B I O F I L M C E N T R E

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1 Verbundprojekt: Erkennung und Bekämpfung von vorübergehend unkultivierbaren Pathogenen in der Trinkwasser-Installation Abschlussveranstaltung, Bonn, 02. April 2014 Wie gehen hygienisch relevante Mikroorganismen in den VBNC-Zustand über und wie werden sie wieder kultivierbar? Jost Wingender, Zenyta Dwidjosiswojo, Conny Rosengarten, Hans-Curt Flemming B I O F I L M C E N T R E AQUATISCHE MIKROBIOLOGIE

2 Interaktionen zwischen hygienisch relevanten Bakterien und Kupfer in der Trinkwasser-Installation Planktonische Zellen und Kupferionen im Wasser. Bakterien und Kupferionen im Biofilm (Akkumulation von Kupferionen in Biofilmen). Kontakt von Bakterien mit Kupferoberflächen. Anheftung Wachstum Freisetzung Kultivierbar Kupferionen VBNC?

3 Untersuchungsschwerpunkte Laborversuche Einfluss von Kupferionen auf die Vitalität von Pseudomonas aeruginosa und Legionella pneumophila beim Übergang der Bakterien in den VBNC-Zustand. Wirkung von Kupferionen auf planktonische Zellen und Biofilme. Charakterisierung des kupferinduzierten VBNC-Zustands auf physiologischer und genetischer Ebene. Rückkehr in die kultivierbare Form ( Resuscitation ). Cytotoxizität und Gentoxizität der Bakterien im kultivierbaren und VBNC-Zustand (Kooperation mit IWW).

4 P. aeruginosa (KBE/mL) Kultivierbarkeit von P. aeruginosa in kupferhaltigem Wasser Exposition von P. aeruginosa AdS (10 6 Zellen/mL) in Trinkwasser bzw. Deionat ± Kupfersulfat, 20 C, 24 h, ± Kupferchelator DTTC (Natriumdiethyldithiocarbamat) 1,0E+07 Trinkwasser-Installation aus Kupfer 56 µg/l Cu Trinkwasser- Verteilungssystem 2 µg/l Cu Deionat ohne Cu Deionat mit Kupfer 63,5 µg/l (1 µm) Cu 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 - DDTC + DDTC - DDTC + DDTC - Cu + Cu n. n. 0 h 24 h Kupferhaltiges Trinkwasser bzw. Deionat verminderte die Kultivierbarkeit auf Nähragar, während die Gesamtzellzahl (ca Zellen/mL) konstant blieb. Verlust der Kultivierbarkeit wurde durch Zugabe des Kupferchelators DDTC aufgehoben.

5 Wirkung von Kupferionen auf P. aeruginosa in Wasser Kupferionen (10 µm) bewirken Verlust der Kultivierbarkeit von P. aeruginosa: - Nährmedien: Nähragar, 36 C, 2 d; CN-Agar, 36 C, 2 d (ISO 16266); Pseudalert, 38 C, 1 d - Verlängerung der Inkubationsdauer: bis zu 21 d (CN-Agar, Nähragar), bis zu 4 d (Pseudalert) kein Wachstum - Bebrütungstemperatur: 20 C, 30 C, 36 C (CN-Agar) - Spatelplattenmethode, Membranfiltration (20 ml mit ca. 2 x 10 7 Zellen) - Stammunabhängig: AdS, DSM (ATCC 10145), PAO1 - Innerhalb von 10 Stunden - In verschiedenen Testmedien: reales Trinkwasser, Deionat und NaHCO 3 -Puffer (ph-bereich 6-8) - Unabhängig vom Gegenion des Kupfersalzes (Sulfat, Nitrat, Chlorid) Kupfer-Chelatoren verhindern den Verlust der Kultivierbarkeit: DDTC (100 µm), EDTA (100 µm) und Bathocuproindisulfonsäure (150 µm).

6 Wirkung von Kupferionen auf L. pneumophila in Wasser Kupferionen (10 µm) bewirken den Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila - Nährmedium: BCYE-Agar, 36 C, bis zu 10 d - Stammunabhängig: AdS (SG 1), ATCC (SG 1), ATCC (SG 6) - Innerhalb von 7 bis 8 Stunden in Deionat Kupfer-Chelatoren verhindern den Verlust der Kultivierbarkeit: DDTC (100 µm), EDTA (100 µm).

7 P. aeruginosa und L. pneumophila (Zellen bzw. KBE/mL) Konzentrationsabhängige Wirkung von Kupfer auf P. aeruginosa AdS und L. pneumophila AdS 1,0E+07 Cu-Exposition: 24 h, 20 C, ca Zellen/mL 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E Cu (µm) P. aeruginosa, Gesamtzellzahl P. aeruginosa, Koloniezahl L. pneumophila, Gesamtzellzahl L. pneumophila, Koloniezahl Kupferexponierte Zellen von P. aeruginosa und L. pneumophila: Übergang in den VBNC-Zustand?

8 P. aeruginosa & L. pneumophila (Zellen bzw. KBE/mL) n. n. n. n. Wirkung von Kupferionen auf die Vitalität von P. aeruginosa und L. pneumophila Exposition von P. aeruginosa AdS und L. pneumophila AdS (10 6 Zellen/mL), 20 C, 24 h in Deionat ± Kupfersulfat (10 µm) 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 - Cu + Cu - Cu + Cu P. aeruginosa L. pneumophila Gesamtzellzahl Koloniezahl Zellen mit intakter Membran FISH-positiv Kupferionen bewirken Verlust der Kultivierbarkeit. Kupferionen bewirken keine Abnahme der Konzentration membranintakter Zellen (LIVE/DEAD-Kit, Fluoreszenzmikroskopie) und FISH-positiver Zellen. Planktonische P. aeruginosa- und L. pneumophila-zellen im VBNC-Zustand.

9 Relative Intensität roter Fluoreszenz (Propidiumiodid, membrangeschädigte/tote Zellen) Q: 0,16 Q: 0,05 7,3 x ,6 x ,6 x ,8 x 10 4 Unbehandelt (ohne Cu) Cu 10 µm Verteilungsmuster und Verhältnis (Q) membrangeschädigter/membranintakter Zellen (P. aeruginosa AdS, LIVE/DEAD-Kit und Durchflusszytometrie) Q: 25,00 3,3 x 10 4 Q: 54,17 6,5 x 10 4 Q: 24,33 4,1 x ,3 x 10 3 Isopropanol (70 %, 24 h) 1,2 x 10 3 H 2 O 2 (1 g/l, 24 h) 1,5 x 10 3 Hitze (60 C, 1 h) Relative Intensität grüner Fluoreszenz (SYTO 9, membranintakte Zellen)

10 P. aeruginosa (Zellen bzw. KBE/Kavität) ATP (mol/zelle) Kupferwirkung auf etablierte Biofilme von P. aeruginosa (Mikrotiterplatten-Assays) Exposition von Biofilmen in Deionat für 24 h, ± Kupfersulfat 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E ,1 0, Cu (mm) 1,0E-18 1,0E-19 1,0E-20 1,0E-21 1,0E-22 1,0E-23 1,0E-24 1,0E-25 GZZ KBE FISH membranintakt Verlust der Kultivierbarkeit zwischen 50 mm Cu und 100 mm. Biofilme sind toleranter gegenüber Cu-Ionen als planktonische Zellen (ab 5 mm vollständiger Verlust der Kultivierbarkeit). Konzentration membranintakter Zellen, FISH-positiver Zellen und ATP-Gehalt bleibt nahezu unverändert. Kupferexponierte Zellen auch im Biofilm im VBNC-Zustand. ATP

11 Wirkung von Kupfer- und Silberionen auf P. aeruginosa ( Spiderweb -Diagramm) Cu (Kupfersulfat): 5 mm Ag (Silbernitrat): 0,23 mm Planktonisch ATP Gesamtzellzahl Koloniezahl ATP Gesamtzellzahl Koloniezahl Biofilm membranintakte Zellen (LIVE/DEAD) ATP Gesamtzellzahl Zellen mit 16S rrna (FISH) Koloniezahl membranintakte Zellen (LIVE/DEAD) ATP Gesamtzellzahl Zellen mit 16S rrna (FISH) Koloniezahl membranintakte Zellen (LIVE/DEAD) Zellen mit 16S rrna (FISH) membranintakte Zellen (LIVE/DEAD) Zellen mit 16S rrna Achse: Log C Cu/Ag /C 0 BMBF-Projekt, Nanosilberpartikel (Alexa Pillen)

12 P. aeruginosa (Zellen bzw. KBE/mL) Rückkehr ( Resuscitation ) der VBNC-Zellen von P. aeruginosa in den kultivierbaren Zustand 1,0E+07 DDTC-Zugabe 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 unbehandelt + DDTC (Zellen/mL) Cu-behandelt (Zellen/mL) Cu-behandelt + DDTC (Zellen/mL) unbehandelt + DDTC (KBE/mL) Cu-behandelt (KBE/mL) Cu-behandelt + DDTC (KBE/mL) 1,0E+00 0 h 24 h 4 d 7 d 14 d Expositionsdauer (d) Nach Zugabe des Chelators DDTC (100 µm) und 14 d Inkubation (20 C) in Wasser wurden kupferinduzierte VBNC-Zellen wieder vollständig in den kultivierbaren Zustand gebracht Hinweis auf Resuscitation. Keine Resuscitation : Zugabe von EDTA, Natriumthiosulfat, Natriumthioglycolat oder Waschen der Bakterien mit Deionat.

13 Literatur: Kupferinduzierter VBNC-Zustand bei Bakterien Spezies Vitalitätsmarker Resuscitation Referenz Agrobacterium tumefaciens Membranintegrität Nicht untersucht Alexander et al., 1999 Erwinia amylovora Membranintegrität + Ordax et al., 2006 Escherichia coli Membranintegrität + Grey und Steck, 2001 Escherichia coli EHEC/EAEC O104:H4 Pseudomonas aeruginosa Ralstonia solanacearum Rhizobium leguminosarum Xanthomonas axonopodis Xanthomonas campestris Membranintegrität + Aurass et al., 2011 Membranintegrität, rrna + Dwidjosiswojo et al., 2011 Membranintegrität + Grey und Steck, 2001 Membranintegrität - Alexander et al., 1999 Atmungsaktivität Nicht untersucht Del Campo et al., 2009 Membranintegrität Nicht untersucht Ghezzi und Steck, 1999

14 Zusammenfassung Kupferionen bewirken bei P. aeruginosa und bei L. pneumophila den Verlust der Kultivierbarkeit, während die Gesamtzellzahl, die Anzahl der Zellen mit intakter Zellmembran und intakter 16S rrna sowie der ATP- Gehalt (P. aeruginosa) nahezu konstant bleiben. Kupferionen induzieren VBNC-Zustand sowohl von planktonischen Zellen als auch von Zellen im Biofilm (P. aeruginosa). Induktion des VBNC-Zustands von P. aeruginosa und L. pneumophila durch Kupferionen. Rückführung von P. aeruginosa im kupferinduzierten VBNC-Zustand in den kultivierbaren Zustand durch Kupferchelator DDTC möglich. Zytoxizität und Gentoxizität von P. aeruginosa und L. pneumophila gegenüber humanen Bronchialephitelzellen wird durch Kupferionen beeinflusst nächster Vortrag. Untersuchungen zur Gen- und Proteinexpression von P. aeruginosa im kultivierbaren und VBNC-Zustand in Arbeit (Microarray-, Proteom- und MALDI-TOF-Analysen in Kooperation mit Universitätsklinikum Essen).

15 Mögliche Konsequenzen des kupferinduzierten VBNC- Zustands für die Praxis P. aeruginosa und L. pneumophila können in kupferhaltigem Trinkwasser der Trinkwasser-Installation im VBNC-Zustand vorliegen. Trinkwasserbiofilme können ein Reservoir für kupferinduzierte VBNC- Zellen darstellen. Bei negativen Befunden nach kulturellen Methoden gemäß TrinkwV ist die Anwesenheit von VBNC-Zellen nicht unbedingt auszuschließen mögliche Untererfassung der Organismen Zugabe von Chelatoren zu kupferhaltigen Trinkwasserproben möglich ISO (Probenahme für mikrobiologische Untersuchungen): Chelatbildner werden empfohlen, um Bakterien vor der Toxizität der Schwermetalle wie Kupfer oder Zink zu schützen ; z. B. EDTA, 50 mg/l. In Problemfällen: Ergänzung der routinemäßigen Kulturverfahren durch kulturunabhängige Methoden (FISH, PCR-basierte Methoden).