LABORWELT. Proteomics. Proteomanalyse in der Antibiotika- Forschung. Marktübersicht sirna-tools/services

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1 LABORWELT Nr 3 / Vol 4 Das -Themenheft Proteomanalyse in der Antibiotika- Forschung arktübersicht sirna-tools/services Proteomics Protein Binding Analysis with Surface Plasmon Fluorescence Expressions-Systeme in der Proteinforschung assiv parallele DNA-Einzelmolekül- Sequenzierung RT-PCR for easuring Gene Silencing by RNA Interference Automationsfortschritt in den Proteomics BIOCO AG

2 I N T R O Zum Thema Fokus auf Automation und Proteomics Nach der itte April vom Humangenom-Konsortium gemeldeten 99%igen Entzifferung der humanen Referenz-DNA, geht es jetzt um die Umsetzung der Genominformationen in medizinisch nutzbringende und gesellschaftlich akzeptierte Produkte Zwar ist der Weg dorthin noch weit, schreibt NIHGR-Chef Francis Collins in NATURE (24 April) Aber neuere Entwicklungen in den Feldern Automation, Proteomics und RNA-Interferenz versprechen Effizienzsteigerungen bei der Funktionsanalyse der Gene und der Targetvalidierung Wissenschaftlern der Bayer AG und der Universität Greifswald etwa ist es unlängst mit Hilfe der 2D-PAGE-basierten Proteomanalyse gelungen, die Wirkungsweise neuer Antibiotika vorauszusagen (siehe Bericht Seite 4) Und nachdem US-Forscher die Expression von Krebsund Virusproteinen mit Hilfe der RNA-Interferenz erfolgreich verhindert haben, bietet sich die kostengünstige neue Technologie als schnelle Alternative zu Knock-out-äusen an (vgl Seite 22) um Genfunktionen zu ermitteln und neue edikamenten-targets zu finden Einen Überblick über die neuen RNAi-Ressourcen kurze doppelsträngige RNAs, die sequenzspezifisch zum Abbau von mrnas in der Zelle führen sowie RNAi-Anbieter finden Sie in unserer arktübersicht sirna Tools & Services (vgl Seite 24) Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter wwwbiocomde oder auf dem beiliegenden Fax-Formular Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/ mailen Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten Im Wachstumsmarkt Proteomforschung Thema dieser LABOR- WELT-Ausgabe zeichnet sich nach Einschätzung von Prof Dr Klaus Unger von der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung ein langfristiges Nebeneinander konkurrierender Technologien ab Immer mehr der führenden Laboranbieter, die sich Ende ai auf der ACHEA in Frankfurt präsentieren, setzen auf die Automation der 2D-Gelelektrophorese-Trennung (vgl Seite 14, 32) Daneben drängen laut Unger verstärkt multidimensionale LC/S-Systeme und ikrofluidik-trennchips auf den arkt, die auch embranproteine aufzutrennen vermögen Große Zukunftschancen räumt eine neue Studie der Unternehmensberatung Frost & Sullivan der olekulardiagnostik mit Antikörper- Arrays ein Deutsche biopharmazeutische Unternehmen prüfen bereits, ob es lohnt, in die Herstellung der dafür benötigten Forschungsantikörper einzusteigen (siehe Seite 38) Wie sich Unternehmen und die deutsche Proteomforschungs-Szene in diesem Zukunftsbereich international positionieren werden, bleibt eine spannende Frage Zuletzt noch eine Information in eigener Sache: Angesichts des großen Interesses einer stetig wachsenden Zahl biowissenschaftlicher Fachgesellschaften am Bezug von LABORWELT starten wir mit dieser Ausgabe einen kostenfreien akademischen Stellenmarkt Ziel ist es, Forschungsinstituten eine qualifizierte Verteilung (vgl Seite 53) ihrer Stellenausschreibungen bei gleichzeitiger Kostenentlastung anzubieten Wir würden uns freuen, wenn Sie das Angebot nutzen würden Ihr LABORWELT-Team Kennziffer 11 LW 03 Informationen ordern? wwwbiocomde INHALT REPORT Proteomanalyse in der Antibiotikaforschung 4 Heike Brötz-Oesterhelt, Harald Labischinski et al, Bayer AG B L I T Z L I C H T Automatisierte Datenverarbeitung für Proteomics 10 Andreas Wattenberg et al, Protagen AG, Dortmund B L I T Z L I C H T Verbesserte Proteomanalyse durch Automation 14 Christoph Eckerkorn, Tecan ünchen GmbH, Kirchheim W I S S E N S C H A F T Surface Plasmon Fluorescence Techniques for 19 Protein Binding Studies Wolfgang Knoll et al, PI for Polymer Research, ainz B L I T Z L I C H T RT-PCR for easuring Gene Silencing by RNAi 22 Jill Spoerke et al, Celera Genomics, South San Francisco A R K T Ü B E R S IC H T RNA-Interferenz 24 B L I T Z L I C H T Automatisierte Protein-Analytik 32 Carsten ang, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz B L I T Z L I C H T Expressionssysteme in der Proteinforschung 34 Burkhard Ziebolz, Roche Diagnostics, annheim B L I T Z L I C H T Forschungsantikörper aus Phage Display Libraries 38 Dieter Lingelbach, orphosys AG, artinsried B L I T Z L I C H T assiv parallele Einzelmolekül-Sequenzierung 40 Christian Hennig, Genovoxx GmbH, Lübeck B L I T Z L I C H T QC-System für Bio-Imager 42 Heiko ixtacki, biostep GmbH, Jahnsdorf B L I T Z L I C H T Scaling up Automatic Protein Excision 44 Chris ann, Genetix Ltd, UK Produktwelt 48 Stellenmarkt 51 Verbände/Bestellformular 53 Termine/Impressum 54 ax-planck-gesellschaft RE-Aufnahme einer Gruppe von Haarsinneszellen einer Zebrafisch-Larve (pseudocoloriert) AG Dr Theresa Nicolson (Aufnahme), PI für Entwicklungsbiologie, Tübingen LABORWELT 4 Jahrgang Nr3/2003 3

3 R E P O R T Drug Development Anwendung der Proteomanalyse in der Antibiotika-Forschung Heike Brötz-Oesterhelt, Harald Labischinski, Antibakterielle Forschung, Bayer AG, Wuppertal Julia Elisabeth Bandow, ichael Hecker, Universität Greifswald Die Technik der Proteomanalyse findet zunehmend Anwendung bei vielfältigen Fragestellungen in der pharmazeutischen und akademischen Forschung Wir haben den Proteomansatz dazu verwendet, die komplexen physiologischen Reaktionen von Bacillus subtilis auf mehr als 30 verschiedene antibakterielle Substanzen aus klassischen und modernen Target-Bereichen zu untersuchen Die in Gegenwart der Antibiotika neusynthetisierten cytoplasmatischen Proteine wurden im pi-bereich von 4 bis 7 mittels zweidimensionaler Polyacrylamid- Gelelektrophorese (2D-PAGE) analysiert und die charakteristischen Proteinsignaturen in einer umfassenden Datensammlung zusammengestellt Obwohl sich jedes Antibiotikum durch ein individuelles Protein-Expressionsprofil auszeichnete, führten ähnliche antibakterielle Wirkmechnismen zu überlappenden Proteinsignaturen Diese Parallelen in der Expression spezifischer arkerproteine deuten an, daß es möglich sein wird, auch für neue antibakterielle Leitstrukturen Hinweise auf bislang unbekannte Wirkungsmechanismen aus dem Vergleich mit bekannten Antibiotika abzuleiten Tatsächlich gelang es eine solche Verbindung den strukturell neuen Proteinsynthesehemmer BAY als Inhibitor der Peptidyltransferase-Reaktion einzuordnen Diese Ergebnisse demonstrieren die Leistungsfähigkeit des Proteom-Ansatzes für die moderne Antibiotikaforschung Key Words: Proteomics, Bacillus subtilis, Antibiotika, Wirkmechanismus ultiple Antibiotika-Resistenzen verbreiten sich zunehmend innerhalb der bakteriellen Population und machen die Suche nach neuen Verbindungen mit innovativem Wirkmechanismus und ohne Kreuzresistenz mit bekannten Klassen unabdingbar Die Kenntnis des molekularen Targets einer neuen antibakteriellen Prüfsubstanz ist jedoch nicht nur zur Vermeidung von Resistenzproblemen wichtig, sondern auch um potentielle Interaktionen mit eukaryotischen Homologen frühzeitig zu erkennen und mögliche Target-bedingte Nebenwirkungen einschätzen zu können Aufbau einer umfassenden Proteom- Datenbank unter Antibiotikastreß Ziel des Projekts war es zu evaluieren, ob sich die Technik der Proteomanalyse zur Untersuchung des Wirkmechanismus antibakterieller Abb 1: In silico-vergleich der Autoradiogramme einer Kontrollprobe und einer Antibiotika-behandelten Probe Falschfarbendarstellung der Autoradiogramme und programmgestützte Überlagerung der zusammengehörigen Proteinspots, läßt induzierte Proteine in rot und reprimierte Proteine in grün hervortreten Verbindungen eignet 1 Zu diesem Zweck wurden mehr als 30 antibiotisch wirksame Substanzen ausgewählt darunter alle wichtigen Klassen vermarkteter Antibiotika, Inhibitoren neuer Stoffwechselwege, die sich aktuell bei verschiedenen Firmen in Forschung oder Entwicklung befinden, sowie zusätzlich Substanzen, die generelle unspezifische Zellschädigungen hervorrufen Die untersuchten Verbindungen wirkten im Bereich der RNA-, DNA-, Protein-, Fettsäure- und Zellwandsynthese und schlossen auch Schädigung der DNA-Struktur sowie embranperturbationen mit ein Als odellbakterium verwendeten wir den bestuntersuchten Gram-positiven Organismus B subtilis, der den Vorteil bietet, daß er im Hinblick auf sein Genom, sein Proteom und auch seine Reaktionen auf physiologischen Streß wie Hitze, Salz, Oxidation, Hunger etc bereits recht gut charakterisiert ist Da das Proteom einer Zelle dynamisch ist und sensibel an veränderte Umweltbedingungen adaptiert wird, analysierten wir es als Indikator für den physiologischen Zustand von Bacillus unter vielfältigem Antibiotikastreß Proteomanalyse und Identifizierung von arkerproteinen Reproduzierbare Wachstumsbedingungen und die geeignete Wahl von Antibiotika-Konzentrationen und Inkubationszeiten erwiesen sich als essentiell für die Erhebung aussagekräftiger Daten B subtilis wurde in einem definierten inimalmedium in Gegenwart von Bruchteilen und Vielfachen der minimalen Hemmkonzentration des jeweiligen Antibiotikums kultiviert und die optische Dichte der Kultur verfolgt Für jedes Antibiotikum wurden mindestens zwei Wachstumszustände untersucht, eine Situation, bei der eine erste, leichte Schädigung der Zellen zu erwarten war, und eine weitere Situation, bei der der Effekt des Inhibitors bei höheren Konzentrationen und/oder nach längeren Einwirkzeiten betrachtet wurde Alle Experimente wurden in unabhängigen Ansätzen wiederholt, um eine solide Datenbasis bereitzustellen Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe des Antibiotikums wurden Kulturaliquote mit 35 S-ethionin für 5 inuten pulsmarkiert, geerntet und mit Ultraschall aufgeschlossen Nach Abtrennung der partikulären Fraktion wurde die cytoplasmatische Fraktion mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt Dazu wurden 50 µg Proteinextrakt auf Streifen mit einem immobilisierten ph Gradienten im Bereich ph 4-7 (Amersham Pharmacia) aufgebracht und in einer ultiphor II (Amersham Pharmacia) isoelektrisch fokussiert In der zweiten Dimension wurden die Proteinbanden in vertikalen SDS-Polyacrylamid-Gelen im Investigator 2D System (Genomics Solutions) weiter separiert Nach Färbung mit Silbernitrat Kennziffer 12 LW 03 wwwbiocomde 4 Nr 3/2003 LABORWELT

4 R E P O R T Abb 2: Cluster-Analyse der verschiedenen im Rahmen des Projektes analysierten Antibiotika nach Anzahl der überlappenden arkerproteine Substanzen mit ähnlichen Wirkmechanismen clustern zusammen wurden die Gele auf PhosphorImager- Screens zur Autoradiographie exponiert Das erzeugte Autoradiogramm spiegelt die im Beobachtungszeitraum de novo synthetisierten Proteine wider, während die Silberfärbung das Gesamtprotein der Zelle detektiert (Cytoplasma, ph 4-7) Die Autoradiographie der neusynthetisierten Proteine erwies sich als das empfindlichere Verfahren, um die durch das Antibiotikum hervorgerufenen Veränderungen nachzuweisen und wurde für die meisten Analysen herangezogen Zum Vergleich des Gels der Antibiotika-behandelten Probe mit dem Kontrollansatz wurden die beiden Autoradiogramme mit Hilfe der Delta2D Software (Decodon) exakt aufeinander projiziert Gleichzeitig wurde in einem praktischen Auswerteverfahren das Kontrollautoradiogramm mit der Falschfarbe grün versehen und die behandelte Probe in rot koloriert (Abb 1) Nach Überlagern der beiden Gele in silico erscheinen Proteine rot, die unter Einfluß des Antibiotikums neu gebildet wurden, solche, deren Synthese eingestellt wurde, grün und unveränderte Proteine gelb Spots von Proteinen, deren Synthese in Gegenwart des Antibiotikums in wiederholten Experimenten mindestens um den Faktor 2 angestiegen war, wurden als arkerproteine für diese Substanz definiert Sofern sich diese Proteine in ausreichenden engen unter Einfluß des Antibiotikums akkumulierten, wurden sie nachfolgend aus mit Sypro Ruby gefärbten Gelen nicht-radioaktiver Extrakte nach tryptischem in-gel-verdau ausgeschnitten und durch peptide mass fingerprinting identifiziert Ähnliche Wirkmechnismen liefern überlappende Proteinsignaturen Eine der ersten zu beantwortenden Fragen war, ob die Proteinsignatur, die ein spezieller Inhibitor erzeugt, mit dem derzeitigen Verständnis des antibakteriellen echanismus dieser Verbindung im Einklang steht Als Grundlage für diese Untersuchung dienten die Referenzantibiotika mit bekanntem Wirkmechanismus Zahlreiche arkerproteine ließen sich tatsächlich durch literaturbekannte regulierende Vorgänge in der bakteriellen Zelle erklären So führten etwa die beiden DNA-alkylierenden Verbindungen itomycin C und Nitrochinolin-oxid zur Induktion der SOS-Antwort, was sich wie erwartet in der Induktion von RecA, DinB oder zahlreichen Proteinen des PBSX-Prophagen niederschlug Beim nächsten Beispiel, upirocin, einem Inhibitor der Isoleucyl-tRNA-Synthetase, zeigte die Proteinsignatur das typische Bild der stringenten Kontrolle, in Übereinstimmung mit dem Vorkommen unbeladener trnas in der Zelle Zusätzlich waren einige Proteine des Isoleucin/Valin-Stoffwechsels induziert und sogar das direkte Target, die α-untereinheit der Isoleucyl-tRNA Synthetase, befand sich unter den arkerproteinen Andere Beispiele, in denen das unmittelbare Target unter den arkerproteinen vertreten waren, bilden der Fettsäurebiosynthese Inhibitor Cerulenin (Target: β-ketoacylsynthase, FabF) und der kompetitive Inhibitor der DNA-Gyrase Novobiocin (Target: GyrB) Im Fall von Rifampicin war die α-untereinheit der RNA-Polymerase deutlich induziert Die β-untereinheit, die das eigentliche Target darstellt, wurde nicht als arkerprotein identifiziert Dies könnte daran liegen, daß dieses Protein zu hochmolekular ist, um auf den Gelen reproduzierbar aufgetrennt zu werden Unter den von uns ausgewählten direkten Translationsinhibitoren ließen sich zwei große Gruppen unterscheiden: Zum einen solche Verbindungen, die das Ribosom arretieren und ein Weiterrücken der Synthesemaschinerie auf der mrna unterbinden Diese Gruppe repräsentiert durch Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin und Fusidinsäure bewirkte eine verstärkte relative Expression von ribosomalen Proteinen und Elongationsfaktoren Im Gegensatz dazu zeigten die Aminoglycoside und Puromycin ein vollkommen anderes Bild und induzierten die Synthese von Chaperonen und Proteasen Auch dieser Befund ist verständlich, da die Zelle durch die Vertreter dieser letzten Gruppe mit einer Vielzahl von fehltranslatierten und verkürzten Polypeptiden überschwemmt wird, die sie umzufalten und abzubauen versucht Kennziffer 13 LW 03 wwwbiocomde 6 Nr 3/2003 LABORWELT

5 R E P O R T Abb 3: Proteom-Vergleich des Pyrimidinon Antibiotikums BAY mit dem klassischen Peptidyltransferase Inhibitor Chloramphenicol Beide Substanzen zeigen stark überlappenden Proteinsignaturen Ähnliche Übereinstimmungen ergaben sich auch zu Erythromycin, Fusidinsäure und Tetracyclin Zusammenfassend läßt sich folgern, daß viele der beobachteten Effekte auf Proteomebene im Lichte des bekannten Wissens über die Antibiotikawirkung rational nachzuvollziehen sind Keine der beobachteten Proteinsignaturen eines Antibiotikums stimmte jedoch exakt mit der eines anderen überein Dies reflektierte die Individualität jedes der getesteten Hemmstoffe Gleichwohl zeigte sich deutlich, daß Substanzen mit ähnlichem echanismus oder ähnlichen Auswirkungen auf den Bakterienstoffwechsel zu überlappenden Proteinmustern führten (Abb 2) Damit stellt sich das System als geeignete Grundlage für die Einordnung neuer Prüfsubstanzen mit unbekanntem echanismus dar Tatsächlich fiel das neue Pyrimidinon-Antibiotikum Bay , auf das wir unser System erstmals angewendet haben, in ein Cluster mit sämtlichen anderen Inhibitoren der ribosomalen Elongation (Abb 3) Dies deutet auf eine Hemmung der Peptidyltransferase-Reaktion hin, was durch unabhängige biochemische Untersuchungen mit dem strukturverwandten Tan 1057 A/B unterstützt wird 2 Nicht unerwähnt sollte jedoch bleiben, daß sich auch zahlreiche Proteine mit bislang unbekannter Funktion unter den arkerproteinen befanden Zusätzlich schlossen die Signaturen auch diverse unerwartete und zum Teil bisher unverständliche Reaktionen ein, die als neue Bausteine zum komplexen Puzzle der Antibiotikawirkung addiert werden können Detektion neuer Proteinmodifikationen auf 2D-Gelen Eine besondere Leistungsfähigkeit der Proteomanalyse liegt in der Detektion von Proteinmodifikationen Das Beispiel des Peptid- Deformylase-Inhibitors Actinonin demonstrierte eindrucksvoll den Effekt der verbleibenden Formylgruppe am Start-ethionin auf das Laufverhalten der Proteine auf den 2D-Gelen In Gegenwart von Actinonin gewonnene Proben wiesen bislang noch nicht beobachtete Proteinspotverschiebungen auf Das Ausmaß dieser Verschiebung war so immens, daß es nicht möglich war, das Autoradiogramm der Actinonin-behandelten Probe unmittelbar mit dem der Kontrollprobe in Übereinstimmung zu bringen Überlagerung des Autoradiogramms mit den silbergefärbten Proteinsspots desselben Gels deckte die Ursache auf (Abb 4) Es zeigte sich, daß die ehrheit der unter Actinonin neu synthetisierten Proteine einen pi besaßen, der im Vergleich zum Originalspot zum Sauren hin verschoben war assenspektrometrische Analysen (ALDI-TOF und ESI) zeigten, daß in diesen neu aufgetretenen Proteinformen das N-terminale ethionin formyliert vorlag Neben dem direkten Nachweis der gehemmten Aktivität des Actinonin-Targets war dies der erste Nachweis der Formylierung als einer Form der Proteinmodifikation auf 2D- Gelen In vertieften Untersuchungen wurden solche formylierten Proteine nachträglich auch in B subtilis -Zellen nachgewiesen, die in Abwesenheit des Antibiotikums gewachsenen waren 3 Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse, daß die Technik der Proteomanalyse dazu geeignet ist, das Verständnis der bakteriellen Reaktion auf bekannte Antibiotikaklassen zu vertiefen und Hinweise zum Wirkmechanismus neuer antibakterieller Leitstrukturen zu liefern Eine weiterführende Publikation enthält ausführlichere Beschreibungen der beobachteten Signaturen 1 Die Datensammlung ist darüber hinaus auch auf folgender Webseite abgelegt: waldde:8880/antibiotics/ Literatur [1] Bandow, J E, Brötz, H, Leichert, L I O, Labischinski, H, und Hecker, ; Proteomic approach to understanding antibiotic action Antimicrob Agents Chemother, 47, (2003) [2] Boddecker, N, Bahador, G, abery, E, Wolf, J J, Xu, L, Watson, J C Abstractband 41 st ICCAC, Seite 245 (2001) [3] Bandow, J E, Becher, D, Büttner, K, Hochgräfe, F, Freiberg, C, Brötz, H, und Hecker, ; The role of peptide deformylase in protein synthesis: a proteomic study Proteomics, 3, (2003) Korrespondenzadresse Abb 4: Proteinspotverschiebung in Gegenwart von Actinonin Vergleich des Autoradiogramms mit der Silberfärbung desselben Gels Durch blockierte Abspaltung der Formylgruppe erfahren die Proteine eine pi-verschiebung zum Sauren Dr Heike Brötz-Oesterhelt Bayer AG, Anti-Infectiva Pharmaforschungszentrum Aprather Weg 18a, D Wuppertal Tel/Fax: +49-(O) /-4116 eail: Kennziffer 14 LW 03 wwwbiocomde 8 Nr 3/2003 LABORWELT

6 B L I T Z L I C H T LIS Proteomanalyse durch automatisierte Datenverarbeitung Bei einer großen Zahl an automatisch analysierbaren Proben ist die Kontrolle der Datenund Probenflüsse im Labor und eine parallelisierte Datenauswertung wichtig für eine erfolgreiche Proteomanalyse Zum einen müssen Daten für die Steuerung einzelner Geräte und von Geräten erzeugte Daten weitergegeben und zentral verwaltet werden (LIS) Zum anderen müssen vom assenspektrometer (S) erzeugte Daten weiterverarbeitet, in Primärstrukturinformationen umgewandelt und mit den biochemischen Daten der Probe unter Berücksichtigung der biochemischen Fragestellung der Proteomstudie korreliert werden (Bioinformatik) Eine Trennung beider Ebenen in ein LIS (Sample Tracking) und eine Proteom-Datenbank (Knowledge Library) ist sowohl aus Stabilitäts- und Kompatibilitäts- als aus Transparenzgründen vorteilhaft Andreas Wattenberg, artin Blüggel, Protagen AG, Dortmund Die Automatisierung von Proteomanalysen ist von großem Interesse, allerdings hat die Vielfalt der Analysetechniken sowie die Komplexität der Analyseschritte eine allgemein verwendbare Automatisierung bislang erschwert Für Proteomstudien mit Hilfe von 2D-Gelen und massenspektrometrischer Analyse gibt es inzwischen einen weitgehend standardisierten, automatisierbaren Arbeitsablauf ehrere Firmen bieten komplette Geräte-Lösungen (Proteomics-Straßen) oder Teillösungen an Die elektronische Datenverarbeitung soll dabei die Aufgaben eines Labor Informations anagement Systems (LIS) und der bioinformatischen Datenauswertung erfüllen Die softwaretechnische Umsetzung muß hohe Anforderungen an die Flexibilität der Anbindung weiterer Techniken, des Durchsatzes, der Prozeß-Stabilität, der Transparenz sowie eine Integration in die bioinformatische Auswertung erfüllen Die Umsetzung des vielschichtigen Anforderungsprofils für die Datenverarbeitung einer Proteomanalysestraße wird am Beispiel der PROTEINEER T Line (Bruker Daltonik) dargestellt Proteomanalysestraße Kommerziell erhältliche Roboterplattformen und Implementierungen von Laborprotokollen sind bei unterschiedlichen Proteomanalysestraßen sehr verschiedenen Generell läßt sich aber die Analyse in diskrete Schritte unterteilen Zunächst wird das Proteom mittels 2D-Gelelektrophorese in die einzelnen Proteine aufgetrennt Diese Technik erlaubt auch ohne Automatisierung eine hohe Trennleistung und Parallelisierung für mehrere Proteine pro Woche Anschließend werden die angefärbten Proteine mit einem Roboter aus dem 2D-Gel ausgestochen und einzeln in eine ikrotiterplatte abgelegt Im nächsten Schritt werden die Gelstücke gewaschen, die Proteine enzymatisch verdaut und für die assenspektrometrie vor- bereitet (zb ALDI-Target-Präparation) Im letzten Schritt erfolgt die Analyse der Proben im assenspektrometer Als S-Verfahren finden die LC-ESI-S oder die ALDI-S Einsatz, wobei das letztere Verfahren für eine Automatisierung bevorzugt verwendet wird Der Ablauf der Analyse und die entsprechenden Datenflüsse sind in Abbildung 1 dargestellt Die erste Komponente in der Analysestraße ist ein Roboter (Spot-Picker), der die angefärbten Proteine aus dem 2D-Gel aussticht Dabei müssen die Koordinaten der einzelnen Proteinspots im Gel möglichst exakt bestimmt werden, um ein präzises Ausschneiden zu gewährleisten Ein hochaufgelöstes Bild des 2D-Gels wird deshalb direkt auf dem Roboter mit Hilfe eines speziell entwickelten Durchlichtscanners erzeugt Neben der Kommunikation mit einer externen Imageanalysesoftware ist eine Positionsbestimmung der Spots durch eine auf dem Roboter integrierte Spoterkennung möglich Bei der Auswahl der zu analysierenden Proteinspots können auch Analyseprotokolle für die folgenden Schritte festgelegt und zum LIS exportiert werden Die zweite Komponente bildet ein Verdau- Roboter, der die ausgestochenen Gelstücke in einem mehrstufigen Prozeß wäscht, enzymatisch verdaut und vollautomatisch auf einen ALDI-Probenträger präpariert Für diesen Roboter sind die verwendeten Protokolle entscheidend, um auch kleinste Proteinmengen erfolgreich zu analysieren Da dieser Prozeß für die Nachweisempfindlichkeit der gesamten Analyse limitierend ist, wurden bei der Entwicklung des Roboters die Protokolle durch ein definiertes Testsystem optimiert Parallel dazu sind definierte Chemikalienkits, die alle für den Roboter nötigen Reagenzien in verschlossenen Behältern enthalten, für eine optimale Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit notwendig Die dritte Komponente der Analysestraße ist ein ALDI-S, in dem die Proben aus dem Verdauroboter analysiert werden Die S-Daten bilden die Basis für eine bioinformatische Analyse der Primärstruktur der Proteine Die Besonderheit der neuen ALDI- S-Generation ist, daß neben ALDI-Peptid-assen-Fingerprint- (PF) Spektren auch Fragmentspektren einzelner Peptide direkt aus dem komplexen Gemisch heraus in hoher Qualität erzeugbar sind (Peptid Fragmentierungs Fingerprints, PFF) So ist es möglich, die Aminosäuresequenz eines Peptids zu bestimmen und eine höhere Signifikanz der Proteinidentifikation und der Analyse von posttranslationalen odifizierungen zu erhalten Das LIS ist für die Speicherung der Prozeßdaten und die Probeninformationen elementar Die Stati einzelner Proteinspots ( detec- Abb 1: Informationsfluß in der Proteomanalysestraße Prozeß-spezifische Informationen werden von den einzelnen Robotern in das LIS geschrieben und abgerufen Die erzeugten Daten werden in der Knowledge Library mit weiteren Daten kombiniert und ausgewertet Kennziffer 15 LW 03 wwwbiocomde 10 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT LIS

7 B L I T Z L I C H T ted, picked, digested, acquired, identified ) werden zentral erfaßt und den Robotern zur Verfügung gestellt Damit kann die Software der Robotersteuerung vom LIS die benötigten Informationen erhalten und die Informationen nach Prozeßbeendigung zurückschreiben Die Protokolle, die an den einzelnen Stellen der Straße angewendet werden sollen, sind im voraus definierbar und erhöhen so den Automatisierungsgrad Voraussetzung dafür ist, daß die Nachverfolgung der Probe (des Proteinspots) an allen Stellen der Straße möglich und eindeutig ist Dazu werden die drei Probenträger das Passepartout des 2D-Gels, der Halter der ikrotiterplatte und das ALDI-Target mit einem Transponder versehen Auf dem Transponder wird für die Probe eine Zahlenkombination zur eindeutigen Indentifizierung gespeichert Der Vorteil eines Transponders gegenüber einem Barcode ist, daß er neben dem Auslesen auch beschrieben werden kann Der Status kann damit nach Beendigung des Protokolls inkrementiert werden Jede Probenposition der Proteomanalysestraße ist mit einer Lese- und Schreibstationen ausgestattet und stellt so eine verwechslungsfreie Nachverfolgung der Proben sicher Durch eine definierte Schnittstelle ist eine Einbindung weiterer Roboter gleichen Typs oder auch von Systemen verschiedener Hersteller möglich Bioinformatik Abb 2: Annotiertes 2D-Gel Die Stati der Prozessierung der einzelnen Proteinspots können nachverfolgt werden Die identifizierten Proteine werden direkt im 2D-Gel annotiert Für die bioinformatische Analyse der Daten ist eine komplexe Datenbanksoftware wie die Proteomdatenbank-Software Proteinscape (Bruker Daltonik) nötig Zuerst werden Daten zur biochemischen Fragestellung der Proteomstudie und zu den Proben vor der Proteinauftrennung erfaßt Die Datenbank speichert die Daten aus den einzelnen Schritten der Proteomanalysestraße in einer hierarchischen Struktur So können die S-Spektren (PF und PFF) vollautomatisch Gelbildern und Spotkoordinaten des Spotpickers zugeordnet werden (Abb 2) Der Umwandlung von S- Daten in die Primärstrukturinformation der Proteine kommt eine zentrale Rolle zu Der Ablauf einer typischen ALDI-Datenanalyse ist in Abbildung 3 dargestellt Die assenspektren werden aufgrund immer wieder auftretender Ionen (zb tryptischen Eigenpeptiden, Ionen des Farbstoffs, Keratin- Hintergrund) nach der Peak-Erkennung erneut intern kalibriert Dann werden die olekulargewichte der Kalibranten eliminiert, so daß nur unbekannte assen der Peptide an die Suchmaschinen geschickt werden Für eine optimale Proteinidentifizierung muß diese Kalibrantenliste automatisch und spezifisch für jedes Labor und Projekt erzeugt werden Für die Auswertung der assenspektren werden oft mehrere Suchalgorithmen mit verschiedenen Suchstrategien verwendet Die Suchergebnisse müssen für eine übersichtliche Ergebnisdarstellung zusammengefaßt werden Für eine automatisierte Auswertung ist es dabei wichtig, aus den Ergebnissen aller Suchmaschinen einen etascore zu errechnen, der für die Beurteilung der Signifikanz unabhängig von verwendeten Suchmaschinen und Strategien ist Die Datenauswertung muß eine intelligente und parallele Prozessierung vieler Spektren ermöglichen, da große Datenmengen manuell nicht mehr einzeln prozessierbar sind So dauert eine automatisierte Datenanalyse für einen Proteinspot weniger als zwei inuten Durch eine Aufgabenverteilung auf mehrere Computer ist ein Durchsatz von mehreren tausend Proteinproben pro Tag möglich Die identifizierten Proteine können durch komplexe Abfragemöglichkeiten in Beziehung zu der Projektfragestellung gebracht werden Dazu werden Proteinlisten geclustert, verglichen sowie die Ontologie der Proteine verglichen und bewertet Ausblick Die Einführung von Proteomanalysestraßen ermöglicht eine Analyse ganzer 2D-Gele mit mehreren tausend Proteinspots Eine enge Verzahnung der Datenverarbeitung mit den einzelnen Komponenten der Analysestraße bietet einen hohen Automatisierungsgrad und eine parallele Datenverarbeitung in vielen Einzelschritten So können erstmals komplexe Proteome auf molekularer Ebene analysiert und auf Ebene der identifizierten Proteine verglichen werden Dieses neue Proteomanalyse-Werkzeug wird neue Ansätze der Proteomforschung ermöglichen Korrespondenzadresse artin Blüggel Protagen AG Emil-Figge-Str 76A, D Dortmund Tel/Fax: +49-(0) / -891 eail: Abb 3: Analyse von massenspektrometrischen wwwprotagende Daten der Proteomanalysestraße zur Primärstruktur-Identifizierung von Proteinen Kennziffer 16 LW 03 wwwbiocomde 12 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

8 B L I T Z L I C H T Proteomik Kennziffer 17 LW 03 wwwbiocomde Automatisierte Proteinanalytik steigert Reproduzierbarkeit, Sensitivität und Durchsatz PD Dr Christoph Eckerskorn, Tecan ünchen GmbH, Kirchheim Aus den Sequenzdaten des Human-Genoms lassen sich etwa Gene ableiten Die Identifizierung vieler Proteine nach zweidimensionaler elektrophoretischer Auftrennung (2D-PAGE) haben jedoch gezeigt, daß die meisten Proteine posttranslational modifiziert werden und in mehreren Protein-Isoformen in der Zelle vorkommen Die Herausforderung für die Proteinanalytik besteht unter anderem darin, daß von einem komplexen Proteingemisch von mehr als verschiedenen Protein-Isoformen ausgegangen werden muß Hinzu kommt, daß sich die Zusammensetzung der exprimierten Proteine sowie deren kovalente odifikationen in Abhängigkeit der Dynamik zellulärer Vorgänge verändert Die physiko-chemischen Eigenschaften von Proteinen wie etwa die Löslichkeit sind extrem unterschiedlich, ihre absoluten Konzentrationen in der Zelle verteilen sich über mehr als sechs Größenordnungen Oft läßt sich diese große zelluläre Komplexität mit bestehenden ethoden der Proteinanalytik nicht zufriedenstellend darstellen Um limitierenden Faktoren wie mangelnder Reproduzierbarkeit, geringer Sensitivität und geringem Durchsatz zu begegnen, entwickelt Tecan automatisierte Technologien, die einzeln oder als Produktserie (Abb 1) einsetzbar sind Die vielen Versuche der vergangenen Jahre, die Proteine einer Zelle hinsichtlich ihrer quantitativen Zusammensetzung und ihres interaktiven Zusammenwirkens zu untersuchen (Proteomics), zeigten rasch die außerordentlich große Komplexität des Systems Zelle und die damit verbundenen Grenzen der zur Zeit zur Verfügung stehenden Technologien Wesentliche Limitierungen werden durch mangelnde Reproduzierbarkeit einzelner ethoden, eine zu geringe Sensitivität und einen geringen Probendurchsatz verursacht Die existierenden elektrophoretischen oder chromatographischen Trennmethoden reichen in ihrer Auflösung allein nicht aus um auch die seltenen sogenannten low abundant Proteine in einem komplexeren Proteingemisch nachzuweisen und zu quantifizieren Außerdem fehlen noch standardisierte ethoden zur Vorbereitung von Proben, die reproduzierbar sind und einen definierten Ausgangs- oder Referenzzustand eines Proteoms repräsentieren Proteinanalytik eine technologische Herausforderung Tecan will mit einer zweigleisigen Strategie verbesserte Technologien für die Proteinanalytik entwickeln Auf einer ersten Ebene werden für die einzelnen Schritte der Proteinanalytik automatisierte Instrumente entwickelt Dabei wird neben der Reduktion manueller Arbeitsschritte vor allem Wert auf die Kontrolle sämtlicher experimenteller Parameter (Temperatur, elektrische Spannung, Zeit etc) gelegt, um optimale Reproduzierbarkeit und Standardisierung zu erzielen Die ProTeam - Produktserie besteht, entsprechend dem experimentellen Vorgehen von der ganzen Zelle zur Identifizierung und Charakterisierung einzelner Proteine, aus folgenden odulen: Cell aintenance System: AutomatisierteZellkultivierung und Verfahren für reproduzierbare und konsistente Präparationen; ProTeam FFE: (Semi-)präparative Trenntechnologie zur Fraktionierung geladener Partikel und oleküle wie Peptiden, Proteinen, Zellorganellen und Zellen in Lösung; ProTeam 2D: Automatisierte 2D-PAGE mit den einzelnen odulen ProTeam IEF, Pro- Team Casting, ProTeam PAGE sowie Pro- Team Staining inklusive Imaging und Spot Picking; ProTeam Digest: Automatisiertes System um gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteine für die assenspektrometrie zu prozessieren (Proteinverdau, peptidchemische odifizierung und Probenvorbereitung für die assenspektrometrie); ProTeam IPE: Software für das Proben- Handling, Daten-Tracking und die Integration und Kombination mit Datenbanken für eine anschließende Datenanalytik ProTeam Crystallization: Automatisiertes Verfahren zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für eine Proteinkristallisation Das Design der Geräte erlaubt es, diese sowohl als Stand-alone-Instrumente als auch in integrierten Kombinationen für verschiedene proteinchemische Fragestellungen zu nutzen Auf einer zweiten Ebene entwickelt Tecan integrierte Lösungen wie etwa die komplett automatisierte Plattform Spotpicking - Protein Digest - S-Interface oder 2D-PAGE Einige Komponenten der ProTeam-Produktserie sind in Abbildung 1 dargestellt A B C D E F Abb 1: Kernkomponenten der neuen Tecan-Workstation für Fraktionierung (A: Free-Flow-Elektrophorese, B: Probenvorbereitung), Trennung (C: Isoelektrische Fokussierung, D: Gelgießen, E: SDS-PAGE, nicht dargestellt: Färben) und Protein-Prozessierung für weitere Analysen (nicht dargestellt: Spot Picking, F: Gelverdau) Weitere Details: siehe Text 14 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

9 B L I T Z L I C H T Abb 2: Vergleich von Leberproteinen aus der Ratte Links: Direkter Auftrag des Proteingemisches auf ein 2D-Gel (ph-gradient: 3,5 bis 5) Rechts: Eine etwa 10fache enge des Proteingemisches wurde über FFE fraktioniert Die drei FFE-Fraktionen (von 40 proteinhaltigen Fraktionen) mit den entsprechenden IEP-Bereichen sind auf drei unabhängigen 2D-Gelen (ph-gradient: 3,0 bis 6,5) aufgetrennt Free-Flow-Elektrophorese vielseitige Trenn- und Fraktionierungsmethode ProTeam FFE arbeitet nach dem Prinzip der Free-Flow-Elektrophorese (FFE) Darunter versteht man eine trägerfreie Elektrophorese, bei der der Trennprozeß in Abwesenheit einer festen atrix wie beispielsweise Acrylamid stattfindet Statt dessen werden Analyte in einem kontinuierlichen, laminaren Fluß von Pufferlösungen in einem quer zum Fluß angelegten Feld entsprechend ihrer Ladung und ihrer elektrophoretischen obilität getrennt Der laminare Fluß wird am Ende der Trennkammer in 96 Kapillaren übertragen, wodurch eine kontinuierliche Fraktionierung im ikroplattenformat ermöglicht wird Entsprechend der Zusammensetzung der Trennmedien können drei verschiedene Trennprinzipien angewendet werden: Isoelektrische Fokussierung (IEF), Zonenelektrophorese (ZE) und Isotachophorese (ITP) Die Probe kann zu jedem Zeitpunkt in den kontinuierlich laufenden laminaren Fluß injiziert werden Dies kann wenigen 100 µl in einigen inuten bis hin zu 100 ml in einem 24-stündigem Lauf entsprechen Dabei können Probenmengen bis zu etwa 30 mg pro Stunde getrennt werden Die Trennzeit und damit auch die Verweildauer der Probe im elektrischen Feld ist abhängig von der Flußrate und beträgt in Abhängigkeit der elektrophoretischen ethode etwa 15 bis 25 inuten Aufgrund der fehlenden atrix und den damit fehlenden Wechselwirkungen können sowohl kleine oleküle (Peptide) sowie große Polymere (Proteine) bis hin zu Partikeln (Zellorganellen) getrennt werden, sofern sie eine Ladung tragen oder durch odifikation geladen werden können Neben denaturierenden Trennbedingungen sind auch native Fraktionierungen möglich, die beispielweise zur Trennung von Zellen oder Proteinkomplexen eingesetzt werden Die FFE ist ferner mit nicht-ionischen und zwitterionischen Detergenzien kompatibel, wodurch periphere und transmembrane embranproteine getrennt werden können Die FFE ist mit ihren vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten optimal dazu geeignet die Komplexität einer Probe durch Vorfraktionierung zu reduzieren Dies kann zum einen durch die Isolierung verschiedener Zellorganellen erreicht werden 1, oder durch die Fraktionierung des kompletten zellulären Proteingemisches Die FFE-Fraktionen können dann einzeln in der hochauflösenden 2D-PAGE (Abb 2) oder in weiteren chromatographischen Schritten aufgetrennt wer- Abb 3: ProTeam IEF (siehe Abb 1C) für die vollautomatische Durchführung der IPG-Fokussierung im Rahmen der 2D-Elektrophorese Links: Robotisches Aufsetzen des Prozeßkammerdeckels mit integrierten Elektroden und Probenauftragegefäßen Rechts: Automatische Probenapplikation mit einem Acht-Kanal-Pipettierarm den Da die Proteinmenge jeder FFE-Fraktion nur von der eingesetzten enge an Ausgangsmaterial abhängig ist, stehen für die weiteren Trennverfahren größere Proteinmengen zur Verfügung, deren Komplexität im Vergleich zum Ausgangsmaterial deutlich reduziert ist Somit können Proteine mit geringer zellulärer Konzentration detektiert und in den Empfindlichkeitsbereich der nachfolgenden Analytik (assenspektrometrie, ELISA, etc) angereichert werden Für die Aufkonzentrierung und Entsalzung größerer Volumina der FFE-Fraktionen stehen chromatographische Verfahren zur Verfügung wie beispielweise die Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) Dies kann unter anderem automatisch über entsprechende SPE-ikrotiterplatten auf einer Workstation für die Probenvorbereitung (Abb 1B) durchgeführt werden Die konzentrierten Proteingemische können dann mit hohen Rückgewinnungsraten unter Bedingungen eluiert werden, die für die nachfolgenden Trennmethoden wie 2D- PAGE oder Chromatographie kompatibel sind Alternativ können die FFE-Fraktionen auch über Ultrafiltration aufkonzentriert und umgepuffert werden Weitere Optionen auf der automatisierten Workstation sind das essen der ph-profile der FFE-Trennungen, UV- oder Fluoreszenzmessungen, Proteinbestimmung sowie die enzymatische Spaltung der Proteine und anschließende chemische odifizierung der entstandenen Peptide 2D-PAGE eine hochauflösende Trennmethode für Proteine Die Kopplung zweier komplementärer und effizienter elektrophoretischen Trennprinzipien die Isoelektrische Fokussierung (IEF) und die SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-PAGE) macht die 2D-PAGE zu einer optimalen Trenntechnik für Proteine Beide ethoden sind prinzipiell aufgrund spezieller Puffersysteme und Detergenzkompatibilität für alle Proteine einsetzbar Der hohen Auflösung dieser ethode stehen jedoch speziell für Proteomeprojekte unzureichende Reproduzierbarkeit und Anwenderfreundlichkeit gegenüber Diese Nachteile sind bedingt durch eine Vielzahl, teilweise aufwendiger manueller Arbeitschritte, und eine fehlende präzise Kontrolle über physikalische Parameter wie Temperatur, elektrische Felder oder Pufferkapazitäten Tecan hat mit der Entwicklung der ProTeam 2D-Suite durch eine weitgehende Automatisierung und Kontrolle der entscheidenden Prozeßparameter die Qualität der Trennung verbessert und die Reproduzierbarkeit erheblich gesteigert Kennziffer 18 LW 03 wwwbiocomde 16 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

10 B L I T Z L I C H T Der komplett automatische ProTeam IEF- Prozeß (Abb 1C und Abb 3) beginnt mit einer Rehydratisierung von bis zu 16 IPG- Streifen (Polyacrylamidmatrix mit immobilisiertem ph-gradienten) Die IPG-Streifen befinden sich auf einem Träger, der die Schnittstelle zur nachfolgenden 2D-Elektrophorese darstellt Nach sechs bis acht Stunden werden die Proben appliziert (Cup-loading) und die Fokussierung startet gemäß per Software voreingestellter Parameter wobei jeder IPG-Streifen von einer Stromversorgung gespeist und überwacht wird (max V) Diese Konfiguration ermöglicht eine maximale Flexibilität, denn mit ProTeam IEF können völlig unterschiedliche IPG-Streifen gleichzeitig ohne Qualitätsverlust prozessiert werden Nach ergaben nach einem Vergleich verschiedener 2D-Gele mit einem Format von 26 x 20 cm eine Standardabweichung der Spotpositionen von durchschnittlich einem Prozent Protein-Identifizierung und -Charakterisierung Für eine weitere Analyse der gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteine werden die proteinhaltigen Gelstückchen automatisch ausgestanzt und in ikroplatten abgelegt Die Weiterverarbeitung der Proteine, beginnend mit Waschprozeduren, Umpufferungen und enzymatischem Verdau, wird komplett automatisiert in einer neuen icro- SPE-Platte (TecPrep 96) auf dem ProTeam Digest (Abb 1F) durchgeführt Die TecPrep tation der experimentellen Parameter substantiell zu einer Verbesserung der Proteinanalytik bei Durch die höhere Reproduzierbarkeit werden Experimente vergleichbarer Dies ermöglicht weitere proteinanalytische Applikationen wie eine zeitaufgelöste Quantifizierung von Proteinexpression in der Wirkstoffsuche und -Validierung oder der Toxikologie Der Aufwand für einzelne Experimente reduziert sich durch die Qualität der Ergebnisse, wodurch signifikant Ressourcen und Kosten gespart werden können Die Integration der FFE stellt eine zusätzliche Trenndimension zur Verfügung In der Kombination mit einer weiteren hochauflösenden Trenntechnik wie beispielweise der 2D-PAGE sind auch Proteine mit gerin- Abb 4: ProTeam Digest (siehe Abb 1F) für die Prozessierung der proteinhaltigen Gelstückchen für die ALDI-assenspektrometrie Der komplette Proteinverdau sowie die Aufkonzentrierung und Entsalzung wird in der TecPrep 96- Platte (links) durchgeführt und in kleinen Volumina direkt auf das ALDI-Target gespottet (rechts) einer erfolgreichen Fokussierung werden die IPG-Streifen für die zweite Dimension (SDS-Elektrophorese) automatisch equilibriert Das ProTeam Casting System (Abb 1D) nutzt die Eigenschaften eines automatisierten Liquid-Handling-Systems für die reproduzierbare Herstellung von SDS-Gelen Dabei werden sowohl die Vorbereitung der Lösungen (ischung der Reagenzien, Sauerstoffgehalt, Temperatur, etc) als auch die Polymerisation (Geschwindigkeit, Temperatur etc) präzise kontrolliert Die fertigen Gele zeichnen sich gegenüber manuell produzierten Gelen durch eine erhöhte Qualität und Stabilität aus Das Beladen der SDS-Gele mit den Streifen der ersten Dimension geschieht durch einfaches Einschieben des Trägers in den vorgesehenen Spalt der Gelkassette Dabei unterstützt der Träger des IEF-Streifens eine präzise Positionierung auf dem SDS-Gel Entsprechend der ersten Dimension werden auch bei der ProTeam PAGE alle entscheidenden Parameter, wie elektrische Bedingungen, Pufferkapazität, Ionenverfügbarkeit und Temperatur kontrolliert und angezeigt Die Laufzeit kann dadurch extrem verkürzt werden und liegt im Bereich von weniger als sechs Stunden für eine Trennstrecke von 21 cm Die mit ProTeam PAGE prozessierten SDS-Gele werden anschließend mittels eines speziellen Floating-Systems kontrolliert gefärbt Erste Ergebnisse mit Prototypen der ProTeam 2D 96 besteht aus einer speziellen ikroplatte, bei der jedes Well mit einer Quartzkapillare bestückt wurde, die mit einem neuartigen, monolithischen reversed phase- aterial gefüllt ist (Abb 4 links) Die bei der enzymatischen Spaltung entstandenen Peptidgemische können in dieser ikroplatte mit hohen Ausbeuten vom ursprünglichen Gelstückchen direkt auf die reversed phase-oberfläche der onolithen extrahiert werden In einem weiteren Schritt werden die aufkonzentrierten und entsalzten Peptide in Volumina kleiner als 1µl direkt auf die Analyseplatten (Targets) entsprechender ALDI-assenspektrometer eluiert (Abb 4 rechts) it dieser Prozeßführung (geringe Volumina und keine Transferschritte) werden die Verluste an Peptiden durch unspezifische Adsorption an Oberflächen minimiert So konnte eine erhebliche Steigerung der Sensitivität dieser ethode erreicht werden Proteinmengen von weniger als ein Femtomol konnten über Peptide ass Fingerprinting nachgewiesen werden Der Durchsatz dieser ethode im ikroplatten-format erlaubt die Prozessierung von mehr als 3000 Proteinen pro Tag Zusammenfassung Die Tecan ProTeam-Produktgruppe trägt durch Automatisierung vieler Teilschritte sowie durch die Kontrolle und Dokumengeren Konzentrationen (low-abundant proteins) zugänglich Die ersten Ergebnisse einer Trennung von Leberproteinen über FFE-2D-PAGE zeigten bereits für die ersten 20 FFE-Fraktionen mehr als Proteine beziehungsweise Protein-Isoformen Der qualitative wie quantitative analytische Zugang zu einer größeren Zahl von Proteinen ist ein weiterer Schritt zu einem besseren Verständnis zellulärer Vorgänge Literatur [1] Zischka et al,2003, Improved proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae mitochondria by Free-Flow Electrophoresis, Proteomics, in press Korrespondenzadresse PD Dr Christoph Eckerskorn Tecan ünchen GmbH Feldkirchner Straße 12a D Kirchheim Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwtecancom Kennziffer 19 LW 03 wwwbiocomde 18 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

11 W I S S E N S C H A F T Protein Binding Assay Surface Plasmon Fluorescence Techniques for Interfacial Protein Binding Studies Fang Yu, Döne Demirgöz and Prof Wolfgang Knoll, PI for Polymer Research, ainz The development of methods for the quantitative evaluation of interactions between proteins and their surface-bound ligands or between different proteins at interfaces is an essential step towards experimental schemes that eventually will allow for a better understanding of biochemical reaction pathways, will be instrumental in gene expression studies, or can be used for drug screening assays Other than in the case of DNA studies for which established chip fabrication and read-out protocols are well documented the protein array technology still suffers from a number of unsolved problems: (1) The multiple functionalization of the sensor surface by one of the interaction partners still constitutes a major challenge in that the surface attachment should not lead to a modification of the binding affinity or even to partial denaturing of the protein; (2) unlike for DNA or oligonucleotides the non-specific interaction of proteins with the functionalized sensor surface is still not completely under control; (3) the required assay sensitivity exceeds the detection limits of most experimental techniques; (4) none of the existing detection principles allows for the in situ real-time recording of multiple binding events in an array format Especially the latter two problems could be solved by a recently developed fluorescence detection scheme that employs the optical field enhancement mechanisms operating at resonant excitation of surface plasmon modes at a precious metal/dielectric interface 1 A surface plasmon (more precisely, a plasmon surface polariton) is the coupled state of an elementary excitation of the nearly free electron gas of a precoius metal the plasmons and an electromagnetic mode propagating along a metal/dielectric interface 2 It constitutes a kind of surface light that interacts with matter in a way equivalent to planar electromagnetic waves or normal photons Owing to their specific dispersion properties, ie their energy-momentum relation, surface plasmons cannot be excited directly by an incoming laser beam but require a grating or a prism as a so-called plasmon coupler The corresponding experimental setup is shown schematically in Figure 1(A) Briefly, the excitation laser light chopped for lock-in detection and linearly p- polarized in the plane of incidence is reflected off the metal-coated base of the coupling prism (cf also Fig 1(B)) and is monitored by a photodiode as a function of time in a kinetic scan or as a function of the angle of incidence, in an angular scan The reflected intensity passes a sharp minimum at the angle at which resonance excitation of such a surface plasmon mode occurs The exact angular position of this resonance depends on the details of the interfacial architecture probed by the evanescent, ie exponentially decaying, plasmon field in the vicinity (L z ~ 150nm) of the metal/dielectric interface For instance, if the dielectric medium is an aqueous buffer the time-depen- Anzeige LABORWELT 4 Jahrgang Nr 3/

12 W I S S E N S C H A F T dent reflectivity change after injection of a protein solution is a measure for the layer formation by the binding of the proteins to their surface-attached ligands or to other (unspecific) binding sites This is the classical Kretschmann configuration, which is commercially implemented for label-free detection of binding reactions This measurement scheme, however, has limitations for very small analytes to be detected or in cases where only a very low surface coverage can be achieved In these cases the change in the surface plasmon resonance conditions, ie the resonance angle, is too small to be detected However, should the analyte carry a chromophore, ie a dye-labeled antibody, its binding to the sensor surface brings the chromophore into the strongly enhanced optical field of the surface plasmon mode The resulting fluorescence emission that can then be detected by either a photomultiplier tube in the case of a spectroscopic mode of operation 3 or Fig 2: The polymer brush architecture of the interfacial binding matrix at the surface of the sensor by a highly-sensitive CCD camera in the microscopic mode 4 allows for protein binding and dissociation studies with unprecedented sensitivity The Sensor Surface Fig 1: A Schematics of a surface plasmon spectrometer in the Kretschmann configuration extended by a photomultiplier tube (PT) or a CCD camera for fluorescence detection B Details of the flow cell attached to the prism coupler and the liquid handling system In a first set of experiments aiming at an optimized binding architecture, maximizing the fluorescence yield by placing the dye molecules attached to the analyte at a distance for which the quantum efficiency for surface plasmon field-enhanced fluorescence emission is near its optimum, and minimizing the loss of intensity by chromophores being quenched in the vicinity of the (acceptor states of the) metal substrates ie within the Förster radius for energy transfer, we used the commercial sensor chip C5 from Biacore mounted to our setup We coupled an antibody to the activated dextran matrix of the sensor chip (cf Fig 2) and monitored the increase of fluorescence intensity by the binding of a fluorescently labeled anti-igg directly 5 In a second set of sample preparations we used a streptavidin-based generic coupling strategy for generating a sensor array by the inkjet principle: we fabricated a 2x2 matrix of sensor spots 6 (each with ca 300 µm in diameter) by depositing small droplets of different antibody solutions onto a streptavidincoated substrate thus generating an array of sensing elements with different affinities able to bind dye-labeled IgGs injected into the flow cell Using the imaging mode of the surface-plasmon field-enhanced fluorescence detection scheme the parallel read-out of the multiple binding reactions to the various sensor spots could be monitored simultaneously, again online and in real time Limit of Detection for Antibody-Antibody Binding Figures 3A and B document the observed fluorescence intensity monitored in the spectroscopic mode with a photon-counting unit as a function of time after injection of the chromophre-labeled antibody solutions into the flow cell (cf Fig 1B for the continuous flow mode of the liquid handling system) Note that we are dealing with protein solutions of extremely low concentrations Hence, the observed kinetic behavior is totally mass transfer limited: the linear increase in the observed fluorescence intensity with time originates from dye-labeled antibodies diffusing from the bulk of the liquid cell to the interface and binding to the surface attached ligands, another antibody in this case The slope of the time-dependent fluorescence increase is a linear function of the injected protein concentration tested over more than 6 orders of magnitude This is summarized in Figure 3(C) After running the reaction for typically 30 min after each injection pure buffer was rinsed through the cell, which immediately stopped any further intensity increase Next the sensor surface was regenerated (all bound fluorescence-labeled antibodies were removed) by rinsing the cell with 10m Glycine solution (ph 17), and the next protein solution was injected As can be seen from Fig 3 the reproducibility for several fresh injections of the same protein concentration was excellent and a lower limit of detection was identified in the several hundred attomolar concentration range We should point out that the lower end of the detection for a 333 attomolar solution corresponds to an experimental situation in which 6 protein molecules per minute and mm 2 of the sensor surface are detected Surface Plasmon Fluorescence icroscopy in an Array Format In order to document the possibility for multiple parallel read-out of protein binding events to individual sensor spots in a matrix arrangement on the chip we present the fluorescence microscopic recording of the binding to an array exposing different antibodies as ligands of different affinities to the injected antibody solution In the example documented in Figure 4 we fabricated an array of 2x2 spots with each row of sensor elements being functionalized with a different antibody: the upper row exposes a biotinylated anti-hil8 antibody whereas the lower row has biotinylated anti-mouse antibodies, both systems coupled via biotin-streptavidin conjugation The first fluorescence microscopy picture was ta- Kennziffer 20 LW 03 wwwbiocomde 20 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

13 W I S S E N S C H A F T Fig 3: Protein binding assay in the mass transfer limited regime of low analyte concentrations Increase of fluorescence intensity after injection of anti-igg solutions of low concentrations (A, B) Note that A and B were recorded with different optical (attenuator) configurations C summarizes the slopes of the linear intensity increase after each protein injection taken from A and B Note the linearity of this calibration curve over 6 orders of magnitude ken 5 min after injection of a 30 nanomolar solution of fluorescently-labeled mouse-igg, whereas the second frame shows the fluorescence intensities after 1h of reaction time Conclusions The presented examples document that surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy results in a significantly improved limit of detection in protein binding assays This was possible by the concerted action of 3 factors: (1) the intrinsic sensitivity of fluorescence detection schemes, (2) the optical field enhancement at resonant excitation of surface plasmon modes, and (3) an optimized binding matrix at the sensor surface providing multiple binding sites for the analyte and taking care of the distance dependence of fluorescence emission of chromophores near metal surfaces This way, a few molecule detection limits could be reached The microscopic mode of surface plasmon fluorescence, in addition, will allow for a parallel detection of these binding events in an array format Contact Prof Dr Wolfgang Knoll ax-planck-institute for Polymer Research Ackermannweg 10 D ainz Tel / Fax:: +49-(0) / -360 eail: Figure 4: Surface plasmon fluorescence microscopic images taken from a 2x2 array of sensor spots functionalized with 2 different antibodies (ant-hil8 and anti-mouse) after injection of a 30 n solution of mouse-igg The left panel was taken after 5 min, the right panel after 1h References [1] Neumann, T; Johansson, L; Kambhampati, D; Knoll, W Surface- Plasmon Fluorescence Spectroscopy Advanced Functional aterials 12, (2002) [2] Knoll, W Interfaces and Thin Films as Seen by Bound Electromagnetic Waves Ann Rev Phys Chem 49, (1998) [3] Kambhampati, D; Nielsen, P E; Knoll, W Investigating the Kinetics of DNA-DNA and PNA-DNA Interactions Using Surface Plasmon Resonance- Enhanced Fluorescence Spectroscopy Biosensors and Bioelectronics 16, (2001) [4] Liebermann, T; Knoll, W Parallel ultispot Detection of Target Hybridization to Surface-Bound Probe Oligonucleotides of Different Base ismatch by Surface-Plasmon Field-Enhanced Fluorescence icroscopy Langmuir 19, (2003) [5] Yu, F; Yao, D; Knoll, W, Anal Chem 000, (2003) [6] Zizlsperger, ; Knoll, W ultispot Parallel On-line onitoring of Interfacial Binding Reactions by Surface Plasmon icroscopy Progress in Colloid & Polymer Science109, (1998) Anzeige LABORWELT 4 Jahrgang Nr 3/

14 B L I T Z L I C H T RNA Interference Real-Time-PCR for easuring Gene Silencing by RNAi Lee Honigberg, Stefany Snyder, Jill Spoerke, Celera Genomics, South San Francisco, USA; Kathleen Shelton, Applied Biosystems, Foster City, USA We have applied the recently discovered techniques for RNAi in mammalian cells 1 to generate knockdown reagents for a set of 50 genes In order to identify effective sirnas (>80% knockdown), we used Applied Biosystems Assays-on-Demand Gene-Expression products to quantify mrna levels We evaluated these predesigned Taqan reagents using a dilution series of cell line RNA and found that their sensitivity and reproducibility allowed reliable measurement of low transcript levels following knockdown Using Assays-On-Demand to measure knockdown, we tested candidate sirna sequences in batches of three per gene until a successful sirna was found For a subset of genes, a second potent sirna was generated to allow confirmation of phenotypic effects using two independent knockdown reagents One-tube Taqan Real-Time RT-PCR was performed using Amplitaq Gold and standard conditions in 25ul reactions on the SDS 7700 (Applied Biosystems) anually designed Taqan reagent sequences were chosen using a combination of Primer Express software and manual review to select at least one intronspanning primer Standard curves for Taqan validation were performed in duplicate using a 5-point dilution series from 50ng to 02 ng of total RNA from PC3 cells Taqan standard curve pass required R 2 > 098 and a slope in log 2 vs Ct plot between 09 and 12 sirna sequences were selected based on standard criteria 2 Some sequences were tested using in vitro transcribed sirnas (Ambion), but all Fig 1: Assays-on-Demand reagents use a quenched-fluorescence probe with inor Groove Binder (GB) GB increases T m and allows use of shorter probes data shown here are from chemically synthesized sirnas (Dharmacon and Xeragon) sir- NAs were transfected into PC3-cells at 100 n in serum containing media using sirna optimized transfection lipids (Ambion, Gene Therapy Systems, Invitrogen, irus, Novagen, Qbiogene or Stratagene) Transfections were performed in duplicate in 96-well plates and cells were harvested 48 hours after transfection One tenth of the RNA from each well was analyzed by Taqan and mrna levels for each gene were normalized to the amount of total RNA as measured by Ribogreen (olecular Probes) The amount of total RNA in each Taqan reaction was typically ng Treated cells were normalized relative to untreated control cells processed in parallel Anzeige 22 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

15 B L I T Z L I C H T Results anually Designed Probeset Applied Biosystems Assays-on-Demand Probeset Fig 2: anually designed Taqan reagents compared with Assays-On-Demand Taqan reagents Real-time RT-PCR amplification plots are shown for two genes using a dilution series ranging from 50 ng to 02 ng of total RNA A common problem encountered in mammalian cell RNAi is that not all sirnas work equally well for gene knockdown Real-time RT-PCR was used to allow screening of large numbers of sirnas for mrna knockdown In a comparison between manually designed Taqman reagents and Assays-On-Demand pre-designed Taqman reagents (Fig 1), we found that Assays-on-Demand reagents yielded greater absolute changes in fluorescence following amplification and produced more reproducible signals at later PCR cycles (Fig 2) Prior to screening for sirnas, Taqman reagents were validated using a dilution series of RNA Based on these experiments, we were able to use 65 out of 67 (97%) of the Assays-on-Demand reagents tested To screen candidate sirnas, we transfected them into PC3 tumor cells grown in 96- well format and measured mrna knockdown after 48 hours For each gene, three sirnas were tested at a time until a potent sirna was identified Sample screening data for eight genes is shown (Fig 3A) In total, we screened 356 sirnas against 64 genes The average number of sirnas screened in order to find one that induced >80% knockdown was 42 Effective sirnas for 50 genes were identified (Fig 3B) Thirteen sirnas from this group induced a particular cellular phenotype (not shown) and more sirna sequences for these genes were tested to find a second potent sirna Figure 3C shows sample Taqman quantitation for these 13 genes and illustrates knockdown with two independent sirnas and the absence of knockdown from a negative control scramble sirna Phenotypic assays were then tested for confirmation using these sirna pairs Conclusions Gene function experiments using RNAi demand careful control of a wide range of variables affecting transfection efficiency and subsequent phenotypic assays Having a rapid and quantitative measure for target gene mrna levels in each experiment allows successful optimization of a large number of experimental parameters Assays-on-Demand offer an easily accessible solution to the problem of finding high quality Taqan reagents for measuring gene knockdown References [1] Elbashir et al, Nature 411:494 [2] Contact Applied Biosystems/Applera Deutschland GmbH Frankfurter Str 129 B, Darmstadt Tel/Fax: +49 (0) / A B C Fig 3: (A) sirnas were screened using Assays-On-Demand to quantitate mrna levels Red arrows indicate identification of sirnas that yield >80% knockdown (B) Successful sirnas were identified for a set of 50 genes (C) A second sirna was identified for use in confirmation assays LABORWELT 4 Jahrgang Nr 3/

16 ARKTÜBERSICHT 1 Firmenanschrift/Ansprechpartner BioCat Gmb H Im Neuenheimer Feld 581 D Heidelberg Ansprechpartner Dr ichael Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwbiocatde Ehret BioCat GmbH Im Neuenheimer Feld 581 D Heidelberg Ansprechpartner Dr ichael Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwbiocatde Ehret Biomol GmbH Waidmannstr 35 D Hamburg Ansprechpartner: Frau Dr Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) (0) eail: wwwbiomolde Katja Jansen Biozym Diagnostik GmbH Postfach D Hessisch Oldendorf Ansprechpartner: Dr Bernhard Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwbiozymcom Nußbaumer Biozym Diagnostik GmbH Postfach D Hessisch Oldendorf Ansprechpartner: Dr Bernhard Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwbiozymcom Nußbaumer 2 Produkt/Linie r sifecto Transcription Factor sirna s s irna/sia B ( Dharmacon/Upstate urascrib e T ) D Epicentre T7-Transcription-Kit Technologies Corp vo T n mpliscribe T7-, T3-, und Transcription-Kits (Flash und von Epicentre Technologies A SP6 High Corp T - Yield) 3 Kurzbeschreibung/erkmale A T ransfektionsreagenz für sirn 25 verschiedene si-rna-oligos zum Knock - down von 25 verschiedenen spezifischen Transkriptionsfaktoren Kits: sirna-pools plus Kontroll-siRNA-Pool, mit Kontroll-Antikörper, Kontroll-Zellysat und Puffer in vitro T - ranscription-kit in vitro-transcription-kit s 4 Produktmerkmale s Liposomen-Kombination polykationischem Lipid L ipid, Lagerung bei 4 C au und neutralem E rzeugung von etwa 50 µ g 2 -Fluor - m odifizierter RNA (aus 1 µ g Template DNA), vollständig resistent gegen RNase A, stabiler in der Lagerung T A T - T n T d 5 sirna-bildung in vitro/in vivo d Für Primärzellen sirna-transfektion von Zellinien un In vitro synthetisierte sirna-oligos s irna-bildung in vitr o In vitro-transcription-kit für Sequenze n (dsoligos, Plasmide, PCR-Produkte) unter Kontrolle des T7-Promotors In vitro-transcription-kits unter Kontrolle des T7-, Promotors für 6 Für welche Organismen/Zelltypen n Säuger-und Insektenzelle Transfektion von Säugerzelle n Für ensche n Keine spezielle n Keine spezielle n 7 Validierter Knock-down (Welche Zellinie? Wieviel % K nock-down wird erreicht )? Keine Kein e 8 Angebotene RNAi-Dienstleistungen n Keine Angabe e Kein Kein e 9 Eigene Patente/ vorhandene Patentlizenzen P atente bei Dharmaco n U S Patente: 5,849,546 und 6,107,03 7 Keine eigenen Patente Für RNAi- Experimente gelten die Patente der Carnegie Institution of Washington, USA 1 0 Kundenservice a J Kein e Kein e 1 1 Extras/Besonderheiten e Oligos Durch 2 -ACE-Synthese sehr homogen mit urascribe T7 Transcription-Kit erzeug 2 Fluor-modifizierte RNA-Transkripte (vollständig resistent gegen RNase A) D T t mpliscribe T 7-Flas Transcription-Ki e rzeugt µ g RNA in 30 inute n A T T h t 1 2 Preis (Euro) - u ngelabelte sirna-oligos 2 -ACE-synthetisierte, aufgereinigte, deprotektierte, entsalzte, doppelsträngig annealte Oligos von 21 Basenpaaren Länge sowie UU-Überhang und 5 -Phosphat, ungelabelt, mit mind 50% mrna-knockdown Lagerung bei -20 C, 5 nmol + 1 nmo l (Kontrolle) Qualitätskontrolle: Duplexbildung Nondenaturing gel electrophoresis, asse ALDI-TOF-assen-Spektroskopie in vitro-transcription-kit zur Erzeugung von b is zu 180 µ g RNA mit dem AmpliScrib e 7-Flash -Transcription-Kit in 30 inute u nd bis zu 150 µ g RNA mit de n mpliscribe T7-, T3- und SP6-High Yiel Transcription-Kits in zwei Stunden (jeweils a us 1 µ g Template DNA ) Sequenzen und SP6- T3- A bhängig von transfizierter sirna s irna-oligos funktionell geteste t 97 % Wahrscheinlichkeit für 50% Knock - down 75 % Wahrscheinlichkeit für 95 % Knockdown Garantierter Knock-down: 50 % Knock-down oder mehr mit 100 n sirna, 24 h Inkubation Getestet und validiert in HeLa- und HEK293-Zellen hohe Knock-down-Quote durch SARTselection und SARTpooling, Kontroll-Antikörpern und Kontroll- Zellysaten von Upstate 175, g für 1 ml (mindestens 16 0 Transfektionen) 40,- g für 0,2 ml (mindestens 3 2 Transfektionen) 5 50,- g pro sirna-olig o 7 90, - g D urascrib e T7 Transcription-Kit R eaktionen): 619,- g (2 T 5 AmpliScribe T 7-Flas Transcription K it (50 Reaktionen): 279,- g AmpliScribe T7-, T3- und SP6 Hig Yiel d T ranscription-kit (50 Reaktionen): 245,- g T T h - T h 24 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

17 / ; R N A i - P R O D U K T E Firmenanschrift Ansprechpartner Cenix BioScience Pfotenhauerstrasse D Dresden GmbH 108 Dr Birte Sönnichsen Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwcenix-biosciencecom 2 Produkt/linie h 3 Kurzbeschreibung/erkmale d 4 Produktmerkmale - 5 sirna-bildung in vitro/ in vivo d 6 Organismen/Zelltypen l Validierter Knock-down Welche Zellinie? Wieviel % K nock-down wird erreicht ) Eigene Patente/vorhandene Patentlizenzen 1 0 Kundenservice d 1 2 Preis (Euro) d? IBA GmbH Rudolf-Wissell-Str D Göttingen 28 Ansprechpartner: Dr Kai Franke Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwiba-gocom T : T : antisense as sirna molecules N ot specifie Primarily used in vitr o Invitrogen Ltd Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley PA4 9RF, UK Ansprechpartner: Tom Klenka, PhD Tel , Fax eail: wwwinvitrogencom RNAi-based researc Custom dsrna-synthesis Transfection Reagent s service programmes (see 8) Reagents: (see 4) Not specifie ssrna and dsrna with al l Cationic lipid reagents f gene- modifications delivery in mammalian cells Reagents: human genome PAGE purified (>95 % purity) Lipofectamine 2000 wide library of optimized HPLC and PAGE quality Proprietary cationic lipid sirnas (soon available via controlled reagent designed for trans- Ambion Inc); optimized modifications: eg 2'-Amino, fection of nucleic acid sequen- sirnas for custom human 2'-Fluoro, 2'-O-ethyl, Inosine ces into mammalian cells; gene sets (soon available via dye Low toxicity, simple protocol Ambion Inc); labeled and efficient delivery of Drosophila genome-wide dsrna nmol nucleic acids in presence or library of optimized dsrnas absence of serum: ideal for (available now); C elegans high-throughput-screening of genome-wide library of opti- sequences in many cell and mized dsrnas (available now) tissue types; Effective gene silencing in many difficult to transfect cell types; Oligofectamine Proprietary lipid reagent; Exhibits superior comple- xing with short nucleic acid- sequences: for transfection of DNA-oligos as well Angebotene RNAi- Dienstleistungen C elegans, Drosophila, al All organisms / cell types All commonly used cell type s transfectable human cell lines and primary& neuronal cells any sirnas available via In-house data : Ambion will be validated to at CHO cells: 75 %, least 70 % knock-down within 293 cells: 90 %, 48 hours in HeLa cells BHK cells: 95% HT RNAi-based screening Non e for target gene discovery: Genome-wide or focused on spec groups of genes; In C elegans, Drosophila and mammalian cells; Use of synthetic dsrnas allows wide range of user-defined assays and cell lines; Online DB access: direct monitoring, annotation and web dissemination RNAi-based characterization of gene function/target validation: parallelized infra- structure; cross-genomic analysis of function (human, Drosophila, C elegans); readout assays and cell lines Custom Design of sirna libraries: Proprietary algorithms used for large scale N ot specified Both reagents are covere d under Invitrogen s Limited Use Label License Not specifie Production time: approx fiv e Extensive product citations in working days for dsrna online Cell Lines Database Not specifie On reques t Lipofectamin e ml, cat no , 2 99,- g 15 ml, cat no , 498- g Oligofectamine 1 ml cat n o , 343,- g T : T, Kennziffer 22 LW 03 Informationen ordern? wwwbiocomde Anzeige LABORWELT 4 Jahrgang Nr 3/

18 / : ARKTÜBERSICHT Kennziffer 23 LW 03 Informationen ordern? wwwbiocomde Firmenanschrift/Ansprechpartner irus Corporatio n 505 S Rosa Road, adison WI 53719, USA Ansprechpartner: Claire Ruzicka Tel: , Fax: wwwgenetransfercom wwwrnainterferencecom 2 Produkt/linie o RNA Interference Technologies Products in vivo sirna delivery, localization and and cells 3 Kurzbeschreibung/erkmale : sirna Delivery TransIT-TKO Transfection Reagent, single format for high-throughput applications High efficiency delivery and silencing in a Allows use of lower sirna-levels to achieve knock-down sirna Localization: and technologies for in vitr expression in mammalian tube or 96-well plate broad range of cell efficient expression types Label IT sirna Tracker-Kits: high efficiency labeling and tracking sirna in mammalian cells Available in a variety of non radioactive labels including Cy 3, Cy and Biotin sirna Expression: sixpress PCR Vector Systems, an alternative to using synthetic sirna PCR-based methods for generating the sirna transcript and transfecting into mammalian cells Ideal for generating and testing multiple sirna candidates 4 Produktmerkmale : Please see web site for complete wwwrnainterferencecom product information 5 sirna-bildung in vitro/in vivo s 5 of WG Biotech AG Anzinger Str 7a D Ebersberg, Ansprechpartner: Dr Volker Strack Tel +49-(0) Tech eail: wwwmwgdnacom Support: +49-(0) s irna H iscrib e WG-Biotech bietet in sirna-produktpalette Hierzu gehören in Kooperation patentierter custom sirna in verschiedenen control duplexes SARTpool sirna und sirray oligo sets mit Dharmacon Inc die komplette 2 -ACE Synthese-Technologie an Lieferoptionen 6 Für welche Organismen/Zelltypen s Validierter Knock-down (Welche Zellinie? Wieviel % K nock-down wird erreicht )? 8 Angebotene RNAi-Dienstleistungen s Eigene Patente/vorhandene Patentlizenzen 1 0 Kundenservice m A broad range of mammalian cells types including primary cell line Eine Vielzahl von Organismen und Zellinie n Jeder sirna SARTpool führt zu einem Knockdown von >50 % mit >999% Sicherheit und zu einem Knockdown von >95 % mit >75 % Sicherheit I n vitro and in vivo delivery services and product s irna-design auf Anfrag e P atents pending Alle WG RNA-Produkte: hergestellt mit Dharmacon 2 -AC E Technology, patentiert durch Dharmacon Research, Inc (Patent 5,889,136, 6,008,400 und 6,111, ACE, SARTpool a nd sirra eingetragenes Warenzeichen de Dharmacon Research, Inc Customer Technical Support: Support: 1 1 Extras/Besonderheiten t Promotional free poster on wwwrnainterferencecom sirna delivery 1 2 Preis (Euro) available Pricing will vary from country to country US list price is provided on the web site Distributor by list: request a T T Y r Nos o New England Biolabs GmbH Brüningstr 50, Geb G810 D Frankfurt/ Tel: +49-(0) eail: wwwneb-onlinede RNAi Transcription Kit (Art Nr #E2000 T ) Each kit contains sufficient reagents for synthesis of up to two mg of double-stranded RNA in a two ml reaction LITUS 28i cloning vector LITUS 38i cloning vector LITUS 28ial control plasmid T7 inimal Primer (19-mer), 5 -dtaatacgactcactatagg-3 10X Buffer/NTP mix 30X High olecular Weight (HW) Component ix T7 RNA Polymerase RNase-Free Water 6X SDS-Free Gel Loading Buffer 2-Log DNA Ladder (10010,000 bp) Complete protocols for cloning, in vitro-transcription and guidelines for RNAi in C elegans and cultured insect cells 24 h delivery service, toll free technical Complete system for in vitro-synthesis of large amounts of double- stranded RNA for RNAi-experiment traditional synthesis of single-stranded RNA (RNA structural studies, ribozyme biochemistry, in vitro-translation, RNA-protein interactions, antisense technology and aptamer discovery (SELEX) LITUS-cloning/bidirectional transcription vectors for all trans- cription applications (in vitro-microinjection, soaking and cell culture transfection) and in vivo- (worm feeding) RNAi-experiments) Custom sirna: versch Lieferoptionen (20 nmol bis 800 nmol), Geschützt o "ready to use", Einzel- o Doppelstrang, PAGE-gereinigt entsalzt odifikationen auf Anfrage Control Duplexes: definierte Sequenzen zur Kontrolle von Transfektionseffizienz und Inhibition sistarter: RNA-Interferenz-Einführungs-Kits SARTpools: Pool von vier sirna gegen definiertes Gen, Design mit Hilfe von 33 bioinformatorischen Kriterien garantiert 95 %-Hemmung des Gens bei 75 % aller SARTpools siarray: Themenspezifische SARTpool-Sets, zb "Insulin Signaling", "Tyrosine Kinases", "Cell Cycle" P roducts and technologies for both in vitro and in vivo approache Chemische Synthese Die patentierte 2 -ACE Synthese-Technologie ermöglicht die Herstellung von sirna in konstant hoher Qualität und hohen Ausbeuten Die 2 -ACE- geschützte sirna ist sehr stabil und leicht zu handhaben Die Entschützung erfolgt in 30 inuten in wäßrigem ilieu Bestellung über WG-eigenes Ecom-System (Custom sirna) oder per eail an (alle sirna-produkte) Weitere Infos (FAQs, TechBulletins, Publikationen) über wwwthe- WGcom A ngebot des Transfektionsreagenz TransIT - TKO von irus Corp RNAi applications for cultured insect or mammalian cells Processin g of in vitro- synthesized RNA by hydrolysis with Ecoli- Rnase III (NEB Art Nr #0244) renders dsrna to appropiate size for RNAi in most mammalian cell lines Custom sirna: ab 195- g Control Duplexes: ab 115- g SARTpools: ab 298- g 3 70,- g (Kit ) hotline 26 4 Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

19 ) R N A i - P R O D U K T E Firmenanschrift/Ansprechpartner Promega Gmb H Schildkrötstraße 15 D annheim Ansprechpartner: Tel: Produkt/linie e Dr Uwe ohr Fax: eail: wwwpromegacom ilentgen U6 Katalognummer s Cassette C7800 RNA Interference-System T, 3 Kurzbeschreibung/erkmale - Auf PCR und System für Transfektion U6-Casette Säugerzellen der DNA 4 Produktmerkmale a 5 sirna-bildung in vitro/in vivo o 6 Für welche Organismen/Zelltypen n Validierter Knock-down (Welche Zellinie? Wieviel % K nock-down wird erreicht ) Eigene Patente/vorhandene Patentlizenzen? basierendes in vivo-rnai Target-Gen-Supression nach QIAGEN GmbH Qiagen-Straße D Hilden 1 Ansprechpartner: Dr Constanze Kindler Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: wwwqiagencom Transfektions Reagenz: RNAiFect Transfection Reagent, (1ml), Katalognummer RNAiFect Transfection Reagent, (4x1ml), Katalognummer RNAiFect Transfection Reagent, (100ml), Katalognummer RNAi Starter Kit, Katalognummer RNAiFect Transfections Reagent: Speziell entwickelt für die Transfektion von sirna RNAi Starter Kit: Enthält RNAiFect Reagent, Lamin A/C sirna (5nmol), Non-silencing flourescein-labeled control sirna (5nmol) und ein ausführliches Handbuch Hohe Transfektionseffizienz bei minimaler Toxizität Geeignet zur Transfektion einer großen bandbreite verschiedener Zellen Einfaches und schnelles Protokoll Kein Serumwechsel nötig Transfektion in Gegenwart von Serum Endotoxin level <10 EU/ml Getestet auf die Abwesenheit von RNase-Aktivität QIAGEN GmbH Qiagen-Straße D Hilden 1 Ansprechpartner: Dr Bettina Tel: +49-(0) eail: wwwqiagencom öckel RNAx GmbH Breddiner Weg 5 D Berlin Ansprechpartner: Dr Jörg Tel: +49-(0) Fax: +49-(0) eail: Web: wwwrnaxde Pötzsch s irna-synthesis-service Automatisierte Validierung von sirnas und Targets mit Hilfe von RNA-Interferenz Custom sirna Libary sirna Cancer sirna Oligo Set (10) i n viv S äugerzelle Auf Anfrag e z B CHO, Hela 293, targetspezifisch, etwa 80 % System ist für die komplette outs im Labor konzipiert, nur Primer notwendig Knock- DNA- Durchführung von targetspezifischer Schnell, direkt und kostengünstig d kein RNA- oder Oligo-Handling und keine Klonierung notwendig; einfaches Arbeiten mit DNA Primern; wesentlich verlängerte Target-gene-supression im Vergleich zu RNA-Oligos und das System alle Komponenten für PCR Ansatz, PCR- Aufreinigung und Transfektion beinhaltet Aufreinigungsart: Custom sirna HPP Grade sirna, Affinitäts-Chromatographie >90 % rein Ultrapure sirna, HPLC, >97 % rein Crude sirna, 80 bis 85 % rein Libary sirna: Ultrapure sirna, HPLC, >97 % rein (zb negativ und positive Kontrollen sowie publizierte sirna Sequenzen) Cancer sirna Oligo Set (10): Je zwei sirnas für 139 Gene aus dem Bereich Krebs (Onkogene, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Kinasen, Tumor- Supressor-Gene ua) Qualititätskontrolle: HPLC / ALDI-TOF Angebotene odifizierungen: 3'-Fluorescein (6-FA), 5'-Fluorescein (6-FA) 3'-TARA (Rhodamine), 5'- TARA (Rhodamine) 5'-Hex, 5'-TET, 5'-Phosphate ua Angebotene engen in nmol: HPP Grade sirna (garantierte enge 20 nmol) HPP Grade sirna (garantierte enge 40 nmol) HPLC-purified sirna ( Synthese Scales 02 µ und 1 µ ) HPLC-purifie d s irna mit odifikationen (Synthese Scales 02 µ un d 1 µ Crude sirna (Synthese Scales 0 2 µ und 1 µ ) Weitere Synthese Scales auf Anfrage HP P Grade sirna auch im 96-well-Format erhältlich Angebotene RNAi- Dienstleistungen sirna Design-Service, sirna-transfektionsreagen z Automatisierte Validierung von sirnas und Targets mit p atent pending Patent RNA-Synthesechemie: US Patent 5,986,08 4 Co-exklusive Lizenz: US Pat Anmeldung 60/265232, 09/ und PCT/US01/10188 (RNA Sequence-Specific ediators of RNA Interference, D P Bartel, P A Sharp, T Tuschl und P D Zamore from IT) 1 0 Kundenservice e Individuelle technische Beratung call: +49-(0) Extras/Besonderheiten s 1 2 Preis (Euro) - vor Ort oder Arbeiten mit DNA, nicht mit RNA Oligo keine Klonierung notwendig keine Lizenzgebühren, da kein Patentkonflikt RNA-Oligo-knock-out-Anwendungen , g (Komplettpreis für System inkl Transfektions-Reagenz) via fre mit Service Hilfe Assays Technischer Service: +49-(0) Siehe 8 Online-Zell-Datenbank (wwwqiagencom/ transfectiontools enthält Ergebnisse von Kunden zur Transfektion verschiedenster Zellen und erlaubt Suche nach Zell-Typ, Nukleinsäure oder Transfektions-Typ arkteinführung am 15 Preise auf Anfrage Juni 2003, Kostenloses sirna-online-design-tool wwwqiagencom/sirna Bsp: HPP Grade sirna (garantierte 3 04,- g Weitere Infos auf Anfrage unter Ausbeute 20 nmol) von Validierungen Auf Anfrage RNA-Interferenz, erfolgen automatisierte im Hochdurchsatz Functional LABORWELT 4 Jahrgang Nr 3/

20 B L I T Z L I C H T Automation Neue öglichkeiten in der automatisierten Proteinanalytik Dr Carsten ang, Hamilton Life Science Robotics, Hamilton Bonaduz AG Nach der Entzifferung des menschlichen Genoms gilt das Interesse der Forschung nun dem Proteom der Gesamtzahl aller vorhandenen Proteine in einer Zelle, einem Organismus oder Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter bestimmten Bedingungen Hierbei interessieren neben der Identifizierung und Charakterisierung der Proteine auch die Struktur sowie die Wechselwirkungen von Proteinen miteinander und mit anderen organischen Verbindungen Um auch laborübergreifend reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es ein Ziel, alle arbeitsintensiven Schritte möglichst automatisiert zu erledigen Dieser Artikel beschreibt neue Wege zur Automation verschiedener ethoden der Proteinanalytik auf einer einzigen Geräte-Plattform Key Words: Proteomics, Proteinanalytik, Automation, In-Gel-Verdau, ALDI-Target-Spotting, Proteinkristallisation Der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen ist die Auftrennung des Proteoms mittels 2-D-Gelelektrophorese vorgeschaltet Dies ist die derzeit in der Proteomforschung meistgenutzte Trenntechnik, die von allen derzeit bekannten Verfahren, über die größte Trennkapazität verfügt ittels Imagingsystemen werden die angefärbten Gele fotografiert und anschließend Proteinspots von Interesse ausgestanzt und in ikrotiterplatten transferiert Den zeitaufwendigen In-Gel-Verdau und das Spotten der Proben auf ein ALDI-Target hat Hamilton auf der ICROLAB STAR-Plattform automatisiert (Abb 1) In-Gel-Verdau und ALDI-Target-Spotting Die ausgestanzten Gelstücke werden mit Wasser/Acetonitril gewaschen und anschließend die Proteine mit DTT bei 55 C reduziert und mit Iodacetamid im Dunkeln bei Raumtemperatur alkyliert Ein Verdampfen der Flüssigkeit während der Inkubationsschritte aus den Wells auf einen Temperatur-kontrollierten ikrotiterplattenträger wird mittels speziell entwickelter Deckel verhindert, die eine homogene Temperaturverteilung in Z-Richtung gewährleisten Nach weiteren Waschschritten werden die Proteine mit Trypsin verdaut und anschließend die erhaltenen Peptide extrahiert Ein unbeabsichtigtes Aufnehmen der Gelstücke ein immerwährendes Problem der Automatisierung des In-Gel-Verdaus wird durch aktive Kontrolle der Aspiration ( onitored Air Displacement ) mittels Druck-LLD und automatischem Fehlerhandling vermieden Sobald ein bestimmter Grenzwert des Drucksensors auf einem beliebigen Pipettierkanal unterschritten wird sobald also ein Gelstückchen den Tip blockiert, dispensiert dieser Kanal alles wieder im Freistrahlmodus in das Ursprungswell zurück und wiederholt mit diesem Kanal die Aspiration Der Peptidextrakt wird ankonzentriert und kann, falls gewünscht, über Zip-Tips entsalzt werden oder direkt auf speziellen ALDI- Targets gewaschen werden Dank Hamiltons patentierter CO-RE-Technologie kann die Pipettiergenauigkeit von 0,1mm entlang allen Achsen bis in die Tipspitzen übertragen werden Der Abstand des Tips zum ALDI-Target wird mittels kapazitiver LLD-essung aktiv bestimmt und gespeichert, so daß der Tip bei weiteren Waschschritten die Oberfläche des ALDI- Targets nicht wieder berührt Dadurch resultieren kleine Spotdurchmesser (ca 1 mm) und damit eine homogene Peptidverteilung im Spot (Abb 2) Verluste von bereits gespotteten Peptidproben bei weiteren Waschschritten auf dem Target durch anhaftende Peptid/atrixkristalle an der Tip- Spitze selbst können so vermieden werden Der ICROLAB STAR kann bis zu 768 Proteine in 20 Stunden enzymatisch verdauen und die Peptide anschließend auf das ALDI-Target spotten Automatisierung der Proteinkristallisation Abb 1: Der ICROLAB STAR-Pipettierroboter von HAILTON mit patentierter CO-RE-Technologie und onitored Air Displacement eine flexible einsetzbare Plattform, die für eine Vielzahl von Applikationen eingesetzt werden kann Eine Strategie, um 3-D-Strukturinformationen von Proteinen zu erhalten, ist die Kristallisation der Proteine in Gegenwart von Präzipitatlösungen und nachgeschalteter Röntgenstrukturanalyse Bei der Kristallisation verfolgt Hamilton zwei Ansätze: Es können fertig gemischte Präzipitatlösungen zum Screening diverser Bedingungen verwendet und anschließend die Bedingungen feiner abgestimmt werden (Abb 3) Werden Fertiglösungen eingesetzt, können die Deep-Well-Platten nach Verwendung mit einem Anti-Evaporationsdeckel abgedeckt werden, so daß sich die Zusammensetzung der fertigen Präzipitatlösung nicht durch Verdunsten verändert Die ikrotiterplatten werden zusammen mit dem Anti-Evaporationsdeckel durch den ICROLAB SWAP einen externen Greifer auf dem Deck des ICROLAB STAR plaziert Anschließend werden die Reservoir- Wells befüllt und danach 0,5 µl oder Jahrgang Nr 3/2003 LABORWELT

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