältnisse abgebildet. Dies kann wahlweise über die Software ausgeblendet werden). Target und Referenz auf derselben Platte. Analyse nur ganzer Platten möglich. keine Standards Fit Point -Methode ja: Housekeeping-Gen single copy-gen SYBR Green I HybProbe Probes: Mono Color oder Dual Color Hydrolysis Probes: Mono Color oder Dual Color optional, aber empfehlenswert mind. 1 Well bei Dual Color-Anwendungen 1 Well/Gen bei Mono Color-Anwendungen ja: positiv und negativ Basiert auf Standardkurven. Analyse berücksichtigt die aktuelle PCR-Effizienz aller Targets und Referenzgene bei der Kalkulation des Ergebnisses. Ideal zur Analyse geringer Unterschiede in der Genexpression. Individuelle Auswertungen mit größter Flexibilität Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmung Verhältnis Target-Gen zu Referenzgen und Verhältnis Target-Gen zu Referenzgen normalisiert zu einem Calibrator. (Es werden grundsätzlich beide Verhältnisse abgebildet. Dies kann wahlweise über die Software ausgeblendet werden). Analyse komplexer Applikationen: hohe Flexibilität durch 4 verschiedene Pairing-Optionen. Target und Referenz auf derselben oder auf verschiedenen Platten. Analyse der ganzen Platte und/oder von Subsets möglich. wahlweise keine Standards wahlweise externe Standards wahlweise Standards im gleichen Lauf Second Derivative Maximum Fit Point -Methode E Target = E Referenz = 2 ( C T -Methode), Standard-Einstellung manuelle Eingabe der Effizienz aus virtuellen Standardkurven ( linear fit ) Mono Color: 10 log-stufen Dual Color: mind. 3 log-stufen volle Flexibilität und Genauigkeit in der Auswertung empfohlen: E = Effizienz aus echten Standardkurven linear fit non-linear fit E = 2 ja: von Nukleinsäurequalitäten (Inhibitoren etc.) von Lauf-zu-Lauf-Unterschieden (Referenzgen als endogene Kontrolle) von Variationen beim HybProbe Annealing, FRET-Effizienz etc. 7

8 Absolute Quantifizierung mit externen Standards, ohne bzw. mit interner Kontrolle Anwendung: Prinzip: Absolute Quantifizierung z. B. von Bakterien oder Viren Der einfachste Weg, die Konzentration eines Targets zu ermitteln, ist ein Vergleich des Crossing Points (Cp) einer unbekannten Probe mit definierten, bekannten, externen Standards. Dazu wird die PCR mit einer Verdünnungsreihe des Standards durchgeführt, die ihrerseits die unterschiedlichen Target-Gen-Konzentrationen repräsentieren. Die angegebenen Standardkonzentrationen jeder Verdünnung werden von der Software automatisch gegen die gemessenen Cp-Werte aufgetragen. Die resultierende Regressionsgerade (= Standardkurve) zeigt die Korrelation zwischen Cp-Werten und Konzentrationen. Die Software ermittelt anhand des Cp-Wertes der unbekannten Target-Gen-Probe automatisch dessen Konzentration durch Vergleich mit der Standardkurve. Die Target-Gen-Konzentration wird dann als absoluter Zahlenwert mit einer Einheit (z. B. Kopienzahl, µg DNA) angegeben. Target Fluoreszenz Zyklen Cp Fluoreszenz Cp Zyklen Cp Resultat absoluter Wert (z. B. Kopienzahl) Standards Zyklen Log-Konzentration Standardkurve Es kann mit einer internen Kontrolle gearbeitet werden. In diesem Fall wird die exogene Kontroll-DNA mit dem Target in einem Ansatz co-amplifiziert. Dazu werden die Proben mit der internen Kontrolle versetzt ( spiken ). Zur Unterscheidung von Target und interner Kontrolle ist eine Dual Color-Anwendung erforderlich. Weitere Infos: Technical Note 10/2003 (updated) Overview of LightCycler Quantification Methods Technical Note 11/2003 (updated) Absolute Quantification with External Standards Technical Note 12/2000 Absolute Quantification with External Standards and an Internal Control LightCycler Technical Notes: unter Literature and References 8

9 Absolute Quantifizierung ohne interne Kontrolle: Vorteile Ein absoluter Wert wird unter Angabe einer Einheit (z. B. Kopienzahl, µg) bestimmt. Standardkurven decken einen weiten Konzentrationsbereich ab (10 log- Stufen), so dass in einem Experiment sehr unterschiedlich exprimierte Proben analysiert werden können. Bei reproduzierbaren Experimenten kann die gleiche Standardkurve wiederholt verwendet werden. Ein Wert der Standardkurve wird bei jedem neuen Experiment mitgeführt und mit der importierten Standardkurve abgeglichen. Wahlweise kann das SYBR Green I-, HybProbe Probes- oder Hydrolysis Probes-Format gewählt werden. Einschränkungen Die Standardkurve muss die gleiche PCR-Effizienz aufweisen wie die zu analysierenden Proben. Wenn ohne interne Kontrolle gearbeitet wird, können inhibitorische Effekte in den PCR-Proben nicht erkannt werden. Inhomogenitäten zwischen den Proben (z. B. Nukleinsäurequalität) können im Gegensatz zur Relativen Quantifizierung nicht korrigiert werden. Absolute Quantifizierung mit interner Kontrolle: Vorteile Die interne Kontrolle dient als Indikator für die Qualität der PCR, so dass falsch negative Ergebnisse vermieden werden. Ein absoluter Wert wird unter Angabe einer Einheit (z. B. Kopienzahl, µg) bestimmt. Bei reproduzierbaren Experimenten kann die gleiche Standardkurve wiederholt verwendet werden. Ein Wert der Standardkurve wird bei jedem neuen Experiment mitgeführt und mit der importierten Standardkurve abgeglichen. Sowohl das HybProbe Probes- als auch das Hydrolysis Probes-Format bieten die Möglichkeit, simultan Target-Gen und interne Kontrolle in einem Well zu detektieren. Wird die interne Kontrolle bereits zur unaufgereinigten Probe zugegeben und erfährt anschließend die Aufreinigung gemeinsam mit der Target- Gen-DNA, so kann die Performance der Aufreinigung mit überprüft werden. Einschränkungen Die Standardkurve muss die gleiche PCR-Effizienz aufweisen wie die zu analysierenden Proben. Der Konzentrationsbereich ist auf ca. 3 log-stufen begrenzt (vgl. Anwendungsbeispiel S. 11 und Anhang S. 30). Die interne Kontrolle sollte möglichst in Sequenz und PCR-Effizienz dem Target-Gen ähnlich sein. Inhomogenitäten zwischen den Proben (z. B. Nukleinsäurequalität) können im Gegensatz zur Relativen Quantifizierung nicht korrigiert werden. 9

10 Anwendungsbeispiel 1: PCR-Ansätze: Absolute Quantifizierung ohne interne Kontrolle Nachweis von Bordetella pertussis in biologischem Probenmaterial für Forschungszwecke 7 externe Standards (Duplikate) Positionen A 1 12 und B Negativkontrolle Position B 6 3 unbekannte Proben Positionen B 3 5 Mono Color/HybProbe Probes Detektionsformat: Fluoreszenzsignale im Kanal nm (Target-Gen): Unbekannte Proben Die Daten wurden freundlicherweise von Dr. Udo Reischl, Universität Regensburg zur Verfügung gestellt. Auswertung: Second Derivative Maximum -Methode Die Konzentration wird für jede Probe automatisch von der LightCycler 480 Software ermittelt. Ergebnis: Unter Concentration werden die für Probe und Standard ermittelten Werte als Genomäquivalente angegeben. Die Probe 1 enthält in diesem Beispiel 1,23 x 10 5 Genomäquivalente der Target-DNA. 10

11 Anwendungsbeispiel 2: PCR-Ansätze: Absolute Quantifizierung mit interner Kontrolle Das folgende Experiment ist Teil des LightCycler 480 Control Kits und kann zur Funktionalitätsüberprüfung des Systems verwendet werden. Dabei wird ein 136bp- Fragment des Cyp2C9-Gens, das in eine Plasmid DNA kloniert ist, amplifiziert und mit Hilfe einer FAM-markierten Hydrolysis Probe detektiert. Gleichzeitig wird ein weiteres DNA-Target jeder Reaktion in konstanter Konzentration zugesetzt und über eine LightCycler Red 610-markierte Sonde nachgewiesen. Diese interne Kontrollreaktion dient der Validierung der negativen Proben. 3 negative Kontrollen ohne Template, aber mit interner Kontrolle Positionen A x 3 externe Standards für die Quantifizierung mit interner Kontrolle Positionen B, C, D, E, F unbekannte Proben mit interner Kontrolle Positionen A 18, B 18, C 19, D 19 Im Kanal nm werden die unbekannten Proben und die Standards detektiert. Simultan wird im Kanal 610 nm die interne Kontrolle nachgewiesen. Da es sich um eine kompetitive PCR handelt, lässt sich die interne Kontrolle nur bei schwachen oder negativen unbekannten Proben nachweisen. Ist eine Probe im Kanal nm negativ, muss diese im Kanal nm betrachtet werden, um eine Aussage treffen zu können (siehe Gesamtergebnis aus beiden Kanälen). Fluoreszenzsignale im Kanal nm (Target-Gen): 11

12 Auswertung: Ergebnis im Kanal nm: Second Derivative Maximum -Methode Die Konzentration wird für jede Probe automatisch von der LightCycler 480 Software ermittelt. Unter Concentration werden die für Probe und Standard ermittelten Werte als Kopien angegeben. Die Probe C 19 enthält beispielsweise 2,2 x 10 3 Kopien. Die PCR-Effizienz ist mit E = 2 optimal. Fluoreszenzsignale im Kanal nm (interne Kontrolle): Ergebnis im Kanal nm: Gesamtergebnis aus beiden Kanälen: Alle negativen Kontrollen ohne Template, aber mit interner Kontrolle sind positiv (Proben A 15 17). In allen unbekannten Proben und Standards mit geringeren Konzentrationen lässt sich die interne Kontrolle positiv nachweisen (A 18, B 18, C 19, D 19). Bei den Standards mit hohen Konzentrationen wird die interne Kontrolle auf Grund der Kompetition unterdrückt (E und F 15 17). unbekannte Probe interne Kontrolle Ergebnis bezogen auf Kanal nm Kanal nm die unbekannten Proben im Beispiel positiv positiv positiv (Proben A 18, B 18, C 19, D 19) negativ positiv negativ (Proben A 15 17) positiv negativ positiv (E 15 17, F 15 17) negativ negativ falsch negativ (in diesem Beispiel keine Probe) Bei einer Multiplex-PCR verkleinert sich der dynamische Bereich. In diesem Beispiel umfasst er dank optimierter LightCycler Reagenzien 5 log-stufen (vgl. Standardkurven im Kanal nm). Die interne Kontrolle kann auch so eingestellt werden, dass sie nur bei geringen Konzentrationen der unbekannten Proben nachgewiesen werden kann, in der Regel liegt sie eine log-stufe über der Nachweisgrenze. Bei stark positiven Proben kann die interne Kontrolle wegen Kompetition nicht immer detektiert werden (siehe Anhang S. 30). 12

13 Relative Quantifizierung Anwendungen: Prinzip: RNA-Level: mrna-expressionsstudien DNA-Level: Gendosis-Bestimmungen Relative Quantifizierung wird üblicherweise in solchen Applikationen angewendet, in denen Veränderungen der Genexpression bzw. der Genomzahl in Proben miteinander verglichen werden. Bei der Relativen Quantifizierung werden die Level von zwei verschiedenen Target- Sequenzen (Target-Gen, das analysiert wird, und Referenzgen) in den jeweiligen Proben verglichen und das Ergebnis als Verhältnis dieser Gene dargestellt. D. h., das Ergebnis ist eine relative, dimensionslose Zahl, die nur zum Vergleich mit anderen Proben geeignet ist. Bei dem Referenzgen handelt es sich um ein konstitutiv exprimiertes Gen oder Housekeeping-Gen, das eine konstante Kopienzahl unter allen getesteten Bedingungen zeigt und nicht reguliert ist. Dieses Referenzgen, eine endogene Kontrolle, bietet die Basis für die Normalisierung von Unterschieden zwischen den einzelnen Proben. Relative Quantifizierung Basic Modus Advanced Modus C T -Methode E-Methode Die LightCycler 480 Software bietet die Möglichkeit zwischen zwei verschiedenen Analysemethoden zu unterscheiden: Auswertung mit dem Basic Modus Auswertung mit dem Advanced Modus Die Wahl zwischen den beiden Analysemodi hängt im Wesentlichen davon ab, ob die Amplifikationseffizienz der untersuchten Gene vergleichbar oder verschieden ist. 13

14 Basic Modus: Vorteile Einfache Auswertungen One Click to Result. Anwendbar für optimierte Assays mit vergleichbarer Amplifikationseffizienz. Einschränkungen Target und Referenz befinden sich auf derselben Platte. Nur ganze Platten können analysiert werden. Nur Fit Point -Methode ist möglich. Tatsächliche Amplifikationseffizienz wird nicht berücksichtigt (theoretische Annahme E = 2). Advanced Modus: Vorteile Effizienzkorrektur basiert auf Standardkurven: Analyse berücksichtigt die aktuelle PCR-Effizienz aller Targets und Referenzgene bei der Kalkulation des Ergebnisses. Target und Referenz befinden sich auf derselben oder auf verschiedenen Platten. Analyse der ganzen Platte und/oder von Subsets ist möglich. Ideal zur Analyse geringer Unterschiede in der Genexpression. Individuelle Auswertungen mit größter Flexibilität. Effizienzkorrektur ist möglich (nicht-lineare Kurven bei schwachen Signalen bzw. hohen Verdünnungen). Mehrere Referenzgene können analysiert werden. Sowohl Fit Point - als auch Second Derivative Maximum -Methode sind möglich. 14

15 Relative Quantifizierung: Auswertung im Basic Modus Anwendungen: Prinzip: Anwendbar für optimierte Assays mit vergleichbarer Amplifikationseffizienz, einfache Auswertungen mit One Click to Result. Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmungen Der Basic Modus nutzt die C T -Methode zur schnellen Kalkulation der Real- Time-PCR-Ergebnisse. Bei dieser Auswertung setzt die Software automatisch die Effizienz von Target und Referenz gleich 2. Alternativ besteht die Möglichkeit die Effizienz manuell einzustellen (z. B. auf E = 1,87). Relative Quantifizierung und Auswertung im Basic Modus: Vorteile Schnelle und einfache Analyse eines oder mehrerer Target- und Referenzgene. Einschränkungen Pairing von Target zu Referenzgen kann nur in dem Modus All-to- Mean erfolgen. D. h., jedes Target wird mit dem Mittelwert der Referenzgene gepaart (siehe S. 34). Die Effizienz wird nicht mit Standards ermittelt, sondern bei der C T -Methode gleich 2 gesetzt. Es kann nur eine ganze Platte analysiert werden. Target- und Referenzgen müssen sich auf derselben Platte befinden. Weitere Infos: Manual LightCycler 480 Instrument Broschüre Guidelines für Real-Time-PCR Anwendungsbeispiel: PCR-Ansätze: Relative Quantifizierung von 2 Target-Genen (Cathepsin B und Cyp2C9) in verschiedenen humanen Gewebetypen. Als Referenzgene werden PBGD und -Actin verwendet. Alle Assays wurden mit Hilfe der ProbeFinder Software erstellt und verwenden FAM-markierte UniversalProbe Library-Sonden. jeweils 3 Replikate 1 x Calibrator Target 1 (Cathepsin B) Position G x Calibrator Target 2 (Cyp2C9) Position G x Calibrator Referenz 1 (PBGD) Position H x Calibrator Referenz 2 ( -Actin) Position H x unbekannte Probe Target 1 (Cathepsin B) Position A, B, C x unbekannte Probe Target 2 (Cyp2C9) Position A, B, C x unbekannte Probe Referenz 1 (PBGD) Position D, E, F x unbekannte Probe Referenz 2 ( -Actin) Position D, E, F negative Kontrolle Target 1 (Cathepsin B) Position A, B, C 6 1 negative Kontrolle Target 2 (Cyp2C9) Position A, B, C 12 15

16 Hinweis: Detektionsformat: Da bei einer Auswertung im Basic Modus immer ganze Platten analysiert werden, müssen alle ungenutzten Positionen mit unassigned gekennzeichnet werden. Mono Color Hydrolysis Probe / UPL Probe Auswertung: Ergebnis: Fit Point -Methode Pairing: all-to-mean E = 2 (theoretische Annahme!) Alle Proben befinden sich auf der gleichen Platte. Die log-darstellung des Balkendiagramms dient als Überblick über das gesamte Experiment. Hier werden die normalisierten Werte als Balken abgebildet. Eine Übersicht über die einzelnen Kurven findet sich in der Sample-View-Darstellung. In dem vorhandenen Beispiel ist die Probe A 2 (Target 1) gegenüber dem Calibrator 2,9-fach stärker exprimiert (siehe Ergebnistabelle). 16

17 Relative Quantifizierung: Auswertung im Advanced Modus Anwendungen: Prinzip: Ideal zur Analyse geringer Unterschiede in der Genexpression. Individuelle Auswertungen mit größter Flexibilität und Genauigkeit sind möglich. Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmungen (mit einem single copy-gen als Referenzgen) Der Advanced Modus ermöglicht eine Vielzahl von individuellen Auswerteeinstellungen. Bevor eine Relative Quantifizierung im Advanced Modus durchgeführt wird, muss entschieden werden, welche Effizienz für Target und Referenz genutzt werden soll: Empfohlen wird die sogenannte E-Methode, um selbst geringe Unterschiede zwischen den Proben nachweisen zu können. Basis hierfür sind Standardkurven, jeweils für Target und Referenzgen (in mehreren Verdünnungsstufen). Ausgehend von diesen Daten kalkuliert die Software die tatsächliche PCR- Effizienz jedes Gens. Im Beispiel A beträgt die Effizienz E = 2,067 ( linear fit ); im Beispiel B ist E = 1,917 ( non-linear fit ). Weitere Infos: Manual LightCycler 480 Instrument Broschüre Guidelines für Real-Time-PCR 17

18 Relative Quantifizierung und Auswertung im Advanced Modus: Vorteile Flexible Auswertemöglichkeiten. Second Derivative Maximum - Methode bietet wahlweise zwei Algorithmen an, unterschiedlich optimiert auf verschiedene Fragestellungen: a) Der Algorithmus High Confidence ist speziell optimiert für Kurven mit deutlichem Fluoreszenzanstieg und hohem Signal-zu- Hintergrund-Verhältnis. Diese Methode reduziert drastisch die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Cp-Werte. Sie sollte bei allen Experimenten mit Color Compensation angewendet werden. b) Der Algorithmus High Sensitivity ist speziell optimiert für Kurven mit schwachem Fluoreszenzanstieg und geringem Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis. Daher ist diese Methode besonders für den Nachweis von geringen Mengen oder single copy-targets geeignet. Die Verwendung von Standardkurven ermöglicht es tatsächliche Effizienzen bei der Auswertung zu berücksichtigen und damit exakte Ergebnisse zu erhalten. Zudem erfolgt eine Effizienzkorrektur (z. B. durch non-linear fit ; Abb. S. 17). Es können die ganze Platte oder einzelne Subsets ausgewertet werden. Target- und Referenzgen müssen sich nicht auf derselben Platte befinden. Die Analyse komplexer Anwendungen kann in vier verschiedenen Pairing-Modi von Target und Referenz erfolgen: one-to-one, all-tomean, all-to-all, mean-to-all (siehe S. 34). Einschränkungen Relative Standards sind erforderlich, falls tatsächliche Effizienzen berücksichtigt werden sollen. Es besteht die Möglichkeit, die Effizienz gleich 2 zu setzen. Dadurch entfallen aber die Vorteile der größeren Genauigkeit, wie sie bei der Verwendung von relativen Standards umgesetzt sind. Bei der Verwendung des High Sensitivity -Algorithmus (siehe links) besteht ein gewisses Risiko der Detektion von falsch-positiven Cp- Werten. Daher sollten die Ergebnisse dieser Auswertung immer im Detail analysiert werden. 18

19 Relative Quantifizierung: Auswertung im Advanced Modus mit Standards, ohne Calibrator Anwendungen: Prinzip: Ideal zur Analyse geringer Unterschiede in der Genexpression. Individuelle Auswertungen mit größter Flexibilität und Genauigkeit sind möglich. Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmungen (mit einem single copy-gen als Referenzgen) Mit Hilfe externer Standards werden die absoluten Mengen von Target-Gen und Referenzgen aus dem gleichen Probenmaterial kalkuliert. Die Target-Gen-Konzentration wird dabei als relative Menge (ohne Angabe einer Einheit) gegenüber dem Referenzgen angegeben: Target-Gen Referenzgen Das Referenzgen darf nicht reguliert sein. Relative Quantifizierung und Auswertung im Advanced Modus, ohne Calibrator: Vorteil Effizienzkorrektur ist möglich. Einschränkungen Erstellung von relativen Standards ist erforderlich, damit tatsächliche Effizienzen berücksichtigt werden können. Normalisierung ist nicht möglich, eingeschränkte Vergleichbarkeit von verschiedenen Experimenten. Anwendungsbeispiel: Relative Quantifizierung von einem Target-Gen (GOI) mit einem Referenzgen (HKG) in 6 verschiedenen Proben. Zur Effizienzkorrektur wurden relative Standardkurven (1:10-Verdünnungen) angesetzt. PCR-Ansätze: jeweils Doppelbestimmungen 6 x unbekannte Probe Target (GOI) Position A D 1, 2, 4, 5 6 x unbekannte Probe Referenz (HKG) Position A D 8, 10, 13, 14 6 x Standard Target (GOI) Position E P 19 6 x Standard Referenz (HKG) Position E P 20 1 negative Kontrolle Target (GOI) Position C 19 1 negative Kontrolle Referenz (HKG) Position D 19 19

20 Detektionsformat: SYBR Green I # 2 # 5 Amplifikationskurven für Target- und Referenzgen Auswertung: Ergebnis: Second Derivative Maximum -Methode Pairing: all-to-mean In-Run-Standards zur Effizienzberechnung Target und Referenz befinden sich auf der gleichen Platte. Die log-darstellung des Balkendiagramms dient als Überblick der Ergebnisse des gesamten Experiments. Hier werden die Verhältnisse Target/Referenz als Balken abgebildet. Für das normalisierte Verhältnis wird kein Wert angezeigt, da kein Calibrator verwendet wurde. In diesem Beispiel ist das Target in Probe # 2 am stärksten und in Probe # 5 am schwächsten exprimiert. Über den Karteireiter Target Name Tab gelangt man zu den Standardkurven von Target bzw. Referenzgen. Wie aus der Abbildung ersichtlich liegt für das Target GOI ein nicht-linearer Fit vor und die Effizienz beträgt 1,88, was durch die Verwendung des Advanced Modus berücksichtigt wird. Da der Cp-Wert des Targets GOI für Probe # 5 außerhalb der Standardkurve liegt, erscheint in der Ergebnistabelle oben eine Warnmeldung, dass der ermittelte Wert extrapoliert wurde. Die PCR-Produkte wurden zudem in einer Schmelzkurvenanalyse überprüft. 20

21 Relative Quantifizierung: Auswertung im Advanced Modus mit Standards, mit Calibrator Anwendungen: Prinzip: Ideal zur Analyse feiner Unterschiede in der Genexpression. Individuelle Auswertungen mit größter Flexibiltät und Genauigkeit sind möglich. Quantifizierung von mrna Gendosis-Bestimmungen (mit einem single copy-gen als Referenzgen) Auswertung und Vergleich verschiedener Einzelexperimente Für jedes Target-Gen und Referenzgen wird die relative Menge bestimmt. Zur Kalkulation der Daten werden ausschließlich die Crossing Points (Cp) einbezogen, die von der Software automatisch ermittelt werden. Das Ergebnis der Calibratornormalisierten Relativen Quantifizierung ist eine Funktion der PCR-Effizienz und der Bestimmung der Crossing Points. N = N o E n N = Anzahl der Moleküle im PCR-Zyklus n N o = Ausgangsmenge Moleküle E = Amplifikationseffizienz n = Zyklus, an dem das Signal aus dem Hintergrund tritt (Crossing Point) Die Effizienz-korrigierte Relative Quantifizierung wird automatisch von der LightCycler 480 Software durchgeführt. Dabei greift die Software auf sogenannte relative Standardkurven zurück, die die PCR-Effizienz des Target- und Referenzgens beschreiben. Durch den Calibrator werden unterschiedliche Detektionssensitivitäten korrigiert. Bei dem Calibrator handelt es sich um eine positive Vergleichsprobe mit einem stabilen Verhältnis von Target- zu Referenzgen. Sie dient zur Normalisierung aller Proben innerhalb eines Laufs und als konstanter Kalibrierungspunkt zwischen mehreren LightCycler PCR-Läufen. Die Effizienz der PCR von Target- und Referenzgen muss von PCR-Lauf zu PCR- Lauf konstant sein, aber nicht identisch. Über die Funktionen der LightCycler 480 Software werden die Werte hinsichtlich von Effizienzunterschieden über einen breiten Konzentrationsbereich korrigiert. Die Ergebnisse werden als Verhältnis Probe zu Calibrator wie folgt ausgedrückt: Target-Gen (Probe) Referenzgen Target-Gen (Calibrator) Referenzgen Relative Quantifizierung und Auswertung im Advanced Modus, mit Calibrator: Vorteile Effizienzkorrektur ist möglich. Normalisierung aller Proben verschiedener Einzelexperimente. Korrektur von Lauf-zu-Lauf- und von Chargen-Unterschieden der Reagenzien und Primer. Einschränkung Erstellung von relativen Standards ist erforderlich, damit tatsächliche Effizienzen berücksichtigt werden können. 21

22 PCR-Ansätze (in Replikaten): Relative Quantifizierung eines Targets in 4 verschiedenen Proben normalisiert mit einem Calibrator. 1 x Calibrator Target Position O 11 O 15 1 x Calibrator Referenz Position P 11 P 15 4 x unbekannte Probe Position Target H 1 H 20 4 x unbekannte Probe Position Referenz I 1 I 20 negative Kontrolle Target Position H 21 H 24 negative Kontrolle Referenz Position I 21 I 24 Anwendungsbeispiel: Detektionsformat: Mono Color Hydrolysis Probe / UPL Probe Auswertung: Second Derivative Maximum -Methode Pairing: all-to-mean In-Run-Standards zur Effizienzberechnung Target und Referenz befinden sich auf der gleichen Platte. Ergebnis: Das relative Konzentrationsverhältnis des Calibrators beträgt in diesem Beispiel 0,14. Durch die Calibrator-Normalisierung (Formel siehe S. 33) ergibt sich für den Calibrator definitionsgemäß ein normalisiertes Verhältnis von 1,00. Da die unbekannte Probe 1 ebenfalls das relative Konzentrationsverhältnis 0,14 aufweist, ergibt sich ebenfalls ein normalisiertes Verhältnis von 1,00. In Probe 2 beträgt die relative Target-Konzentration im Vergleich zum Calibrator nur 0,1 und ist damit etwa 10-fach schwächer exprimiert. In Probe 3 ist das Target etwa 3,5-fach stärker exprimiert als in der Calibrator-Probe. In Probe 4 ist das Target nicht exprimiert (kein Cp-Wert in Spalte Target ). Deshalb werden die Verhältnisse von der Software auf 0 gesetzt. 22

23 Quantifizieren mit der Universal ProbeLibrary Anwendungen: Genexpressionsanalysen und Gendosis-Bestimmungen Prinzip: Die komplette Universal ProbeLibrary (UPL) basiert auf 165 kurzen Hydrolysis Probes mit einer Länge von 8 oder 9 Nukleotiden. Wie aus der Abbildung ersichtlich, werden die erforderlichen hohen Schmelztemperaturen und Spezifitäten der Sonden durch die Verwendung der Locked Nucleic Acid (LNA) Nukleotid-Chemie erreicht. Durch die sorgfältige Auswahl der 165 Universal ProbeLibrary-Sonden kann jede Sonde an über 7000 Transkripte eines Genoms hybridisieren. Jedes Transkript enthält Bindestellen für durchschnittlich 19 verschiedene Universal ProbeLibrary-Sonden, so dass für jedes Gen mehrere intron-überspannende Assays erstellt werden können. Perfect Match Single Mismatch O O B 3 -ACGACCAC-5 3 -ACGGCCAC-5 T m O O P O O LNA 8-mer 5 -TGCTGGTG-3 71 C 45 C 26 C O O B O B O O O O P O O P O DNA 8-mer 5 -TGCTGGTG-3 35 C 25 C 10 C Abb.: Mit Hilfe der LNA-Technologie wird die hohe Schmelztemperatur und Spezifität der Universal ProbeLibrary-Sonden erreicht. Die hohe Spezifität der Assays wird durch die sorgfältige Kombination der spezifischen Primer und den Universal ProbeLibrary-Sonden sichergestellt. Durch die Markierung der Sonden mit Fluorescein (FAM) am 5 Ende und einem nicht fluoreszierenden Quencher am 3 Ende können die Universal ProbeLibrary-Sonden auf allen LightCycler Real-Time-PCR-Systemen verwendet werden. Die schnelle und effiziente Assay-Erstellung erfolgt online im Universal ProbeLibrary Assay Design Center. Spezifität Sondenformat Universal ProbeLibrary SYBR Green I* Flexibilität * und andere Assays auf Basis interkalierender Farbstoffe. 23

24 Universal ProbeLibrary: Vorteile Die Genom-spezifischen Universal ProbeLibrary Sets mit je 90 UPL-Sonden oder die gesamte Universal ProbeLibrary mit 165 Einzelsonden ermöglichen weit mehr als 5 Millionen Real-Time-PCR-Assays mit Abdeckungsraten von % aller Transkripte eines Genoms. Durch die Kombination der FAM-markierten UPL-Assays mit den LightCycler Yellow 555 markierten Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays in Duplex- Experimenten können zusätzlich Zeit und Kosten eingespart werden. Durch die relativ geringe Zahl der Sonden kann die Universal ProbeLibrary bequem in jedem Gefrierschrank für die sofortige Verfügbarkeit gelagert werden. Dadurch entfallen Wartezeiten für die Lieferung von markierten PCR-Sonden, was eine hohe Flexibilität und Unabhängigkeit bei der Erstellung der Assays gewährleistet. Die kostenfreie, schnelle und einfach zu bedienende ProbeFinder Software erlaubt die Erstellung von vielen verschiedenen intron-überspannenden Assays. Alle Details der Assays wie Primer- und Sondensequenzen, Position und Größe der Amplikons und eine Vielzahl von Ranking-Optionen werden bereitgestellt. Außerdem entfällt die zeitaufwendige Assay-Optimierung, da alle Assays und Duplexkombinationen mittels in silico PCR Algorithmen prävalidiert werden und das gleiche Standardprotokoll verwenden. RealTime ready Focus Panels: Neben den Universal ProbeLibrary-Sonden für die individuelle Assay-Erstellung bietet Roche Applied Science auch gebrauchsfertige RealTime ready PCR-Assays an. Diese validierten qpcr-assays sind beispielsweise als Focus Panels für bestimmte Forschungsgebiete oder Genklassen erhältlich. Weitere Infos: Broschüre Universal ProbeLibrary, Guide to Successful PCR Assays Special Interest Site:

25 Auswahl eines geeigneten Referenzgens für die Relative Quantifizierung Nur bei Verwendung eines geeigneten Referenzgens können mit Hilfe der Relativen Quantifizierung aussagekräftige, biologisch relevante Ergebnisse erzielt werden. Daher spielt die sorgfältige Auswahl der Referenzgene eine enorm wichtige Rolle im gesamten Quantifizierungsprozess und kann oft mehr Zeit in Anspruch nehmen als die Messung der Proben an sich. Als Referenzgene werden in der Regel sogenannte Housekeeping-Gene eingesetzt. Housekeeping-Gene kodieren für Proteine des Grundstoffwechsels und sind daher für die Funktionalität einer Zelle unentbehrlich. Theoretisch sollten diese Gene konstitutiv und in allen Proben in der gleichen Menge exprimiert werden. Der Expressionslevel sollte im vorliegenden experimentellen System also nicht durch die verschiedenen Versuchsbedingungen beeinflusst werden. Außerdem sollte das Referenzgen nach Möglichkeit keine Pseudogene aufweisen und ähnlich stark exprimiert sein wie das zu untersuchende Target-Gen. Zunächst sollte eine Literaturrecherche zur Vorselektion geeigneter Referenzgene durchgeführt werden. Dabei wird empfohlen, dass möglichst mehrere Housekeeping-Gene ausgewählt werden, die in unterschiedlichen zellulären Prozessen angesiedelt sind. Anschließend müssen die vorselektierten Gene in einem Validierungsexperiment darauf getestet werden, ob sie unter den individuellen Versuchsbedingungen wirklich konstitutiv exprimiert werden. Dazu bieten sich generell zwei Möglichkeiten an: A) Eine Absolute Quantifizierung des Target-Gens und der Referenzgen-Kandidaten in unterschiedlichen Proben (z. B. behandelte/unbehandelte Zellen): Als Ergebnis erhält man die absolute Kopienzahl der Haushaltsgene in den verschiedenen Proben, die nur dann konstant ist, wenn das entsprechende Housekeeping-Gen unter den gegebenen Versuchsbedingungen nicht reguliert ist. Da für die Absolute Quantifizierung zunächst Standards mit bekannter Konzentration generiert werden müssen, ist diese Art der Validierung mit sehr hohem Aufwand verbunden. B) Eine Relative Quantifizierung des Target-Gens mit mehreren Referenzgen-Kandidaten in unterschiedlichen Proben (z. B. behandelte/unbehandelte Zellen): Als Ergebnis erhält man die probenspezifischen Verhältnisse Target/Referenzgen. Sind nun unter den Kandidaten nicht regulierte Referenzgene enthalten, müssen diese in allen Proben das gleiche Muster im Target/Referenzgen-Verhältnis zeigen. Für die Auswertung eines solchen Experiments bieten sich verschiedene Internetprogramme an, z. B. genorm (Vandesompele et al., Genome Biol. 2002, Jun 18; 3), Hinweis: Für die Selektion eines geeigneten humanen Housekeeping-Gens bieten sich neben dem Universal ProbeLibrary Set, Human Reference Gene Assays, auch das RealTime ready Human Reference Gene Panel an. Mit Hilfe dieses Panels können beispielsweise 19 typische humane Housekeeping-Gene in 4 unterschiedlichen Proben effizient auf einer Platte untersucht werden. Damit eignet sich dieses Panel optimal für die Validierung nach Vandesompele et al. Neben der Verwendung eines einzelnen geeigneten Housekeeping-Gens bietet es sich an, mehrere Referenzgene zu verwenden und das Verhältnis des Target-Gens zum Mittelwert der Referenzgene zu bestimmen. Dadurch werden mögliche Abweichungen bei einem einzelnen Referenzgen kompensiert. 25

26 Anwendungsbeispiel für A: Es soll eine Relative Quantifizierung des Target-Gens IFN- in Makrophagen nach Behandlung der Zellen erfolgen. Die beiden Housekeeping-Gene HPRT und 2M sollen mit Hilfe einer Absoluten Quantifizierung auf ihre Eignung als Referenzgen evaluiert werden. Dazu werden für alle drei Gene mit Hilfe von in vitro RNA- Transkripten-Standardkurven erstellt und die absolute Kopienzahl der Gene in einer definierten RNA-Menge bestimmt. absolute Gen-Expressionshöhe IFN- : Target-Gen HPRT: Referenzgen-Kandidat 2M: Referenzgen-Kandidat Ø + LPS + Dexamethason Makrophagen-Zellen ohne bzw. mit Behandlung Ergebnis: Nur HPRT zeigt die gleiche absolute Expressionshöhe unter allen Versuchsbedingungen und eignet sich daher für diese Fragestellung als Referenzgen. Anwendungsbeispiel für B: Relative Quantifizierung des Target-Gens IFN- in Makrophagen nach Behandlung der Zellen. Die Housekeeping-Gene HPRT, 2M und PBGD werden mit Hilfe einer Relativen Quantifizierung auf ihre Eignung als Referenzgen evaluiert. IFN- /HPRT Relatives Verhältnis IFN- / 2M IFN- /PBGD Ø + LPS + Dexamethason Makrophagen-Zellen ohne bzw. mit Behandlung Ergebnis: HPRT und PBGD zeigen dasselbe Muster im relativen Target/Referenzgen- Verhältnis. Da beide Gene in der Zelle zudem unterschiedliche Funktionen besitzen, kann daraus geschlossen werden, dass diese beiden Kandidaten nicht reguliert sind und sich als Referenzgene eignen. 26

27 Einfluss der Effizienzkorrektur Die Qualität einer Real-Time-PCR lässt sich mit Hilfe der Effizienz bestimmen. Die PCR-Effizienz beschreibt wie komplett das Amplikon in jedem Zyklus amplifiziert wird. Qualitativ hochwertige PCRs haben eine Effizienz von 2, d. h., in jedem Zyklus wird die Anzahl der Zielmoleküle verdoppelt (100%ige Verdopplung). Unglücklicherweise ist die PCR-Effizienz sehr empfindlich gegenüber den variablen Reaktionskomponenten wie Primer, Probenvorbereitung etc. Konsequenterweise bedeutet dies, dass zwei PCR-Reaktionen nicht unbedingt die gleiche PCR-Effizienz aufweisen. Zahlreiche Optimierungsstrategien für eine PCR sind beschrieben. Nicht jede PCR kann aber soweit optimiert werden, dass die maximale Effizienz von 2 erreicht wird. Sogenannte schwierige Templates, wie beispielsweise GC-reiche Targets, reduzieren die PCR-Effizienz. Daher gilt die allgemeine Empfehlung, dass die PCR soweit wie möglich optimiert werden und die Effizienz E > 1,8 sein sollte. Probe Proben-Vorbereitung Präparations-Methode, Nukleinsäure-Stabilität und Lagerung DNA/RNA Nukleinsäure-Isolierung Isolierungsmethode, Reinheit, Ausbeute, Lagerung cdna Reverse Transkription Amplifikation Effizienz, Ausbeute, Enzymunterschiede, Primer, Reaktionsbedingungen Produkt Detektion Detektionsmethode, Linearität des Assays Ergebnis Analyse Algorithmus, Cp-Werte, Statistik Einflussfaktoren auf die PCR-Effizienz Bestimmung der PCR-Effizienz: Als gut etablierte Methode zur Bestimmung der PCR-Effizienz wird die Standardkurven-Methode (in einigen Publikationen auch Kalibrierungskurven- Methode genannt) empfohlen. Eine frische Verdünnungsreihe von einer Standardkurve wird angefertigt und in einer Real-Time-PCR analysiert. Die Steigung der Standardkurve, d. h. der Abstand von einem Cp einer Verdünnung zum nächsten, kann mit Hilfe der Formel E = 10 1/slope kalkuliert werden. Die Cp-Werte von Proben, die sich in der Konzentration um den Faktor 10 voneinander unterscheiden, sind 3,3 Zyklen voneinander getrennt (bei einer optimalen Effizienz von 2). Abstand zwischen Cp beträgt 3,24. E = 10 1/slope E = 10 1/ 3,395 E = 1,97 27

28 Einfluss der Effizienzkorrektur bei der Relativen Quantifizierung Ohne Effizienzkorrektur: Bei der Auswertung werden keine Standardkurven benötigt. Es gilt die Annahme: PCR-Effizienzen von Ziel- und Referenzgen sind identisch und optimal (E = 2). Diese Methode eignet sich eher für ungefähre Berechnungen, wie beispielsweise bei Screening-Experimenten. Bei einer Berechnung mit Effizienzkorrektur werden Ergebnisse mit maximaler Genauigkeit erzielt. Die PCR-Effizienzen von Ziel- und Referenzgen werden jeweils berücksichtigt (E = korrigiert). Relative Standardkurven werden zur Ermittlung der Konzentrationsverhältnisse von Ziel- zu Referenzgen genutzt. Mit Effizienzkorrektur: Anwendungsbeispiel 1: RNA wird in unterschiedlichen Konzentrationen (1,6 ng; 8 ng; 40 ng) in eine LightCycler PCR eingesetzt. Probenmaterial Verhältnisse der Proben (Target/Referenz) zum Calibrator (Target/Referenz): Auswertung mit der LightCycler 480 Software RNA ohne Effizienzkorrektur Effizienzkorrektur Effizienzkorrektur mit linear fit - mit non-linear fit - Funktion Funktion 40 ng 1,03 1,18 1,44 8 ng 2,21 1,79 1,01 1,6 ng 6,00 4,17 1,17 Mittelwert 3,08 2,38 1,21 Standardabweichung 2,5967 1,5799 0,2173 Variationskoeffizient 84,3 % 66,4 % 18,0 % Auswertung: Ergebnis: Advanced Relative Quantification Die Tabelle zeigt, dass mit Effizienzkorrektur und non-linear fit -Funktion der Variationskoeffizient in diesem Beispiel nur 18 % beträgt. Bei einer herkömmlichen Auswertung ohne Effizienzkorrektur liegt der Variationskoeffizient deutlich höher, in diesem Beispiel bei 84,3 %. Die größte Genauigkeit wird folglich bei der Auswertung mit dem Advanced Modus und non-linear fit -Funktion erzielt. 28

29 Anwendungsbeispiel 2: Aus Soya-Standards mit definiertem Gehalt an genetisch veränderten Organismen (GMO) wird die DNA isoliert und daraus der GMO-Anteil relativ zur Gesamtmenge bestimmt. Tatsächlicher Ergebnis ohne Ergebnis mit GMO-Gehalt Effizienzkorrektur (E = 2) Effizienzkorrektur mit non-linear fit 1,0 % 0,67 % 1,06 % 0,5 % 0,31 % 0,51 % 0,1 % 0,04 % 0,08 % Die größte Genauigkeit bei der Quantifizierung wird durch die Verwendung der Effizienzkorrektur mit non-linear fit erreicht. Weitere Infos: Technical Note 13/2001 Relative Quantification unter: unter Literature and References Manual LightCycler Relative Quantification Software 29

30 Anhang: Möglichkeiten und Grenzen der Quantifizierung mit Multiplex-PCR Anwendungen: Jede Dual Color-Anwendung, wie z. B. die Absolute Quantifizierung mit externen Standards und mit interner Kontrolle. Detektion von Target-Gen und Referenzgen in einem Reaktionsgefäß. Die Verfügbarkeit verschiedener Farbstoffe, wie Fluorescein und LightCycler Yellow 555, ermöglicht die Durchführung von Multiplex-PCRs mit dem LightCycler PCR-Analysesystem. Um mit quantitativer Multiplex-PCR reproduzierbare und aussagekräftige Daten zu erhalten, müssen, wie im Folgenden dargestellt, einige Punkte beachtet werden. Prinzip Multiplex-PCR: Anwendungsbeispiel 1: In einer Multiplex-PCR laufen mehrere PCR-Reaktionen in einem Ansatz parallel ab. Eine Multiplex-PCR ist daher immer eine kompetitive PCR, in der um Primer, Polymerase und Nukleotide konkurriert wird. Unterscheiden sich die Konzentrationen der Target-DNAs und die Effizienzen der PCR-Reaktionen, wird ein Target bevorzugt amplifiziert, die Amplifikation der anderen wird unterdrückt. Dieser Umstand wird bei der klassischen Quantifizierung mittels kompetitiver PCR genutzt. Konventionelle Quantifizierung mit kompetitiver PCR Die Zielgene Target-1 und Target-2 werden in einem Ansatz amplifiziert. Die Anzahl der Target-2-Moleküle soll bestimmt werden. Das bekannte Target-1 wird in Konzentrationen zwischen 10 1 und 10 9 Kopien pro Reaktion eingesetzt. Von Target-2 werden konstante Mengen eingesetzt. Die Reaktionen werden einer Endpunktanalyse unterzogen (Abb. 1). In dem Ansatz, in dem beide Targets ähnliche Amplifikatmengen ergeben, entspricht die Konzentration von Target-2 der von Target-1. Target-1: H 2 O 500 Target Target-2 Target-2: konstante, unbekannte Konzentration Abb. 1: Kompetitive PCR mit anschließender Endpunktanalyse Ergebnis: Gleiche Amplifikatmengen werden bei einer Target-1-Konzentration von 10 5 erreicht. Die Amplifikation von Target-2 ist komplett inhibiert, wenn Target-1 mit 10 7 Kopien oder höher konzentriert eingesetzt wird. Der Bereich, in dem beide Amplifikate nachgewiesen werden können, erstreckt sich nur über drei Größenordnungen (10 4 bis 10 6 ), d. h. 3 log-stufen. 30

31 Anwendungsbeispiel 2: Quantitative Multiplex-PCR im Real-Time-Format Es wird eine Multiplex-PCR mit dem karussellbasierten LightCycler System durchgeführt. Target-1 wird in Konzentration von 10 3 bis 10 9 Kopien pro Reaktion zugegeben. Die Konzentration von Target-2 wird konstant bei 10 4 (Abb. 2a) bzw. bei 10 5 Kopien (Abb. 2b und 2c) gehalten. Die Amplifikation von Target-1 wird in Kanal F2 (Abb. 2a und 2b), die von Target-2 in Kanal F 3 (Abb. 2c) detektiert. Neben den Amplifikationskurven sind die Konzentrationen von Target-1 angegeben. Ergebnis: Abb. 2a: Target-1: Abb. 2b: Target-1: Abb. 2c: Target-2: 10 5 (Multiplex mit Target-2: 10 4 ) (Multiplex mit Target-2: 10 5 ) (Multiplex mit Target-1: ) In der Real-Time-Darstellung des kapillarbasierten LightCycler Systems wird deutlich, dass sich die Nachweisgrenze von Target-1 mit Erhöhung der Konzentration von Target-2 um eine Größenordnung von 10 3 (Abb. 2a) auf 10 4 (Abb. 2b) verschiebt. Gleichzeitig wird die Detektion der 10 5 Kopien von Target-2 mit steigenden Konzentrationen des Target-1 deutlich inhibiert (Abb. 2c). Wenn Target-2 in einer Konzentration von 10 5 vorliegt, schränkt sich der verfügbare dynamische Bereich auf 10 4 bis 10 6 ein (Abb. 2b und 2c). Damit kann Target-1 nur in diesem Konzentrationsbereich quantifiziert werden. 31

32 Zusammenführung: Quantitative Multiplex-PCR Um verlässliche Ergebnisse in der Quantifizierung mit Multiplex-PCR zu erhalten, müssen die folgenden Punkte unbedingt beachtet und die PCR in Vorversuchen optimiert werden. Multiplexing führt immer zu einer Einengung des dynamischen Bereichs Der dynamische Bereich einer Single-Target-PCR umfasst bei der quantitativen Analyse in der log-linearen Phase bis zu zehn Größenordnungen. Bei einer Multiplex-PCR mit nur zwei Targets verringert sich der dynamische Bereich bereits auf drei bis maximal fünf Größenordnungen. Mit jedem zusätzlichen Target wird der dynamische Bereich weiter eingeschränkt. Die Konzentration des ersten Targets bestimmt den quantifizierbaren Bereich des zweiten Targets Das Dual Color-Verfahren des LightCycler PCR-Analysesystems erlaubt die Amplifikation und Detektion zweier Targets im selben Reaktionsgefäß. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass die Konzentration des ersten Targets den Quantifizierungsbereich für das zweite Target festlegt. Beispiel: Unter der Annahme, dass Target-2 in einer Konzentration von 10 3 vorliegt, bewegt sich der Quantifizierungsbereich für Target-1 zwischen 10 2 und 10 4 (Abb. 3a). Liegt Target-2 in einer Konzentration von 10 6 vor, kann Target-1 im Bereich von 10 5 bis 10 7 quantifiziert werden (Abb. 3b). Abb. 3a: Target-1: ; Target-2: 10 3 Abb. 3b: Target-1: ; Target-2:

33 Definitionen Calibrator: Bei dem Calibrator handelt es sich um eine positive Vergleichsprobe, beispielsweise gesundes Gewebe bei pathologischen Anwendungen oder Gewebe vor der Apoptoseinduktion (Zeitpunkt 0), mit einem stabilen Verhältnis Target zu Referenzgen. Der Calibrator sollte in ausreichender Menge präpariert werden können. Wird eine neue Präparation verwendet, sollte diese mit der vorhergehenden Calibratorpräparation in einem PCR-Lauf verglichen werden. Es wird empfohlen, einen Teil der ursprünglichen Calibratorpräparation in Aliquots als Master-Calibrator zu lagern. Aus der Calibrator-Nukleinsäureprobe lassen sich sowohl Target-Gen als auch Referenzgen amplifizieren. Der Calibrator ist also eine positive Vergleichsprobe und dient zur Normalisierung aller Proben innerhalb eines Laufs und als konstanter Calibrierungspunkt zwischen mehreren LightCycler Läufen. Lauf-zu-Lauf- und Chargen-Unterschiede von PCR- Reagenzien und Primern werden normalisiert. Konzentration Target (Probe) Konzentration Referenz Calibrator-normalisiertes Verhältnis = Konzentration Target (Calibrator) Konzentration Referenz Assay Calibrator: Der gleiche Calibrator ist in jedem Relativen Quantifizierungslauf einer Studie enthalten und korrigiert nicht nur Unterschiede in der Detektionssensitivität zwischen Target und Referenzgen, sondern auch Lauf-zu-Lauf-Unterschiede. Study Calibrator: Der Calibrator wird in einer separaten Platte mitgeführt (Referenzexperiment). Cp: Crossing Point (Cp) beschreibt den Zyklus, an dem das Signal aus dem Hintergrund tritt. Der Cp wird automatisch von der LightCycler Software ermittelt (siehe Abbildung S. 10). Gendosis: Anzahl der Kopien eines Gens Kontrollen: Konzentrationsangaben sind bei Kontrollen nicht erforderlich. Die Kontrollen geben nur qualitative Hinweise zur PCR: Positivkontrolle: Eine Probe, von der bekannt ist, dass sie positiv ist, wird in einem separaten Reaktionsgefäß analysiert. Negativkontrolle: Eine Kontrolle, bei der im PCR-Ansatz das Template durch Wasser ersetzt wird ( No Template Control = NTC). Dadurch kann eine Kontamination oder im SYBR Green I-Format auch die Bildung von Primer-Dimeren erkannt werden. Bei der Verwendung einer internen Kontrolle enthält die NTC auch die interne Kontrolle. 33

34 Interne Kontrolle: Kontrolle, die in jedem Reaktionsgefäß zusammen mit dem Target-Gen koamplifiziert wird. In der NTC (Negativkontrolle) wird sie ebenfalls in einer mittleren Konzentration mitgeführt. Die interne Kontrolle sollte in Sequenzund PCR-Effizienz dem Target-Gen möglichst ähnlich sein. Sie kann durch eine Mutation (z. B. Insertion) in der Sequenz des Target-Gens erhalten werden, alternativ kann ein rekombinantes Plasmid eingesetzt werden. Detektiert werden Target- Gen und interne Kontrolle mittels sequenzspezifischer Sonden (siehe Anwendungsbeispiel S. 11). non-linear fit : Funktion der LightCycler Software. Mit der non-linear fit -Funktion ist eine exaktere Auswertung im unteren Konzentrationsbereich möglich (siehe Abbildung S. 17). Ausführliche Informationen sind im LightCycler 480 System Manual zu finden. Pairing Rules: Die Pairing Rule legt fest, wie die verschiedenen Target und Referenzgene miteinander verrechnet werden. Im Advanced Auswertemodus gibt es die Möglichkeit zwischen verschiedenen Pairing Rules für komplexere Anwendungen (z. B. mit mehreren Target- und Referenzgenen) auszuwählen: all-to-mean: analysiert die Daten von jedem Target-Gen gegen den Mittelwert der ausgewählten Referenzgene (häufigste Variante; voreingestellt für Basic Modus). all-to-all: ermöglicht die separate Analyse von jedem Target mit jedem einzelnen Referenzgen. one-to-one: paart jedes Target mit genau einem Referenzgen nach einem vom Benutzer vorgegebenen Pipettierschema. mean-to-all: berechnet den Mittelwert aller Target-Gene im Verhältnis zu jedem einzelnen Referenzgen. Referenzgen / Housekeeping- Gen: Housekeeping-Gene (HKG) sind eine große Gruppe von Genen, die für Proteine kodieren, deren Aktivität für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion essenziell ist. Als Referenzgen wird in der Regel ein Housekeeping-Gen verwendet, das einen ähnlichen Expressionslevel hat wie das Target-Gen und zur Normalisierung der Proben und als endogene Kontrolle dient (d. h., es kann aus dem gleichen Probenmaterial wie das Target-Gen amplifiziert werden). Wichtig ist, dass das Housekeeping-Gen nicht reguliert ist. Alternativ kann für Gen-Dosisbestimmungen ein single copy-gen eingesetzt werden (siehe auch Kapitel: Auswahl eines geeigneten Referenzgens; S. 25). Second Derivative Maximum - Methode: Prinzipiell ist die Second Derivative Maximum -Methode bei den meisten Experimenten die Methode der Wahl. Lediglich bei Experimenten, bei denen ein Einfluss des Anwenders auf die Ergebnisse gewünscht wird, ist die manuelle Fit Point -Methode empfehlenswert. Die Second Derivative Maximum -Methode ist automatisiert. 34

35 Fit Point - Methode: Standards: Flexible Auswertemethode. (Weitere Infos: LightCycler 480 Software Manual). Eine Standardkurve deckt den Konzentrationsbereich ab, der bei den zu analysierenden Proben zu erwarten ist. Der Konzentrationsbereich, der mit dem LightCycler 480 System detektiert werden kann, umfasst 10 log-stufen bei Mono Color-Anwendungen. Die Konzentration der Standards ist im Vergleich zu den Kontrollen bekannt. Für eine exakte Quantifizierung (absolut oder relativ mit externen Standards) muss die Amplifikationseffizienz der Standards und Proben identisch sein. Dies lässt sich am einfachsten durch möglichst homologe Sequenzen umsetzen. Die Effizienz (E) wird von der LightCycler 480 Software ermittelt oder lässt sich bestimmen, indem eine Verdünnungsreihe der Standards durchgeführt wird und die Steigung der Kurve ( slope ) in die Formel: E = 10 1/slope eingesetzt wird. Externe Standards: Standards werden in separaten Wells mitgeführt. Relative Standards: Relative Standards werden zur Relativen Quantifizierung mit Effizienzkorrektur eingesetzt. Dabei handelt es sich um Verdünnungsreihen von Target und Referenzgen, die 5 Verdünnungsstufen (10er-Verdünnungen) mit jeweils 2 6 Replikaten abdecken und in einer Real-Time-PCR betrachtet werden. Sie werden in separaten Wells mitgeführt. Mit Hilfe dieser PCR-Daten können die Funktionen der LightCycler 480 Software genutzt werden. Relative Standards sollten jedes Mal neu erstellt werden, wenn Änderungen bei den PCR-Effizienzen vermutet werden (z. B. durch neue Reagenzien). Target-Gen: Ein Gen, das analysiert wird (GOI = Gene of interest). UPL: Universal ProbeLibrary, siehe S. 23. Detektionsformate, Farbstoffe und Applikationen: Die Xenon-Lampe des LightCycler 480 Systems emittiert Licht über einen breiten Wellenlängenbereich von nm. Die 5 Anregungs- und 6 Detektionswellenlängen ermöglichen die Verwendung einer breiten Palette an Assay-Formaten und aller gängigen Real-Time-PCR-Fluorochrome. So können z. B. HybProbe, Hydrolysis und SimpleProbe Probes sowie SYBR Green I- und High Resolution Melting (HRM)-Farbstoffe eingesetzt werden. 35

36 Weitere Applikationsfelder: Genotypisierung (SNP-Analyse) Mit dem LightCycler 480 System kann eine Genotypisierung auf verschiedenen Wegen erfolgen: a) b) SNP-Analyse mit dem LightCycler 480 PCR-Analysesystem. a) Schmelzkurvenanalyse: Ein Polymorphismus des MDR1 Gens wird mit SimpleProbe Probes analysiert. Die Schmelzkurven und 3 Genotypen (Homozygot C/C und T/T, Heterozygot C/T) sind abgebildet. b) Untersuchung des LPLH3 Gens mit Hydrolysis Probes und anschließender Endpunktanalyse. Die Amplifikationskurven und die Scatter Plot -Analyse sind gezeigt, die Proben werden automatisch gruppiert. Prinzip: Vorteile: a) Schmelzkurven-Genotypisierung Die Schmelzkurvenanalyse mittels HybProbe Probes oder SimpleProbe Probes ist eine zuverlässige Methode für die Analyse von bekannten Nukleinsäurevariationen. Allel-spezifische Primer oder Sonden werden nicht benötigt, ein FRET-Sondenpaar genügt um alle Allele eines SNP (Single Nucleotide Polymorphism) nachzuweisen. Die Schmelzkurve ist ein Programmschritt im Anschluss an die eigentliche PCR, hängt somit nicht von der Effizienz der PCR ab und ist sehr robust. Sequenzspezifische HybProbe Probes binden bei niedrigen Temperaturen an die Zielsequenz und erzeugen ein Fluoreszenzsignal. Mit steigender Temperatur kommt es zu einem Abschmelzen der HybProbe Probes, das Fluoreszenzsignal verringert sich. Mutationen in der Zielsequenz führen zur thermischen Destabilisierung des Komplexes aus HybProbe Probes und Zielsequenz und so zu abweichenden Schmelzpunkten. Sehr flexible Methode, ideal für den Nachweis von komplexen genetischen Strukturen. In Multiplex-Assays ist die Detektion mehrerer SNPs möglich. 36

37 Einschränkung: Prinzip: Die Schmelzkurven-Genotypisierung verlangt ein sorgfältiges Design, damit wenigstens ein SNP von der Probe bedeckt wird. Die Optimierung jedes Assays ist daher erforderlich. Genotypes in Smokers: Correlations with Smoking Behaviour. P. Bauer et al., 2007, Biochemica No. 3, Roche Applied Science. b) Endpunkt-Genotypisierung Die Endpunkt-Genotypisierung dient der Allelischen Diskriminierung von bekannten Single Nucleotide Polymorphismen (SNP). Dazu wird zunächst ein Duplex-Assay im Hydrolysis Probe-Format durchgeführt. Ein Fluoreszenzsignal wird nur erzeugt, wenn durch den Verdau der Hydrolysis Probe der Quencher und der Fluoreszenzreporter räumlich voneinander getrennt werden. Pro Genotyp wird je eine sequenzspezifische Sonde ohne Fehlpaarung (mit Fluoreszenzreporter und Quencher) benötigt, die durch Verwendung zweier Farbstoffe voneinander unterschieden werden können. In kommerziellen SNP Genotyping Assays ist z. B. die Sonde für Allel X FAM und für Allel Y VIC oder HEX markiert. Endpunkt-Genotypisierung homozygoter und heterozygoter Proben. Während der Duplex-PCR wird bevorzugt die Hydrolysis Probe verdaut, die ohne Mismatch an das jeweilige spezifische PCR-Produkt hybridisiert. An das andere Allel bindet diese Sonde nur mit Fehlpaarung. Dies führt dazu, dass die Sonde an dieser Stelle durch die Taq Polymerase eher verdrängt (displaced) wird ohne verdaut zu werden und damit ein deutlich reduziertes Fluoreszenzsignal generiert wird. In den PCR-Reaktionen der homozygoten Proben ohne Fehlpaarung wird vorzugsweise die jeweils spezifische Sonde verdaut und jeweils nur ein Farbstoff (FAM oder VIC) freigesetzt. Bei heterozygoten Proben werden beide Sonden in etwa gleichem Maße verdaut und beide Farbstoffe (FAM und VIC) freigesetzt. Die Analyse erfolgt am Endpunkt der PCR, wo die Fluoreszenzintensität der Farbstoffe gemessen wird. Im Falle der heterozygoten Proben entsteht ein Fluoreszenzsignal mittlerer Intensität. Die Zuordnung der Proben zu einem Genotyp erfolgt automatisch durch die Auswertesoftware und das Ergebnis wird zusätzlich in Form eines Scatter Plots dargestellt. Vorteil: Einschränkung: Anwendungsbeispiel: Anwendungsbeispiel: Die Endpunkt-Genotypisierung kann ohne vorangegangene Optimierung durchgeführt werden. Es wird nur eine Mutation pro Assay erfasst, die bekannt sein muss. Association of cannabinoid receptor variants with adiposity in obese men. A. Peeters, 2008, Focus Application 03, Roche Applied Science. 37

38 Prinzip: c) Gene Scanning mit High Resolution Melting (HRM) Bei der High Resolution Melting (HRM)-Analyse handelt es sich um eine neue, homogene Post-PCR-Methode, die die Analyse von genetischen Varianten (SNP, Mutationen, Methylierungen) in PCR-Produkten ermöglicht. Die Suche nach unbekannten Variationen in PCR-Produkten, das sogenannte Gene Scanning, ist die wichtigste HRM-Anwendung und wird vor bzw. als Alternative zur Sequenzierung eingesetzt. Genetische Varianten beeinflussen das Schmelzverhalten der PCR-Produkte und können so in einer hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse nachgewiesen werden. Voraussetzung dafür ist neben einer homogenen Temperaturverteilung im PCR- Block und einer speziellen Auswertesoftware die Verwendung eines speziellen HRM- Farbstoffes, wie dem LightCycler 480 ResoLight-Farbstoff. Diese HRM-Farbstoffe interkalieren ähnlich wie SYBR Green I sequenzunabhänig in doppelsträngige DNA, inhibieren allerdings nicht die PCR und können daher in höheren Konzentrationen eingesetzt werden. Durch die vollständige, gleichmäßige Absättigung der doppelsträngigen DNA und der hohen Signaldynamik können minimale Variationen im Schmelzverhalten aufgelöst werden. Für die Durchführung eines solchen LightCycler 480 Gene Scanning-Experiments wird die DNA zunächst in Anwesenheit des LightCycler 480 ResoLight-Farbstoffes amplifiziert. Im Anschluss an die PCR erfolgt eine hochauflösende Schmelzkurvenanalyse. Mit Hilfe der LightCycler Gene Scanning Software werden minimale Signalunterschiede zwischen den Kurven im Difference Plot dargestellt und ähnliche Kurven automatisch gruppiert. Anwendungsbeispiele: Transferring PCRs to HRM-assays on the LightCycler 480 System-Examples for BRCA. R. Vossen et al., 2007, Biochemica No. 4, Roche Applied Science. High-Resolution Melting for CFTR Mutation Scanning. S. Beck-Wödl und P. Bauer, 2008, Focus Application 02, Roche Applied Science. Mit der LightCycler 480 Gene Scanning Software können Unterschiede zwischen Wildtyp und Varianten durch Gruppierung der HRM-Kurven abgebildet werden. Ein Fragment des humanen TNF SF18 Gens mit dem A/T Polymorphismus rs wird mit dem LightCycler High Resolution Melting Master ausgehend von genomischer DNA aus Blut amplifiziert. Der Difference Plot zeigt die Unterschiede zwischen Wildtyp (AA, grün), Homozygoter Mutante (TT, blau) und Heterozygoter Mutante (AT, rot). 38

39 Bestellinformationen: LightCycler 480 Instrument und Verbrauchsmaterialien Produkt Kat.-Nr. Packungsgröße LightCycler 480 Instrument II, 96-well Instrument 1) LightCycler 480 Instrument II, 384-well Instrument 1) LightCycler 480 Block Kit 96 Silver Kit 2) LightCycler 480 Block Kit 384 Silver Kit 2) LightCycler 480 Bar-Code Scanner Scanner LightCycler 480 Xenon Lamp Lampe LightCycler 480 Software, Version Software-Package LightCycler 480 LIMS Interface Module Software-Package LightCycler 480 Gene Scanning Software Software-Package LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software Software-Package LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Platten /50 Folien LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white Platten /50 Folien LightCycler 480 Multiwell Plate 96, clear Platten /50 Folien LightCycler 480 Multiwell Plate 384, clear Platten /50 Folien LightCycler 480 Sealing Foil Folien 1) Instrument package includes LightCycler 480 Instrument, LightCycler 480 thermal block cycler unit (96- or 384-well), LightCycler 480 software, LightCycler 480 Instrument Operator s Manual, LightCycler 480 Xenon Lamp (spare lamp). A Pentium desktop PC is supplied with the instrument. 2) Kit package includes LightCycler 480 thermal block cycler unit (96- or 384-well), block cycler cover, storage box. 39

40 Bestellinformationen: LightCycler 480 Reagenzien Produkt Kat.-Nr. Packungsgröße LightCycler 480 SYBR Green I Master x 1 ml (2x konzentriert) (500 x 20 l Reaktionen) x 5 ml (5000 x 20 l Reaktionen) LightCycler 480 Probes Master x 1 ml (2x konzentriert) (500 x 20 l Reaktionen) x 5 ml (5000 x 20 l Reaktionen) x 50 ml (5000 x 20 l Reaktionen) LightCycler 480 Genotyping Master x 384 l (5x konzentriert) (384 x 20 l Reaktionen) LightCycler 480 High Resolution Melting Master x 1 ml (500 x 20 l Reaktionen) LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probes x 20 l Reaktionen LightCycler 480 Control Kit Kit (3 Kontrollexperimente) LightCycler RNA Pre-Amplification Kit ~ Kit (32 Reaktionen) Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit 1) Kit (50 Reaktionen) Kit (100 Reaktionen) Kit (200 Reaktionen) Universal ProbeLibrary Set, Human Set 2) Universal ProbeLibrary Set, Mouse Set 2) Universal ProbeLibrary Set, Rat Set 2) Universal ProbeLibrary Extension Set Set 2) Universal ProbeLibrary Set, Human Reference Set 2) Gene Assays RealTime ready Human ABC Transporter Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) RealTime ready Human Apoptosis Panel, MWP (mit je 384 Assays) 3) RealTime ready Human Apoptosis Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) RealTime ready Human Cell Cycle Regulation Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) RealTime ready Human GPCR Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) RealTime ready Human Nuclear Receptor Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) RealTime ready Human Reference Gene Panel, MWP (mit je 96 Assays) 3) 1) Detailinformationen finden Sie auf 2) Detailinformationen finden Sie auf 3) Detailinformationen finden Sie auf 40

41 Limited Label Licenses and Disclaimers This product is covered in-part by US 5,871,908 or any foreign equivalents, co-exclusively licensed from Evotec OAI AG. The purchase price includes a license to practice the methods covered by US 5,871,908 by using the product. Purchase of this product, however, does not convey to the purchaser a license or right to (i) commercially make, have made or sell reagents and/or kits, or (ii) buy or use reagents and/or kits provided by a third party used in conjunction with the product or any other thermocycler to practice the methods covered by US 5,871,908 or any foreign equivalents. Parts of the Software used for the LightCycler 480 System are licensed from Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. This product is covered by one or more of U.S. 6,197,520, 6,303,305, 6,387,621, 6,503,720, 6,730,501 and corresponding claims in their non-u.s. counterparts, owned by Roche Diagnostics GmbH and/or licensed from Idaho Technology, Inc. This LightCycler 480 Real-Time PCR System is a realtime thermal cycler licensed for use in research under U.S. Patent No. 6,814,934 and corresponding claims in its non-u.s. counterparts, and under one or more of U.S. Patents Nos. 5,038,852, 5,656,493, 5,333,675, 5,475,610, 5,602,756, 6,703,236, 7,238,517, or corresponding claims in their non-u.s. counterparts, owned by Applera Corporation. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5' nuclease methods. This instrument is for research use only. For further information on purchasing licenses for research and other non-in vitro diagnostic applications, contact the Director of Licensing at Applied Bio systems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. The purchase price of this product includes a limited, nontransferable license under U.S. Patent Nos. 5,994,056 and 6,171,785 and corresponding patent claims outside the United States, owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd ( Roche ), and under U.S. Patent No. 6,569,627 and corresponding patent claims outside the United States, licensed from Idaho Technology Inc., for using only this amount of the product for dsdnabinding dye processes covered by said patent solely for the purchaser s own internal research and development activities. This product is also a Licensed Dye Binding Kit for use with service sublicenses available from Applied Biosystems. No right under any other patent claims (such as apparatus or system claims in U.S. Patent No. 6,814,934) and no right to use this product for any other purpose or for commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser s activities for a fee or other commercial consideration, is hereby granted expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses to practice real-time PCR processes may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. A license to perform the patented 5' Nuclease Process for research is obtained by the purchase of (i) both Authorized 5' Nuclease Core Kit and Licensed Probe, (ii) a Licensed 5' Nuclease Kit, or (iii) license rights from Applied Biosystems. This product is an Authorized 5' Nuclease Core Kit. 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Its purchase price includes a limited, non-transferable immunity from suit under U.S. Patents Nos. 6,214,979 and 5,804,375 (claims 1 12 only) and corresponding patent claims outside the United States. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this 41

42 amount of product for the purchaser s own internal research. The right to use this product in the 5' Nuclease Process under the applicable claims of US Patents Nos. 5,210,015 and 5,487,972, and corresponding patent claims outside the United States, can be obtained through purchase of an Authorized 5' Nuclease Core Kit. Except under separate license rights available from Applied Biosystems, no right under any other patent claim, or to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser s activities for a fee or other commercial consideration, or to sublicense, repackage with other products, or resell in any form, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. 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No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser s activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained from the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. For general laboratory use. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks LIGHTCYCLER, REALTIME READY, FASTSTART, HYBPROBE, and SIMPLEPROBE are trademarks of Roche. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. PROBELIBRARY and LNA are registered trademarks of Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark. NuGEN, SPIA, and Ribo-SPIA are registered trademarks of NuGEN Technologies, Inc. Other brands and product names are trademarks of their respective holders. 42

43 Nützliche Informationen, Tipps und Tricks zur Quantifizierung finden Sie: In den LightCycler Technical Notes: unter Literature and References Im Online Technical Support: Die ausführliche und aktuelle Referenzliste findet sich auf der Homepage unter Literature and References Nehmen Sie teil an den LightCycler Workshops zum Thema Quantifizierung: Kursfolder LightCycler Workshops Sie erreichen uns: Druckschriften-Service: Tel.: Fax: Fachliche Information: Tel.: Fax: Internet:

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