Technische Hinweise: Wieslab Funktionelle Komplement-Tests

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1 I 1 Technische Hinweise: Wieslab Funktionelle Komplement-Tests Testspezifikationen Kurzanleitung Ergebnis-Interpretation Präanalytik Fallstricke, Hinweise Forschungsmodifikationen Support

2 I 2 Funktionelle Komplement-Tests im ELISA-Format Die europäische Komplement-Gruppe

3 I 3 Euro Diagnostica Produkt-Portfolio Komplement

4 I 4 Technische Spezifikationen Komplement Classical Pathway Produktname Bestell-Nr. Format Wieslab Complement Classical Pathway COMPL CP310 / COMPL CP310 RUO ELISA, brechbare 96-well Platte (blau markiert) Aktivator-Beschichtung IgM (human) Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-/Aktivitäts-Kontrolle) Auswertung Qualitativ: Ratio (Probe- NC)/(PC - NC) x100 % oder quantitativ: 0 100% (6 Standards) Kontrollen 2 (NC, PC; plus Leerwert) Normbereich % (2s-Bereich von 120 Blutspendern) Probenmaterial, Menge Serum, 5 µl Vorverdünnung 1:101 Probenmenge 100 µl Substrat, Wellenlänge pnpp, 405 nm Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden Intraassay-Varianz 3% Automation Validierte Protokolle (Dynex) Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion Ref: E IFU WIESLAB Complement system, Classical Pathway

5 I 5 Kurzanleitung Komplement Classical Pathway Schritte Lösung Verdünnte Probe Leerwert / Standards, verdünnte Kontrollen In die Wells pipettieren 100 µl 100 µl min bei 37 C inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Enzym-Konjugat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Substrat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren Bei 405 nmmessen (direkt nach Ende der Inkubation) Ausführliche Anleitung in der Gebrauchsanweisung IFU E , WIESLAB Complement system, Classical Pathway

6 I 6 Verdünnungsreihe der rekonstituierten Positivkontrolle: Verwendung als Master-Standard für quant. Auswertung 100 % = Verdünnung 1/ µl PC 1000 µl Verdünnungspuffer 225 µl 100% 75 µl Verdünnungspuffer 150 µl 100% 150 µl Verdünnungspuffer 75 µl 100% 225 µl Verdünnungspuffer 40 µl 100% 280 µl Verdünnungspuffer 300 µl Verdünnungspuffer 75% 50% 25% 12,5% 0%

7 I 7 Technische Spezifikationen Komplement Alternative Pathway Produktname Bestell-Nr. Format Wieslab Complement Alternative Pathway COMPL AP330 / COMPL AP330 RUO ELISA, brechbare 96-well Platte (rot markiert) Aktivator-Beschichtung Lipopolysaccharid(LPS) Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle) Auswertung Qualitativ: (Probe- NC)/(PC - NC) x100 %(Ratio) Kontrollen 2 (plus Leerwert) Normbereich % (2s-Bereich von 120 Blutspendern) Probenmaterial, Menge Serum, 20 µl Vorverdünnung 1:18 (wichtig!) Probenmenge 100 µl Substrat, Wellenlänge pnpp, 405 nm Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden Intraassay-Varianz 7% Automation Validiert (Dynex) Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion Ref: E IFU WIESLAB Complement system, Alternative Pathway

8 I 8 Kurzanleitung Komplement Alternative Pathway Schritte Lösung Verdünnte Probe Leerwert / verdünnte Kontrollen In die Wells pipettieren 100 µl 100 µl min bei 37 C inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Enzym-Konjugat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Substrat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren Bei 405 nmmessen (direkt nach Ende der Inkubation) Ausführliche Anleitung in der Gebrauchsanweisung IFU E , WIESLAB Complement system, Alternative Pathway

9 I 9 Technische Spezifikationen Komplement MBL Pathway Produktname Bestell-Nr. Format Wieslab Complement MBL Pathway COMPL MP320 / COMPL MP320 RUO ELISA, brechbare 96-well Platte (grün markiert) Aktivator-Beschichtung Mannan Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle) Auswertung Qualitativ: (Probe- NC)/(PC - NC) x100 %(Ratio) Kontrollen 2 (plus Leerwert) Normbereich %(2s-Bereich von 120 Blutspendern); ND-Defekthäufigkeit 20-30% Probenmaterial, Menge Serum, 5 µl Vorverdünnung 1:101 Probenmenge 100 µl Substrat, Wellenlänge pnpp, 405 nm Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden Intraassay-Varianz 5% Automation Validiert (Dynex) Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion Ref: E IFU WIESLAB Complement system, MBL Pathway

10 I 10 Kurzanleitung Komplement MBL Pathway Schritte Verdünnte Proben 15 min (maximal 60 min) bei Raumtemperatur stehen lassen Lösung Verdünnte Probe Leerwert / verdünnte Kontrollen In die Wells pipettieren 100 µl 100 µl 60 min bei 37 C inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Enzym-Konjugat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Substrat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren Bei 405 nmmessen (direkt nach Ende der Inkubation) Ausführliche Anleitung in der Gebrauchsanweisung IFU E , WIESLAB Complement system, MBL Pathway

11 I 11 Technische Spezifikationen Komplement-System Screen (3 Wege) Produktname Bestell-Nr. Format Aktivator-Beschichtung Reagenzien Auswertung Kontrollen Normbereiche Wieslab Complement System screen COMPL 300 / COMPL 300 RUO ELISA, brechbare 4x8x3-well Platte CP blau, MPgrün, AP rot Separat mit IgM, Mannan, LPS Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle) Qualitativ: (Probe- NC)/(PC - NC) x100 %(Ratio) 2 (plus Leerwert) CP %, MP %, AP %(2s-Bereich von 120 Blutspendern) Probenmaterial, Menge Serum, 5 / 5 / 20 µl Vorverdünnung 1:101 / 1:101 / 1:18 Probenmenge 100 µl Substrat, Wellenlänge pnpp, 405 nm Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden 15 Minuten Intraassay-Varianz 3 / 5 / 7% Automation Validiert (Dynex) Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion Classical Pathway MBL Pathway Alternative Pathway A Dil CP P2 Dil MP P2 Dil AP P2 B Dil CP P2 Dil MP P2 Dil AP P2 C PC etc PC etc PC etc D PC PC PC E NC NC NC F NC NC NC G P1 P1 P1 H P1 P1 P1 Ref: E WIESLAB Complement system, Screen

12 I 12 Kurzanleitung Complement Screen (3 Wege) Schritte Nur die verdünnten Proben des MP 15 min(maximal 60 min) bei Raumtemperaturstehen lassen (mit dem Beginn von CP und AP warten) Lösung Verdünnte Probe Leerwert / alle drei verdünnten Kontrollen In die Wells pipettieren 100 µl 100 µl 60 min bei 37 C inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Enzym-Konjugat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren Die Wells dreimalmit 300 µl Waschpuffer waschen Zugeben Substrat 100 µl 100 µl 30 min bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren Bei 405 nmmessen (direkt nach Ende der Inkubation) Ausführliche Anleitung in der Gebrauchsanweisung IFU E , WIESLAB Complement system, Screen

13 I 13 Berechnungshilfe für die Anzahl an erzielbaren Testergebnissen pro Platte (96 wells) Funktioneller ELISA für den klassischen (CH50) Weg (COMPL CP310); gilt auch für die anderen Tests (alternativ, Lektin) Doppelbestimmungen (3 Kontrollen und Proben): Patienten -> 1 Ansatz mit 45 Proben, bis zu 12 Ansätze mit jeweils einer Patientenprobe Funktioneller Kombi-ELISA für alle drei Wege gleichzeitig (COMPL 300; 3x32) Doppelbestimmungen (3 Kontrollen und Proben): 13-4 Patienten -> 1 Ansatz mit 13 Proben, bis zu 4 Ansätze mit jeweils einer Patientenprobe

14 I 14 Normbereiche (Studie mit Erwachsenen) CP AP MP AP CP AP n Mittelwert (%) ±2 SD (%) Median (%) Klassischer Weg (CP) Alternativer Weg (AP) Lektin-Weg (MP) Ref: IFU E WIESLAB Complement system, Classical Pathway IFU E WIESLAB Complement system, Alternative Pathway IFU E WIESLAB Complement system, MBL Pathway

15 I 15 Interpretation des Testergebnisses A. NormalesErgebnisimReferenzbereich: Keine signifikante Komplement-Defizienz Achtung: Ein falsch-positives (normales) Ergebnis ist nicht möglich, aber ein falschesniedrigesresultatistsehrwohlmöglich(präanalytik)! Generell Anamnese beachten! B. Verminderte Aktivität: Gründe: - Verbrauch/Aktivierung von Komplement - Erbliche oder erworbene Komplement-Defizienz (insbesondere bei Werten 10%) - Unsachgemäße Handhabung der Probe (falsch-niedrig)! C. Erhöhte Aktivität: Unspezifische Entzündungsaktivität(Akute-Phase)

16 I 16 Interpretationshilfe

17 I 17 Interpretation der CP-Ergebnisse (quant./qual.) Normale Funktionalität Genetischer Defekt Verbrauch Starke Aktivierung oder vererbte Defizienz Aktivität (%) Ref: E IFU WIESLAB Complement system, Classical Pathway

18 I 18 InterpretationCP-Test: Vergleich qualitativ vs. quantitativ mit defizienten/depletierten Seren Aktivität (%) Quantitative Anwendung: Werte unter 15% Qualitative Anwendung: Werte über 5% Negative Kontroll-Ergebnisse: 5-8% Ref: Data on file

19 I 19 Test follow-up - Stufendiagnostik IMMERabnormaleErgebnissemiteinerneuenProbe gegentesten Wenn ein erneuter Test mit einer frischen Probe weiterhin ein abnormalesergebniszeigt: -> Verbrauch/Aktivierung oder Defizienz? WeitereUntersuchungenmüssenzeigen: Welche individuellen Komponenten fehlen? (Hinzufügen von vermuteten Einzelkomponenten und Test wiederholen) Autoantikörper gegen Komplement? Genetische Defizienz Primäre Defizienz? Mittleres Ergebnis > Aktivierungsmarker!?

20 20 Interpretation des System-Screen Tests für Defizienzen beteiligter Komponenten CP MP AP Mögliche Defizienz = = C1q, C1r, C1s = = Faktor B, Faktor D, Properdin = = MBL, MASP 2 = C4, C2 oder Kombinationen C3, C5, C6, C7, C8, C9

21 I 21 Stufendiagnostik Nach Nilsson, Clin Dev Imm 2012

22 I 22 Komplement: Probengewinnung/Präanalytik Normales Serum sollte aus Vollblut ohne Antikoagulantien gewonnen werden; mind min gerinnen lassen Kein Plasma für die funktionelle Komplement-Testung verwenden! Serum kannmaximal 24h beiraumtemperaturgelagertwerden; 48h gekühlt Zur Lagerung Aliquots einfrieren (empfohlen bei -70 C); Einfrieren und Auftauen vermeiden Qualitätssicherung: RingversuchsprobebeiINSTAND seit 2014 verfügbar(nr. 246)

23 I 23 Komplement: Proben-Stabilität/Lagerung Bei Raumtemperatur(RT) gelagert 24 Stunden: Ok 48 Stunden: Aktivitätsverlust von 15-20% 72 Stunden: Problematisch, da 40-80% Aktivitätsverlust Bei+4 0 C gelagert 48 Stunden: Ok 72 Stunden: Aktivitätsverlust von 10-20% Bei-20 0 C gelagert 1 Monat: Ok 2 Monate: Ok, Lektin-Weg beginnt an Aktivität zu verlieren 4 Monate: Probleme beginnen generell Bei-70 0 C gelagert Generell ok für längere Lagerung

24 I 24 Komplement: Erfahrungen mit Plasma 120 Mittelwert von 6 Proben (in %) Serum Heparin EDTA Citrate 20 0 CP MP AP

25 I 25 Komplement-ELISAs: Fallstricke, Hinweise Präanalytik beachten: Falsche Lagerung (Abbau der Komplement-Komponenten) führt zu falschnegativen Ergebnissen (Defizienz) 1. Inkubationsschritt bei 37 C Wichtig für korrekte Komplement-Aktivierung KeinenBrutschrank mit CO 2 verwenden! Sonst z. B. falsch-niedrige Ergebnisse für Lektin, Ficolin-3! Nur den jeweiligen Weg-spezifischen Probenverdünnungspuffer verwenden (Inhibition der anderen Wege) Achtung: Beim Alternativen Weg ist eine andere Verdünnungsstufe (1:18) nötig; strikt einhalten! Weitere Probenverdünnungen in der Regel nicht nötig, bzw. können die Ergebnisse (AP) verfälschen Nur die jeweilige Weg-spezifische Positiv-Kontrolle verwenden (siehe Beschriftung Fläschchen-Etikett), nicht in anderen Wegen einsetzen! Waschpuffer und Substrat sind in allen Komplement-Kits identisch; Konjugat bedingt (lot-spezifisch)

26 I 26 Hinweise zur Lagerung der Positiv- und Aktivitäts-Kontrolle Achtung:Beim Versand befinden sich Kit-Box und die separate Schachtel für die Kontrollen gemeinsam in einer Plastiktüte. Diese wird ungekühlt verschickt. Nach Erhalt die Kit-Box bei 2-8 C lagern und die Schachtel mit den lyophilisiertenkontrollen bei -20 C sofort einfrieren. Die Lagerung der lyophilisiertenkontrollen bei Raumtemperatur ist bis zu einer Woche ok. Ein versehentliches Einfrieren des gesamten Kits bei -20 C oder sogar -80 C führt zu keiner Beeinträchtigung der Ergebnisse. Nach dem Auflösen des Lyophilisatssind die Kontrollen bei -20 C mind. 32 Wochen, bei -70 C mind. 52 Wochen stabil. Nicht mehrmals auftauen und wieder einfrieren; nach dem Auflösen portioniert wegfrieren! Die Positiv-Kontrolle ist nicht Kit-Lot-spezifisch; das standardisierte Material aus einem Pool von definierten Normalspendern kann separat bestellt werden. Positiv-, Negativ-und Aktivitätskontrollen werden wie die Patientenproben in der jeweiligen Weg-spezifischen Verdünnung im Test eingesetzt.

27 I 27 Komplement: Spezifische Probenvorbereitung (Puffer) CP MP AP Beschichtung IgM Mannan LPS Probenpuffer Ca/Mg Ca/Mg Mg/EGTA +CP-Inhibitor Verdünnung 1/101 1/101 1/18 Vor-Inkubation min RT

28 I 28 Robustes Testsystem: Optionen zu Modifikationen bei Forschungsanwendungen Geeignet für die Testung von Inhibitoren der Komplement-Funktion: Die Positiv-Kontrolle kann z.b. als standardisiertes Normalspender Kontroll-Material verwendet werden Hinweis: Bei Titrationen von Substanzen den potentiellen Stör-Einfluss von Ionen oder ph in Relation auf den Standardansatz des Wieslab ELISA- Systems (Serum!) kontrollieren Bei vermuteter Defizienz einer Komplement-Komponente kann durch Zugabe der selbigen die Annahme geprüft werden: Mögliches Testdesign: Das funktionelle Protein in der für Normalspender üblichen Konzentration zugeben(z.b. in drei verschiedenen Konzentrationenwie: niedriger, gleich, höher), einpaarstundenbei4 C inkubieren, dann das Serum mit und ohne vermutetem Defekt-Protein im entsprechendenwieslab Kit messen

29 I 29 Kreuzreaktivität der funktionellen Tests für andere Spezies Schweine-Proben sind verwendbar; um Faktor 10 weniger verdünnen(salvesen et al, 2009; persönlichemitteilungm. Huber-Lang 2015) Proben von Cynomolgus-Affen und Hunden reagieren kreuz (interne Informationen) Nicht einsetzbar für Ratten, Mäuse, Meerschweinchen

30 I 30 Ergebnisse von Forschungsuntersuchungen der Pädiatrischen Nephrologie, Universität Freiburg: Einflüsse von Pufferbedingungen auf den Alternativen Weg Mit freundlicher Genehmigung von St. Michelfelder, 2015

31 I 31 Informative Website Übersicht Diagnostik Therapie Support: Technische Informationen Videos Fallbeispiele Literatur Webinar Kongress-Teilnahmen

32 I 32 Bei Fragen, können Sie uns gerne über kontaktieren Öresund-Brücke (Malmö-Kopenhagen)

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