Biochemie II. Membranen, Enzymatische Katalyse, Serinpeptidasen, Kinasen, Enzymhemmung. Prof. Amedeo Caflisch. Biochemisches Institut der UZH

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1 Biochemie II Membranen, Enzymatische Katalyse, Serinpeptidasen, Kinasen, Enzymhemmung Prof. Amedeo Caflisch Biochemisches Institut der UZH 1

2 Vorwort Warum ist es so? So ist es nun einmal. Was muss ich verstehen? Was muss ich wissen? Auswendig wissen: Fast nichts! Ausnahme: 20 proteinogenen Aminosäuren Physicochemische Erklärungen verstehen Zusammenhänge (z.b. Hydrophober Effekt) Beispiele aus eigener Forschung Fragen: in 44-L-66 jederzeit: 2

3 Membranen Aufbau und Zusammensetzung Physikalische Erklärung der Stabilität Membranproteine Dynamik und Plastizität Funktionen: Barriere und Transport 3

4 Lipide Lipide sind unterschiedliche Verbindungen: unlöslich in Wasser, Verschiedene Funktionen: Energiespeicherung Membranlipiden (Barriere und selekt. Transport) Cofaktoren Emulgatoren Hormone und intraz. Botenstoffe 4

5 Amphipathische MolekÜlen 5

6 Mizellen 6

7 Mizellen 7

8 Mizellen und Membranen Lipiddoppelschicht Dichte : nur 2 Moleküle! 8

9 Mizellen, Membranen, Vesikel 9

10 Membranen 10

11 Lipidzusammensetzung 11

12 Lipidzusammensetzung Asymmetrische Verteilung der Phospholipide in der Plasmamembran des Erythrocyten 12

13 van der Waals Energie Anziehung Abstossung 13

14 van der Waals und Schmelzpunkt 14

15 Hydrophober Effekt 15

16 Hydrophober Effekt 16

17 Gibbsche freie enthalpie der Micellenaggregation Aggregation Lip Wasser Lip / Wasser Lip Wasser Sehr günstig: hydrophober Effekt rot = ungünstig Micelle zerstreut Aggregation 17

18 Hydrophobe Aggregation Mizellen und Membranen multimolekular Protein Faltung Unimolekular (Kollaps der hydrophoben Seitenketten) Bildung von Amyloidfibrillen multimolekular (pathologisch) 18

19 Trennung von Kompartimenten Wässrige Lösung 1 Wässrige Lösung 2 Halbdurchlässige (semi-permeable) Membran Eine solche Strategie wäre in einer Zelle unwirksam (keine Selektivität für verschiedene Moleküle) 19

20 Trennung von Kompartimenten Permeabilitätseigenschaften einer Lipiddoppelschicht für unterschiedliche Molekülklassen 20

21 Biologische Membranen Effiziente räumliche Trennung von wässrigen Kompartimenten (Bildung von selektiven Barrieren) Vermittlung des Flusses von Nährstoffen und Abbauprodukten Grosse Konzentrationsunterschiede auf beiden Seiten der Membran möglich Zweidimensionaler Raum: Makromoleküle haben höhere Wahrscheinlichkeit zur Wechselwirkung Universelle Grundstruktur aller biologischen Membranen 21

22 Bestandteile der Membranen Oligosaccharide der Glycolipide Phospholipid- Doppelschicht Hydrophob Hydrophil Integrales Membranprotein Peripheres Membranprotein Glycoprotein Oligosaccharide der Glycoproteine Plasmamembran Kern Cytoplasma 22

23 Proteine in der Lipid-Doppelschicht I. Integrale Membranproteine II. Lipidgebundene Proteine III. Periphere Membranproteine 23

24 I. Integrale Membranproteine Aussen Doppelschicht Innen Glycophorin A aus Erythrocyten 24

25 Transmembranabschnitte: Vorhersage Freie Enthalpie des Übergangs zu H 2 O (kj mol 1 ) 85 kj mol 1 Trennlinie Lage der vorhergesagten Transmembran helix Erste Aminosäure eines 20 Reste langen Abschnittes 25

26 Bacteriorhodopsin: Transmembranabschnitte Lichtgetriebene Protonenpumpe 7 Transmembran Helices aus je ca. 20 bis 25 Aminosäuren; 0.15 nm x (20 bis 25) = 3.0 bis 3.8 nm Helix-Länge wie Lipiddoppelschicht Prosthetische Gruppe Retinal (kovalent an Lys gebunden) Bacteriorhodopsin Retinal 26

27 Transmembranabschnitte: Vorhersage 27

28 Reguläre Sekundärstruktur 28

29 -Fass: antiparallele -Faltblätter Porin Bänder-Darstellung des 16- strängigen Monomers des Porins aus Escherichia coli Doppelte Membran von Escherichia coli In Abschnitten, die sich durch die Membran ziehen, ist jeder zweite Rest hydrophob Vorhersage anhand des Hydropathiediagramms ist nicht möglich 29

30 Integrale Membranproteine (Beispiele) Geladene Reste ausserhalb der Membran Trp- und Tyr-Reste an der Grenzfläche Kaliumkanal Maltoporin Maltoporin/maltose 30

31 Alzheimer s Abeta Peptid (Exkurs) 31

32 Amyloid Aggregation (Exkurs) Hydrophober Effekt 32

33 II. Lipidgebundene Membranproteine Bindung an Lipide durch 1. Prenylierung (2 Arten) 5 C Atome 2. Fettsäure-Acylierung ( 2 Arten) 3. Glycosylphosphatidylinositol-Anker 33

34 II.1. Prenylierte Proteine Erkennung: C-terminales Tetrapeptid Cys-X-X-B X = aliphatische Aminosäure -Cys-X-X-B B = Ala, Met, Ser H C CH 3 CH 3 CH 3 Farnesylrest (C 15 ) Farnesyl (C 15 ) 3x 5 C CH 3 B = Leu H C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Geranylgeranylrest (C 20 ) Geranylgeranyl (C 20 ) 4x 5 C 34

35 Mechanismus der Prenylierung SH + 3 oder 4 Isopren-Einheiten (C5) Protein N H CH 2 CH C O O X-X-B S Membranverankerung 3 oder 4 CH 2 Thioetherbindung Cys Protein N CH C O CH 3 H O 35

36 II.2. Acylierte Proteine: Myristoylierung Myristinsäure-COOH (C 14 ) Glycin + H 2 N-CH 2 -CO-Protein Myristoyl-Protein Stabile Verbindung (Amid) Subzelluläre Kompartimente: ER, Zellkern Plasmamembran (Cytoplasma-Seite) 36

37 Acylierte Proteine: Palmitoylierung Palmitinsäure-COOH (C 16 ) + Protein HS (Cystein im Innern) Palmitoyl-Protein (Thioesterbindung) Reversible Verbindung (Spaltung durch Thioesterase) Cytoplasma-Seite der Plasmamembran Transmembrane Signalübertragung 37

38 Palmitoyl-Peptid (Beispiel) Thioesterbindung an Cys Seitenkette Anfang Ende Gorfe et al., Membrane localization and flexibility of a lipidated Ras peptide studied by MD simulations, JACS

39 Palmitoyl-Peptid (Beispiel) 39

40 II. 3. Glycosylphosphatidylinositol-Anker O Protein C NH Bindung am C-Terminus des Proteins Nur an der Aussenseite der Plasmamembran CH 2 CH 2 O O P O Tetrasaccharid variabel O (Mannose) 3 GlcNH 2 O O H 2 C O C R 1 OH OH O HC O C R 2 O P O CH 2 O OH OH O Phosphatidylinositol 40

41 Lipidgebundene Membranproteine Kovalent verknüpfte Lipide verankern Membranproteinen an der Lipiddoppelschicht. 41

42 III. Periphere Membranproteine Locker gebunden: nur H-Bindungen und elektrostatische WW mit Membran Dissoziation von der Membran unter milden Bedingungen (hohe Ionenstärke, ph- Änderung) Membran bleibt intakt Eigenschaften wie wasserlösliche Proteine Beispiel: Cytochrom c an der Aussenseite der inneren Mitochondrien-Membran 42

43 Skelett der Erythrocytenmembran PAS (Periodsäure Schiffs- Reagens) färbt Kohlenhydrate an Spektrin: 75% des Membranskelettes Reife Erythrocyten besitzen keine Organellen (Kern, Lysosomen, Mitochondrien, usw.) und vollziehen nur wenige Stoffwechselprozesse. -> Mit Hemoglobin gefüllter Membransäcke. 43

44 Proteine in der Lipid-Doppelschicht Zusammenfassung: I. Integrale Membranproteine II. Lipidgebundene Proteine III. Periphere Membranproteine 44

45 Gefrierbruch-Gefrierätzung Asymmetrie wegen Oligosacchariden von Glykoproteinen im Aussen 45

46 Flüssig-Mosaik-Modell Das Membranmosaik ist flüssig, weil die meisten Wechselwirkungen seiner Molekülen nicht kovalent sind (van der Waals und elektrostatische) Laterale Diffusion der Lipide: 1 µm/s Laterale Diffusion der Proteine: 0-20 µm/stunde Cholesterol kontrolliert die Fluidität (mehr Cholesterol verringert die Fluidität) 46

47 Lipiddiffusion Start Das Bewegungsmuster zeigt eine schnelle Diffusion innerhalb eines begrenzten Bereichs (etwa 250 nm Durchmesser, durch eine Farbe Dargestellt) mit gelegentlichen Sprüngen in einen benachbarten Bereich. Ende Sprungdiffusion einzelner Lipidmoleküle 47

48 Lipiddiffusion und Flexibilität 48

49 Phasenübergang Aus Mathews, van Holde, Ahern, Biochemistry 3 rd edition 49

50 Membranmikrodomänen (Flösse) Aggregate von Sphingolipiden und Cholesterin erzeugen eine Mikrodomäne, die geringfügig dicker ist als andere Membranbereiche. Rasterkraftmikrosopie. Die Flössen (grün) ragen aus dem Meer der Lipiddoppelschicht. Die scharfen Spitzen stellen GPI-verknupfte Proteine dar. 50

51 Lipidflexibilität 51

52 Lipidflexibilität Look at last 10 seconds of movie: 52

53 Verschmelzen von Zellmembranen Zelle (Maus) Zelle (Mensch) Sendai Virus Fusion Nach etwa 40 min 53

54 FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching Fluoreszenzregenerierung nach Bleichen mit Licht 54

55 FRAP Zelle Laser Ausbleichen Fluoreszenz Zeit 55

56 Rock n Roll der Erythrocyten Fester Referenzpunkt Essentiell damit Blut fliessen kann: Die Erythrocyten zwängen sich durch die Blutkapillaren, obwohl diese einen kleineren Durchmesser als die Erythrocyten selbst haben. Verantwortlich ist das Membranskelett (75% Spektrin). 56

57 Transportvorgänge Nicht vermittelt: Diffusionsvorgang Substanz diffundiert in Richtung niedrigerer Konzentration. Vermittelt: durch Carrierproteine 57

58 Transport durch Membranen G ( out) G' RT ln A A A out Neutrale Molek Geladene Molek 58

59 Transport durch Membranen (1) Partielle molare freie Enthalpie A( out) A( in) G ( in) G' RT ln A A A in G ( out) G' RT ln A A A out A G G ( in) G ( out) RTln in A A A A Gilt nur für ungeladene Moleküle out 59

60 Transport durch Membranen (2) [A] out > [A] in ḠA < 0 für den Transfer von aussen nach innen A fliesst spontan nach innen [A] out < [A] in ḠA > 0 A fliesst nach innen nur wenn Energie zugefügt wird (z.b. ATP-Hydrolyse) 60

61 Membranpotential ( in) ( out) Wenn A ein geladenes Ion ist A G RTln in Z F A A A out Ionische Ladung von A Faraday-Konstante 61

62 Transportvorgänge Nicht vermittelt: Diffusionsvorgang Substanz diffundiert in Richtung niedrigerer Konzentration. Vermittelt: durch Carrierproteine Passiver Transport (erleichterte Diffusion) Fluss von hoher zu niedriger Konzentration, exergon. Aktiver Transport Fluss von niedriger zu hoher Konzentration, endergon. Wird an einem exergonen Vorgang gekoppelt (z.b. Absorption von Sonnenlicht, Oxidationsreaktion, ATP-Hydrolyse). 62

63 Stöchiometrie des vermittelten Transports Uniport 1 Molekül Symport Verschiedene Moleküle in gleicher Richtung Antiport Verschiedene Moleküle in entgegengesetzter Richtung 63

64 Aquaporin 10 ^ 9 Hydrophiler Kanal für den schnellen Wasserdurchtritt durch die Membrane (10 9 H 2 O Moleküle s -1 ) 64

65 Vermittelter Transport: Ionophore Carrier-Ionophor kanalbildender Ionophor 65

66 Vermittelter Transport: Ionophore Carrier-Ionophor kanalbildender Ionophor 66

67 Ionophor: Valinomycin Cyclodeka-Depsipeptid Koordination von K + Ionenradien: K + = 1.33 Å Na + = 0.95 Å 10,000-fach stärkere Bindung von K + gegenüber Na + hydrophobe Seitenketten; schnelle Diffusion des Komplexes 1 Molekül transportiert 10 4 K + Ionen pro Sekunde Funktion: Shuttle für K + ; baut Gradienten ab; Antibiotikum 67

68 Ionophor: Gramicidin A Peptid mit 15 AS (L- und D-Form) Transmembran- Kanalbildung durch Dimerisierung Kopf an Kopf R (.) N-formyl neutral ungünstig günstig für Ionentransfer 68

69 Ionophor: Gramicidin A Kopf an Kopf Helix Polarer zentraler Kanal für Na + und K + Transportiert 10 7 K + Ionen/s 69

70 Glucosetransporter aus Erythrocyten GLUT1: 50 kda Protein für passiven Transport. Der Transporter kann 2 Konformationen annehmen 70

71 Glucosetransporter aus Erythrocyten Struktur (hypothetisch) von GLUT1 Drei Kennzeichen des passiven Transports: hohe Diffusionsgeschwindigkeit in Richtung des Konzentrationsgradienten hohes Sättigungsvermögen (D-Glucose: K transport = 1.5 mmol/l) hohe Spezifizität (D-Galactose: K transport = 30 mmol/l) (je niedriger K transport desto schneller die Diffusion) 71

72 Glucosetransporter aus Bakterien Nature, October 18,

73 Zwei Arten des aktiven Transports ATP A ADP+P i ATP B A B B B B B A A A A A A A A A A Primär aktiver Transport A A A A A A A ADP+P i A A A A A A A Sekundär aktiver Transport B A 73

74 ATP-getriebener Aktivtransport aussen Natrium-Kalium ATPase innen Antiport 3Na + nach aussen 2K + nach innen Ein Na + -Gradient wird aufgebaut 74

75 Na + K + ATPase und Glucoseabsorption aussen innen Sekundär aktiver Transport 75

76 Dünndarmepithel Dünndarm Zotte (Villus) Chylusgefäss Lymphe Lumen Epithel- Zellen Darmzotten: 120 m² Mikrozotten: 240 m² Zotte (Villus) Mukosa Kapillare 76

77 Dünndarm-Lumen Glucosetransport Glucose Epithel [K + ] = 150 mm [Na + ] = 12 mm Interstitium GLUT 2 [K + ] = 4 mm [Na + ] = 145 mm SGLT 1 Na + Na + Na + Na + Na + ATP K + K + 77

78 Dünndarm-Lumen Glucosetransport Glucose Epithel [K + ] = 150 mm [Na + ] = 12 mm Interstitium GLUT 2 [K + ] = 4 mm [Na + ] = 145 mm SGLT 1 Na + Na + Na + Na + Na + ATP K + K + 78

79 Membrantransportsysteme Horton, Moran et al. Biochemie

80 Membranen sind asymmetrisch Aussen Innen 80

81 Phospholipide sind asymmetrisch verteilt Die Verteilung bestimmter Lipide kann mit Hilfe von Phospholipasen ermittelt werden. Phospholipasen können Membranen nicht durchqueren, so dass nur die Phospholipide der äusseren Oberflächen intakter Zellen für die enzymatische Hydrolyse zugänglich sind. Prokaryoten: die Lipide werden in der Zellmembran synthetisiert Eukaryoten: die Enzyme der Membranlipid-Biosynthese sind integrale Proteine des ER. Gesamt Sphingomyelin Phosphatidylcholin innere Lage Phosphatidylethanolamin Phosphatidylserin äussere Lage Anteil am Gesamt-Phospholipid in mol % 81

82 82

83 83

84 Phospholipid-Synthese bei Prokaryoten TNBS Markierung nur an nichtradioaktivem Phosphatidylethanolamin TNBS = Trinitrobenzolsulfonsäure TNBS auch an radioaktivem Phosphatidylethanolamin Flippasen, Floppasen: aktiver Transport Phospholipid-Scramblase: erleicherte Diffusion 84

85 Phospholipid-Synthese bei Eukaryoten Glattes endoplasmatisches Retikulum Raues endoplasmatisches Retikulum 85

86 Phospholipid-Synthese bei Eukaryoten In eukaryotischen Zellen werden Lipide, die an der cytoplasmatischen Seite des ER synthetisiert wurden, durch Vesikel zu anderen Teilen der Zelle transportiert. Diese Vesikel werden vom ER abgeschnürt und verschmelzen mit anderen zellulären Membranen. Auf diesem Wege werden auch Membranproteine transportiert. Rau Glatt Gebundene Ribosomen Lumen Freie Ribosomen 86

87 Bestimmung der Zielortes für Proteine Proteinsynthese an Ribosomen Freie Ribosomen Ribosomen am rauen ER Lösliche Proteine Mitochondriale Proteine Transmembranproteine Sekretorische Proteine Lysosomale Proteine Der 'sekretorische Weg' 87

88 Die Signalhypothese Sekretorische Proteine Transmenbran Proteine Lysosomale Proteine Signalpeptid Werden zunächst mit einem N- terminalen Peptid synthetisiert Protein Aminosäuren 7-13 Hydrophobe AS Flankiert von einigen hydrophilen AS (Hypothese: erklärt 7-transmembran Helices nicht) 88

89 Die Signalhypothese (1) rer Lumen SRP-Rezeptor SRP 3' mrna 5' 89

90 Die Signalhypothese (2) rer Lumen 90

91 Die Signalhypothese (3) rer Lumen 91

92 Die Signalhypothese (4) rer Transmembranprotein rer Lumen rer Sekretorisches Protein 92

93 Integrale Membranproteine COP Coat Protein Clathrin 93

94 Vom Golgi-Apparat zur Membran Transport der Proteine in umhüllten Vesikeln (coated vesicles) Bei der Verschmelzung mit anderen Membranen bleibt die Orientierung der Transmembranproteine beibehalten Golgi-Apparat Camillo Golgi ( ) Nobelpreisträger

95 Orientierung der Membranproteine (1) Vesikelmembran ER oder Golgi- Apparat Vesikel Zellmembran 95

96 Orientierung der Membranproteine (2) Bei der Verschmelzung eines Vesikels mit einer anderen Membran bleibt die Orientierung der Transmembranproteine beibehalten. Das Lumen des ER und des Golgi-Apparates entspricht topologisch der Aussenseite der Zelle. 96

97 Clathrin - Triskelionen (A) EM-Bild von Clathrin-Triskelionen (B) Anordnung der Triskelionen im Clathrinkäfig (C) Clathrinkäfig: 36 Triskelionen bilden 12 Fünfecken und 6 Sechsecken 97

98 Triskelionen Tris = Drei + Skelos = Bein (Griechisch) Dreibeinig Netzwerke aus Fünfecken und Sechsecken sind die sparsamste Art, kugelige Objekte in polyedrische Käfige zu verpacken. 98

99 Lipidtransport Lipide Phospholipide Triacylglycerine Cholesterol Unlöslich in Wasser Transport als micellenartige Partikel (Lipoproteine) Zellaufnahme durch Rezeptoren 99

100 Bestandteile der Lipoproteine Triacylglycerine Cholesterolester Kern Proteine Phospholipide Hülle Cholesterol 100

101 Low Density Lipoproteine: LDL (1500 Moleküle) (800 Moleküle) (500 Moleküle) (1 Molekül) Das Protein (550 kd) bildet eine amphiphile Helix 101

102 Lipoproteine Chylomikrone VLDL IDL LDL HDL Dichte (g cm 3 ) < 0.95 < Durchmesser (nm) Masse (kda) 400,000 10,000-80, ,000 2, Anteil Protein (% ) 102

103 Lipoproteine: Funktion Darm Chylomikrone Exogene TAG und Cholesterol Gewebe HDL Endogenes Cholesterol VLDL, IDL, LDL Endogene TAG und Cholesterol Leber 103

104 LDL: Rezeptorvermittelte Endocytose 104